水缸評分法：可靠的大鼠脊髓損傷后運動功能評定方法

張 鈺，洪淑娥，劉家明，劉志禮，肖世寧，顏金祥，周 揚

1南昌大學第一附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌 330006；2南昌大學脊柱脊髓研究所，江西 南昌330006

盡管神經醫(yī)學近年發(fā)展突飛猛進，但是脊髓損傷（SCI）仍是青年人致殘的主要原因［1］。因此，如何改善脊髓損傷后運動功能的恢復仍是神經醫(yī)學的研究熱點［2-4］。目前，脊髓損傷基礎研究最常用的為SD大鼠的SCI模型［5］，準確、客觀的運動功能評價方法對于大鼠SCI后恢復程度的判斷具有重要意義。

目前常用的評估大鼠SCI后運動功能恢復的方法有神經電生理［6,7］和BBB評分量表［8,9］。神經電生理評價具有客觀性和準確性，易于定量分析。運動誘發(fā)電位（MEP）潛伏期具有良好的穩(wěn)定性，能夠準確、客觀地判斷大鼠SCI 后的嚴重程度，可作為一種金標準去評估神經損傷的程度［10-12］。但是由于神經電生理檢測儀器昂貴以及熟練掌握其測量方法需要一定的學習曲線，其普及性欠佳。BBB評分由于其簡易操作，其評估標準包括許多評定細節(jié)和特征說明，分級較細致，在大鼠SCI研究中被廣泛應用［13-15］。然而，作者在對SCI大鼠的BBB評分過程中，發(fā)現BBB評分存在主觀性較強，且在SCI大鼠恢復的早期（BBB評分量表中小于等于7分），其髖、膝及踝關節(jié)的活動不易觀察等問題［16-18］。

因此，本研究利用SD大鼠在水中恐懼而激發(fā)其運動潛能，同時水中浮力減輕其臀部部分重力對后肢的壓迫，使其后肢關節(jié)更易驅動且易于被觀察的特點。將SCI大鼠放置于自制單通道透明水缸來評估大鼠脊髓損傷后的運動功能恢復情況，旨在提出一種新的脊髓損傷后運動功能評估方法，以便更加客觀、準確地評估脊髓損傷大鼠的運動功能恢復情況。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

36只8周SPF級雌性SD大鼠（天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXΚ（湘）2019-0014），體質量200～220 g。大鼠飼養(yǎng)于具有獨立換氣系統(tǒng)的清潔籠內，動物房溫度控制為22～25 ℃，濕度55%，保持光照規(guī)律變化。本實驗過程中，所有動物的處理均符合動物倫理學標準（動物倫理號：CDYFY-IACUC-202207QR001）。

1.2 分組及造模

1.2.1 實驗分組 實驗前對所選大鼠進行常規(guī)行為能力測試，確保其運動功能正常。36 只大鼠經適應性飼養(yǎng)1 周后，采用數字表法將大鼠隨機分為脊髓損傷組和假手術組，18只/組。

1.2.2 模型的建立 脊髓損傷組大鼠術前常規(guī)禁食，自由飲水。全部18 只大鼠在椎板切除后，Allen打擊法［19］制備大鼠脊髓損傷模型：異氟烷全身麻醉滿意后，大鼠取俯臥位固定于手術臺上。無菌操作下于背側入路暴露脊髓T10節(jié)段，用直徑3 mm的10 g鐵棒下落打擊裝置造成脊髓輕中度損傷（打擊力量為15 g·cm）。假手術組大鼠僅暴露脊髓，不給予外力打擊，并常規(guī)縫合。術后護理：SCI 大鼠模型建立后，控制環(huán)境溫度在22～25 ℃；每2只大鼠1籠喂養(yǎng)，保持飼養(yǎng)籠墊料干燥、清潔；3次/d協(xié)助排尿，直到反射性膀胱排空形成，以及用干燥毛巾擦干被尿液浸濕的肢體及會陰部；術后常規(guī)每日10萬單位青霉素肌注預防感染；術后皮下注射葡萄糖液5 mL，連續(xù)3 d，預防失血性休克及補充能量。

1.3 功能評價

1.3.1 兩種脊髓損傷評分方法

1.3.1.1 水缸評分法 將待觀察大鼠放入盛有5 cm深度溫水的自制單通道透明水缸中，觀察者從自制單通道透明水缸側面觀察大鼠后肢的活動，每只大鼠在單通道水缸內通過全程路線3 次，并觀察其關節(jié)活動、承重步態(tài)、運動協(xié)調性進行綜合評分。具體評分細則同BBB評分［20］：大鼠后肢功能評分為0～21分，正常大鼠為21分。自制單通道透明水缸（國家專利號：202121952501.1）：包括底部控溫裝置，可保證水溫維持在38 ℃，水缸長150 cm，內槽寬度為10 cm，可以很好保證大鼠在其中沒有擁擠感，但不能自由轉身。使用時，其水深以剛好達到被觀察大鼠的下頜，約5 cm。水缸周邊玻璃有一定的放大設計，保證觀察者從側面可清楚的觀察到大鼠后肢的活動，水缸尾部為黑色物包裹封閉設計，因大鼠喜黑，可誘導大鼠向前爬行（圖1、2）。

圖1 自制水缸的構造及其應用方法Fig.1 Construction of the self-designed water tank and its application.A: Schematic diagram of the self-designed water tank.B:Lateral view of a rat crawling in the water tank.The water level in the tank is below the jaw of the rat so that the activity of the hind limbs can be clearly observed.C: Top view of the rat in the tank,which is confined to crawl forward in the water tank.

1.3.1.2 BBB評分法［20］大鼠于曠場自由爬行，觀察其運動4 min，每只觀測3次。兩種脊髓損傷評分方法的評分者為2名經過培訓了解評分標準的非該實驗人員，評分采用雙人獨立觀察，最后結果為兩位觀察者的平均記錄分數（圖2）。兩組大鼠在術后1、3、5、7、14、21 d，6個時間點均采用兩種不同的脊髓損傷評分方法進行評分。

圖2 水缸評分法與BBB評分法評分時SCI大鼠后肢活動觀察的對比Fig.2 Assessment of hindlimb activity of SCI rats using water tank scoring and BBB scoring.A:The water tank scoring method,in which the activity of the hind limb of the rats can be clearly observed in the tank.B: BBB scoring method,in which the movement of the hind limb of SCI rats on the ground is relatively difficult for observation.

1.3.2 運動誘發(fā)電位（MEP）應用NIM-ECLIPSE生物信號處理系統(tǒng)（Medtronic,Inc.USA），刺激電極：分別置于大鼠頭顱中線皮下和硬腭黏膜下。記錄電極：分別置于后肢腓腸肌與跟腱處。大鼠大腦皮層接受刺激后，同時可以在下肢肌肉記錄到MEP。兩組大鼠在術前，術后1、3、5、7、14、21 d 檢測大鼠MEP評估脊髓損傷恢復程度。

大鼠晝夜活動差別較大，所有評分及檢測均固定于每個時間點晚上19點進行。評價前所有大鼠人工排除膀胱尿液，以免因膀胱充盈而影響大鼠活動。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 25.0 進行數據處理，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗。正態(tài)分布資料采用Pearson相關分析，非正態(tài)分布資料采用Spearson相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠SCI造模術后一般情況

大鼠SCI造模術后1 h基本清醒，假手術組大鼠后肢關節(jié)可自由活動，自主飲水、飲食。脊髓損傷組大鼠表現為截癱，兩個前肢可爬行運動，但后肢和尾部無活動，出現尿潴留、腹脹等典型SCI表現。假手術組大鼠術后1 d其后肢肌力基本恢復正常，后肢協(xié)調性較好。脊髓損傷組大鼠主要靠前肢爬行移動，腹部貼地，雙足底向上。所有大鼠切口均愈合良好，定期進行水缸評分方法評分的同時，予以水浴清潔護理會陰部。所有SCI組大鼠均無傷口及泌尿系感染跡象。但由于缺乏后肢活動，SCI組大鼠后肢較假手術組出現一定程度的肌肉萎縮。在整個實驗過程中，因各種原因（如麻醉意外、咬傷、尿路感染、傷口感染、擠尿導致膀胱破裂等）而死亡的大鼠共1 只（其中假手術組0只，脊髓損傷組1 只：同籠大鼠打斗，咬開背部傷口致死），總死亡率為2.78%。實驗過程中意外死亡大鼠及時補充，以確保每組大鼠數量與計劃一致。

2.2 兩種不同脊髓損傷評分法評分結果對比

脊髓損傷前所有大鼠使用水缸評分法和BBB評分法評分均為21分。

水缸評分法：SCI組大鼠傷后1 d均為0分；損傷后3 d 開始有下肢恢復跡象為0.22±0.43分，傷后前2周恢復較快，大鼠SCI后5、7、14 d評分分別為0.67±0.49分、4.33±1.19 分、8.61±1.20 分，運動評分顯著增高（P＜0.05）；第21天達到14.78±1.06分，已可自主爬行，但是精細動作欠佳（表1、圖3）。

表1 兩種評分方法評分結果對比Tab.1 Comparison of the results of the two scoring methods(Mean±SD)

BBB 評分法：SCI 組大鼠在術后1、3 d 使用傳統(tǒng)BBB 評分均為0 分；損傷后5 d 地面曠場評分僅為0.11±0.32分；損傷后7、14 d評分顯著增高（P＜0.05），第21天達到14.5±1.47分，可觀察到大鼠后肢自主運動爬行，但是精細動作欠佳（表1、圖3）。

與BBB評分法相比，水缸評分法在造模后第3天開始評分更高，并在造模后第5、7、14天評分顯著高于BBB評分法評分結果（P＜0.01，圖3）。造模后14 d大鼠后肢功能逐步恢復，兩種評分方法分值差距縮小，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 大鼠MEP潛伏期監(jiān)測結果

大鼠SCI后MEP潛伏期延長，波幅明顯減小，SCI術后1 d潛伏期長達8.06±0.22 ms，隨著時間的延長，潛伏期逐漸縮短，波幅逐漸增加，SCI術后14 d潛伏期縮短為6.29±0.34 ms，術后1、3、5、7、14 d脊髓損傷潛伏期均低于假手術組潛伏期（P＜0.01）。21 d后接近正常水平為5.87±0.28 ms（表2、圖4）。

表2 兩組大鼠各時間點MEP潛伏期測量結果Tab.2 Results of MEP latency measurements at different time points after SCI in the two groups(ms,Mean±SD)

圖4 神經電生理監(jiān)測結果圖Fig.4 Electrophysiological monitoring results.A:MEP latency in normal rats(about 5.7 ms).B:The latency is significantly prolonged and the wave amplitude is significantly reduced at the initial stage of SCI,indicating that the motor pathway of the lower limbs is damaged.C:The MEP latency decreases over time while the wave amplitude gradually increases,indicating gradual recovery of the motor pathway of the lower limbs.

2.4 兩種不同脊髓損傷評分法與MEP潛伏期的相關性分析

兩種脊髓損傷評分方法得分與MEP 潛伏期均呈負相關（P＜0.01）。但水缸評分法與電生理MEP潛伏期的相關系數（r=-0.90）高于BBB評分法得分與電生理MEP潛伏期的相關系數（r=-0.86）。

3 討論

建立一個客觀、準確的大鼠SCI 動物模型后肢功能評價方法，對于大鼠SCI損傷程度、恢復過程及干預措施的效果的評價非常關鍵［21-23］。電生理是目前較為準確、客觀的檢測手段［24］，但其普及率不高。BBB評分法［20］是可簡易評估大鼠后肢運動情況的一種方法，也是目前評價大鼠SCI后功能恢復的最常用評分標準［25-27］。BBB評分分值越高，表明后肢運動功能恢復越好。其中0～7分屬于恢復的早期階段；8～13分進入恢復中期；14～21分階段代表大鼠精細運動恢復時期。而實際上，SCI大鼠早、中期評分時，SCI大鼠因后肢癱瘓，活動減少，并且其臀部因重力作用壓住無力后肢，使得其后肢即使有微弱的肌力恢復也無法活動其髖、膝、踝關節(jié)，從而導致觀察者無法準確、客觀的的判斷其下肢功能恢復情況。

本研究設計水缸評分方法進行評分：由于水的浮力抵消了SCI大鼠部分自身重力，即使微弱肌力恢復也可驅動下肢髖、膝、踝關節(jié)的活動，并且通過盛水玻璃的局部放大作用，大鼠下肢活動可被早期發(fā)現。此外，正常大鼠放入盛水水缸內，表現為有意高抬后肢動作，表現出一定的恐水性。因此，大鼠SCI后早、中期后肢活動能力得到激發(fā)，且水中浮力的存在使得SCI大鼠后肢活動更容易被觀察者捕獲，從而提高了該評分方法的準確性和敏感性。

本實驗結果顯示，水缸評分法和BBB評分法評分均能反映SCI 后大鼠后肢功能恢復過程，體現SCI后神經恢復的程度。但水缸評分法得分在SCI術后第5、7、14天均顯著高于傳統(tǒng)BBB評分。術后第5～14天，損傷大鼠下肢逐漸恢復運動，在自制水缸內觀察評分，早、中期大鼠后肢尚不明顯的屈伸活動更容易被觀察者捕獲。這可能是由于輕、中度脊髓損傷的在傷后第5天，開始有一定的下肢運動恢復。但是由于恢復早期，臀部的壓迫影響了下肢的活動，導致兩種評分方法有顯著差異。傷后14～21 d兩種評分方法無明顯差異。這可能是由于SCI術后14 d脊髓損傷大鼠下肢肌力逐漸恢復，以至于可逐步承重爬行，并且傳統(tǒng)BBB評分方法已經可以很好的觀察大鼠后肢活動情況。因此，傷后14 d以上，兩種評分方法沒有明顯差異。本研究使用的大鼠脊髓損傷模型為輕度損傷模型，因此在術后21 d BBB評分可達到14.50±1.47分，而馬善峰等［28］在大鼠脊髓損傷術后6周評分僅為11.50±0.93分，這可能是由于不同研究需要和不同造模儀器參數導致的大鼠SCI程度不一致，但是本研究中使用同一批大鼠進行不同評分方法進行評分，評分方法結果差異的比較不受大鼠SCI程度影響。

進一步，本研究分析了兩種脊髓損傷下肢功能評分法與神經電生理檢測結果的相關性。神經電生理檢測可較為客觀的反映脊髓功能，在神經中樞、神經傳導通路和效應器（肌肉）上，可以記錄到特定位相的電變化，能夠反映神經系統(tǒng)一定部位的功能狀態(tài)［28］。本研究結果顯示：水缸評分方法得分與MEP 潛伏期數值的相關性更高，高于傳統(tǒng)BBB評分得分與MEP 潛伏期數值的相關系數（r=-0.90，r=-0.86）。有研究在進行大鼠脊髓損傷功能評價的研究中指出MEP與BBB評分有較好的相關性［10］，這與本研究結論一致。伊超凡等［16］研究表明脊髓在受到損傷時，其MEP潛伏期顯著延長、波幅顯著下降，且脊髓在受到重度損傷時，會出現波形明顯變異，無法確認，因此本研究選擇輕度損傷，從而更好的檢測MEP的潛伏期。因此，本研究結果可以表明：水缸評分方法的評分結果與電生理定量數值具有更好的相關性，得出的評分更加客觀、準確。

綜上所述，水缸評分方法與BBB評分法相比，能夠在大鼠SCI早期更客觀、準確的反映脊髓損傷后的功能恢復過程。本研究結果為大鼠急性脊髓損傷模型后肢功能恢復的一種可靠的評估方法。