白兔局部動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊對其余血管斑塊形成的影響

陸 琦，鮑迎春，陳旭姣，王春明

1寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 寧波 315040；2寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院東部院區(qū)特檢科，浙江 寧波315048

眾所周知，動脈粥樣硬化（AS）以動脈管壁脂質(zhì)沉積所致血管管壁增厚變硬、管腔縮小為主要特征，其作為腦卒中、主動脈夾層、冠心病等眾多心血管疾病發(fā)生的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，是導(dǎo)致心血管疾病患者死亡的主要原因［1-4］。因此，對動脈粥樣硬化斑塊形成機(jī)制的研究顯得尤為重要。由于AS發(fā)病與年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、高血脂、肥胖等多種因素有關(guān)，當(dāng)前對動脈粥樣硬化斑塊形成機(jī)制的研究大多著眼于血脂、血糖等外周循環(huán)血中的各種危險因素對動脈內(nèi)膜的影響［5-7］，但是動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊對外周其他血管的斑塊形成或者加重造成影響的作用機(jī)制仍有待研究。因此，本研究選用技術(shù)較為成熟且公認(rèn)較為有效的球囊損傷術(shù)聯(lián)合高脂喂養(yǎng)來建立動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊模型，探討局部動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊對其余動脈粥樣硬化斑塊形成的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性成年新西蘭白兔30只，體質(zhì)量2.0～3.0 kg。購買、飼養(yǎng)于寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，所有兔子均按普通級標(biāo)準(zhǔn)單籠飼養(yǎng)，正常光照，提供足夠的食物和水，總共飼養(yǎng)12周。本研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)，且本研究動物實(shí)驗(yàn)遵循中國動物護(hù)理和機(jī)構(gòu)倫理指導(dǎo)方針。

1.1.2 主要材料和試劑 高脂飼料（含1%膽固醇、6%豬油、10%蛋黃粉及83%基礎(chǔ)飼料，購自南京索菲特飼料有限公司）；無水乙醇（華東醫(yī)藥股份有限公司）；福爾馬林（湖北秦康醫(yī)療設(shè)備有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液（Hyclone）；蘇木精-伊紅染色（HE）染色液（上海譜振生物科技有限公司）；慶大霉素（哈藥集團(tuán)制藥總廠）；青霉素哈藥集團(tuán)制藥總廠）；高密度膽固醇（HDL-C）測定試劑盒（吉斯生物科技有限公司）；低密度膽固醇（LDL-C）測定試劑盒、超敏C反應(yīng)蛋白（CRP）測定試劑盒、總膽固醇（TC）測定試劑盒、甘油三酯（TG）測定試劑盒（吉斯生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及取材 所有新西蘭白兔按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，10只/組。實(shí)驗(yàn)組和對照組予以高脂飼料喂養(yǎng)，空白組予以普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組兔子高脂喂養(yǎng)4周后，行單側(cè)頸動脈球囊損傷手術(shù)。之后各組均按照原先計(jì)劃喂養(yǎng)至12周，采靜脈血后處死，取頸動脈、腹主動脈進(jìn)行病理組織學(xué)檢測，采集兔耳緣靜脈的靜脈血，分離血漿測定血脂和CRP。

1.2.2 頸動脈球囊損傷術(shù) 用球囊損傷頸總動脈手術(shù)具體步驟：經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥麻醉兔子，每公斤體質(zhì)量1 mL，手術(shù)臺上固定兔子頸部，除凈頸部兔毛后先用手術(shù)刀切開頸部皮膚，用止血鉗一層層仔細(xì)分離組織和血管，將周圍結(jié)締組織、脂肪組織與頸總動脈、頸內(nèi)動脈相互分離，各分支血管分別用血管鉗結(jié)扎，用眼科剪在頸總動脈上切開一小口，插入球囊，用注射器注入空氣以擴(kuò)張球囊，來回推拉3次，然后抽出球囊并縫合傷口，松開血管夾，觀察兔子無出血后仔細(xì)縫合皮膚切口，并于兔子大腿肌肉注射100萬單位青霉素注射液預(yù)防感染。

1.2.3 組織病理學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)第12周末，將各組兔子全部處死，于麻醉狀態(tài)下離取雙側(cè)頸動脈以及腹主動脈3～4 cm。用生理鹽水沖洗并簡單處理外膜脂肪組織后，置于福爾馬林溶液中固定24 h，然后進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯清除，嵌入石蠟，切成5 μm的切片，冷卻后，切片用蘇木精染色4 min，并在室溫下用鹽酸酒精分化數(shù)秒。隨后將切片置于蒸餾水中一段時間，依次用70%乙醇和90%乙醇脫水。然后，將切片在室溫下用伊紅染色2 min，進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯清洗。用中性密封膠封片后，在光學(xué)顯微鏡（THUNDER Imager，德國Leica）下觀察組織形態(tài)學(xué)改變并拍照。

1.2.4 血脂及CRP檢測 各組第12周末處死之前，均通過經(jīng)耳緣靜脈采血的方法抽取空腹血。將獲得的血液液標(biāo)本離心后靜置取血漿，用全自動生化分析儀檢測TG、TC、LDL-C、HDL-C以及CRP水平，相關(guān)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本研究所有計(jì)量數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS16.0 以及EXCEL 統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。三組之間比較運(yùn)用單因素方差分析進(jìn)行分析比較，以P＜0.05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況

在12周的動物建模實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)2例術(shù)后感染，及時采取局部注射青霉素以及酒精消毒等措施后好轉(zhuǎn)，至12周末各組均無死亡。4周末、8周末、12周末時，實(shí)驗(yàn)組、對照組體質(zhì)量較0周時明顯升高（P＜0.05），空白組體質(zhì)量較0周時無明顯差異（P＞0.05），且空白組體質(zhì)量明顯低于實(shí)驗(yàn)組、對照組（P＜0.05），對照組間體質(zhì)量比較無明顯差異（P＞0.05，表1）。

表1 各組實(shí)驗(yàn)動物體質(zhì)量表Tab.1 Body weight changes in the 4 groups at different time points(kg)

2.2 蘇木素-伊紅染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)12周末，將各兔子全部處死后采集雙側(cè)頸動脈以及腹主動脈進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)組頸動脈以及腹主動脈有明顯動脈粥樣通硬化斑塊形成，有串珠樣改變，彈性也較其余兩組血管差，血管內(nèi)面解剖亦可見明顯動脈粥樣硬化形成。顯微鏡下的動脈粥樣硬化斑塊纖維帽薄，脂質(zhì)核大，且部分斑塊已出現(xiàn)出血、破裂甚至血栓形成，是典型的動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊。同時，實(shí)驗(yàn)組頸動脈以及腹主動脈存在各種程度的管腔狹窄以及內(nèi)中膜增生，顯微鏡下可見血管內(nèi)大量平滑肌細(xì)胞增生并向內(nèi)膜方向遷移，內(nèi)含膽固醇的泡沫細(xì)胞堆積在在血管內(nèi)膜下面，雙側(cè)頸動脈以及腹主動脈均可見血管彈力板走行紊亂（圖1～3）。對照組血管外觀和顯微鏡下結(jié)構(gòu)大體與實(shí)驗(yàn)組血管類似，可見血管內(nèi)膜輕度增生，但是各血管中膜無增生，同時，對照組各血管亦未見血管內(nèi)脂質(zhì)沉積，亦無明顯粥樣斑塊形成，（圖4、5）?？瞻捉M頸動脈以及腹主動脈外表光滑有彈性，顯微鏡下解剖血管內(nèi)表面也光滑平整，血管內(nèi)膜及中膜無明顯增生，各動脈內(nèi)彈力板清晰完整，顯微鏡下平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，血管內(nèi)無脂質(zhì)沉積，且無明顯動脈粥樣斑塊形成（圖6、7）。

圖1 12周實(shí)驗(yàn)組損傷側(cè)頸動脈Fig.1 Injured carotid artery in atherosclerosis model group at 12 weeks(HE staining,original magnification:×200).

圖2 12周實(shí)驗(yàn)組對側(cè)頸動脈Fig.2 Contralateral carotid artery in atherosclerosis model group at 12 weeks(HE staining,×200).

圖3 12周實(shí)驗(yàn)組腹主動脈Fig.3 Abdominal aorta in atherosclerosis model group at 12 weeks(HE staining,×200).

圖4 12周對照組頸動脈Fig.4 Carotid artery in atherosclerosis model group at 12 weeks(HE staining,×200).

圖5 12周對照組腹主動脈Fig.5 Abdominal aorta in high-fat feeding group at 12 weeks(HE staining,×200).

圖6 12周空白組頸動脈Fig.6 Carotid artery in normal chow feeding (blank control)group at 12 weeks(HE staining,×200).

2.3 組織病理學(xué)評估

經(jīng)過12周的喂養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組可見手術(shù)側(cè)頸動脈、對側(cè)頸動脈、腹主動脈均有明顯動脈粥樣硬化斑塊形成，對照組與空白組各部位血管均無明顯動脈粥樣硬化斑塊形成。實(shí)驗(yàn)組平均內(nèi)膜厚度明顯大于對照組、空白組（P＜0.05），且實(shí)驗(yàn)組手術(shù)側(cè)頸動脈平均內(nèi)膜厚度、斑塊面積與管腔面積明顯大于對側(cè)頸動脈、腹主動脈（P＜0.05，表2）。

表2 12周各組各部位血管病理結(jié)果Tab.2 Pathological results of blood vessels in each group at 12 weeks

圖7 12周空白組腹主動脈Fig.7 Abdominal aorta in blank control group at 12 weeks(HE staining,×200).

2.4 血脂檢測結(jié)果

12周末時，實(shí)驗(yàn)組、對照組TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP水平明顯高于空白組（P＜0.05），且對照組間TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP水平比較無明顯差異（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組CRP水平明顯高于對照組（P＜0.05，表3）。

表3 12周末各組血脂水平Tab.3 Blood lipid and CRP levels in the 3 groups at 12 weeks

3 討論

目前，冠心病已成為當(dāng)今世界最重要的死亡因素，而動脈粥樣硬化斑塊作為心血管疾病的基礎(chǔ)病變在冠心病等心血管疾病中發(fā)揮著重要作用［8-12］。除動脈粥樣硬化斑塊的解剖生理學(xué)特征之外，斑塊的不穩(wěn)定性是引起臨床后遺癥的最主要因素［13-18］。動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊一般有以下特點(diǎn)：低密度脂蛋白填充的泡沫細(xì)胞組成的大脂質(zhì)核、薄纖維帽、大量炎癥細(xì)胞浸潤、新生的血管以及外向重塑［19-23］。盡管關(guān)于動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊已有較多研究，但是動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂釋放的物質(zhì)是否會作用于外周的大血管動脈粥樣硬化的形成仍有待研究，本實(shí)驗(yàn)即想通過動物建模的方法驗(yàn)證這個猜想。

本研究實(shí)驗(yàn)組和對照組予以高脂飼料喂養(yǎng)，空白組予以普通飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)4周后，對實(shí)驗(yàn)組的兔子通過球囊損傷術(shù)進(jìn)行動脈粥樣硬化建模，而后進(jìn)行一般情況觀察，取頸動脈、腹主動脈進(jìn)行病理組織學(xué)檢測，結(jié)果顯示，4周末、8周末、12周末時，空白組體質(zhì)量明顯低于實(shí)驗(yàn)組、對照組，對照組間體質(zhì)量比較無明顯差異；12周末時，實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組的各部位動脈從外觀及內(nèi)面解剖可見明顯動脈粥樣硬化斑塊形成及內(nèi)膜增生，有串珠樣改變。對照組可見血管內(nèi)膜輕度增生，無明顯粥樣斑塊形成。空白組血管內(nèi)膜及中膜無明顯增生，無明顯動脈粥樣斑塊形成。實(shí)驗(yàn)組平均內(nèi)膜厚度明顯大于對照組、空白組，且實(shí)驗(yàn)組手術(shù)側(cè)頸動脈平均內(nèi)膜厚度、斑塊面積與管腔面積明顯大于對側(cè)頸動脈、腹主動脈；說明局部動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊可促進(jìn)其余動脈粥樣硬化斑塊的形成。

CRP是人體肝臟合成的時相蛋白，其水平增加，可上調(diào)下游白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8等炎癥因子的活性，促進(jìn)低密度脂蛋白對于血管內(nèi)皮的侵襲，進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮，使血管黏附因子表達(dá)增加，動脈硬化斑塊破裂，導(dǎo)致局部血栓形成［24-27］。除此之外，機(jī)體血脂水平升高亦是動脈粥樣硬化斑塊形成的重要原因［28-30］。為進(jìn)一步研究局部動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊促進(jìn)其余動脈粥樣硬化斑塊形成的機(jī)制，本研究檢測12 周末各組TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP水平，結(jié)果顯示，12周末時，實(shí)驗(yàn)組、對照組TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP水平明顯高于空白組，且對照組間TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP水平比較無明顯差異，實(shí)驗(yàn)組CRP水平明顯高于對照組，說明局部動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊可通過升高機(jī)體CRP水平，促進(jìn)其余動脈粥樣硬化斑塊的形成。

綜述所述，局部動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊可促進(jìn)其余動脈粥樣硬化斑塊的形成，主要通過上調(diào)機(jī)體CRP水平發(fā)揮作用?？蔀閯用}粥樣硬化的研究和臨床治療提出了一個嶄新的方向。