紫草素通過抑制PKM2/PHD3/HIF-11α通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡

張換換，陳 卓，趙想弟，霍 強(qiáng)，程 秀

安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蚌埠233030

肝細(xì)胞癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。根據(jù)全球流行病學(xué)數(shù)據(jù)，肝癌的發(fā)病率和死亡率分別位于癌癥的第6位和第3位，是2022年中國(guó)診斷的5大癌癥類型之一［1,2］。目前，肝癌治療的方式眾多，諸如外科手術(shù)切除、放療、化療和分子靶向治療等［3,4］。然而，肝細(xì)胞癌患者5年生存率依舊非常低，現(xiàn)有的治療方法其效果仍然較差［5］。大量的研究已經(jīng)證明了植物藥在癌癥治療中的有用性［6,7］，其治療亮點(diǎn)在于不僅可以協(xié)同發(fā)揮最大功效和減輕副作用，還能通過多種途徑作用于腫瘤細(xì)胞，這些優(yōu)勢(shì)使植物藥能夠以整體的方式引起癌細(xì)胞死亡［8］。紫草素是一種從中藥紫草中提取出來的天然的紅色萘醌化合物，具有多種藥理活性，對(duì)多種癌癥有明顯的抑制作用。其作用方式可通過多靶點(diǎn)多途徑抑制腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，如通過Wnt/βcatenin、PI3Κ/Akt/mTOR/PTEN、p38-MAPΚ、Bcl-2/Bax、ROS/HIF-1α、STAT3、RIPΚ1/RIPΚ3、PΚM2 等誘導(dǎo)凋亡和其他類型的程序性細(xì)胞死亡［9］。

丙酮酸酶（PΚ）家族由PΚL 基因編碼的PΚL 和PΚR亞型及PΚM基因編碼的PΚM1和PΚM2亞型組成［10］。PΚM1主要在心肌，大腦，骨骼肌等需要能量供應(yīng)的組織中存在，PΚM2在增殖細(xì)胞如胚胎發(fā)育過程中的組織及多種癌癥細(xì)胞中過度表達(dá)［11,12］。PΚM2以活性四聚體和非活性二聚體兩種形式存在，以四聚體的結(jié)構(gòu)發(fā)揮丙酮酸激酶的作用催化有氧糖酵解的最后一步，在細(xì)胞核中以二聚體的形式發(fā)揮蛋白激酶的作用調(diào)控基因的表達(dá)［13］。PΚM2通過促進(jìn)有氧糖酵解和增強(qiáng)癌蛋白的活性從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［14］，并且在肝癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)［15］，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起著重要的作用。研究表明PΚM2通過多種途徑影響著肝癌的進(jìn)展［16-18］，研究證實(shí)PΚM2基因的敲除導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡，這是由于PΚM2下調(diào)可以抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［19］。以上文獻(xiàn)研究表明PΚM2在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡中發(fā)揮著極其重要的作用，因此，本研究擬以一個(gè)新的途徑進(jìn)一步闡明PΚM2在肝癌細(xì)胞死亡中的作用機(jī)制。

缺氧是腫瘤微環(huán)境的主要特征之一，其誘導(dǎo)血管生成因子，趨化因子和生物活性介質(zhì)的大量產(chǎn)生，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［20］。HIF-1α是一種氧敏感蛋白，在缺氧環(huán)境中積累調(diào)節(jié)癌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［21］。在癌癥代謝中，HIF-1α與缺氧反應(yīng)元件（HRE）基因結(jié)合激活包括PΚM2在內(nèi)的糖酵解酶的轉(zhuǎn)錄，核PΚM2作為一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，促進(jìn)HIF-1α依賴的糖酵解重編程［22,23］，這種相互作用促進(jìn)了由HIF-1α調(diào)節(jié)的靶基因的反式激活［24］。PΚM2與HIF-1α相互作用，這一過程需要PHD3的介導(dǎo)，PHD3是一種細(xì)胞氧傳感器，其結(jié)合P303/408處的PΚM2使其羥基化后形成PΚM2/PHD3復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核幫助HIF-1α和P300在HRE基因處形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體激活轉(zhuǎn)錄功能［25］，并且PHD3也是HIF-1α轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之一［26］。PΚM2/PHD3/HIF-1α三者形成一個(gè)環(huán)狀反饋調(diào)節(jié)在癌細(xì)胞的代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用［27］，但具體作用機(jī)制仍不清楚。

紫草素可通過多種途徑導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的死亡，但其能否通過PΚM2/PHD3/HIF-1α這個(gè)信號(hào)通路誘發(fā)肝癌SMMC-7721細(xì)胞死亡尚未見報(bào)道，因此本研究旨在探討紫草素能否通過靶向PΚM2 或直接調(diào)控PΚM2/PHD3/HIF-1α信號(hào)通路介導(dǎo)肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡，以期為臨床診治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

紫草素、二甲基亞砜（DMSO）（麥克林）；Opti-MEM、RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco）；胰酶細(xì)胞消化液、PBS、RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDSPAGE凝膠試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒、4%多聚甲醛通用型組織固定液、Loading Buffer（碧云天）；免疫沉淀試劑盒（海貍）；山羊抗兔Alexa Fluor 594、山羊抗小鼠Alexa Fluor 488（北京博爾邁）；乳酸檢測(cè)試劑盒（南京建成）；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒（貝博）；Lipofectamine 2000（Invitrogen）；qRT-PCR試劑盒（全式金）；siRNA、引物（滁州通用生物）；二抗：山羊抗小鼠、山羊抗小鼠，Hoechst33258（Biosharp）；一抗：PΚM2、Bcl-2、caspase-3、Bax（Proteintech），HIF-1α、PHD3（abcam）；人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞（上海中橋新舟）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和1.5%青霉素鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞和L-02細(xì)胞分別以5000/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，給予不同的紫草素濃度處理細(xì)胞20 h后每孔加入10 μL MTT，于培養(yǎng)箱放置4 h后吸出液體，加入200 μLDMSO，震板10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A490nm。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣約20 μg開始電泳（70 V電泳30 min后轉(zhuǎn)為100 V電泳90 min），結(jié)束后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（200 mA轉(zhuǎn)印120 min），快速封閉液封閉30 min，于PHD3，PΚM2和HIF-1α相應(yīng)的一抗中4 ℃孵育過夜后，在對(duì)應(yīng)二抗中室溫孵育2 h，將PVDF膜置入ECL發(fā)光液中，成像顯影。

1.2.4 乳酸含量檢測(cè) 配置乳酸檢測(cè)相關(guān)試劑，人肝癌SMMC-7721細(xì)胞給藥24 h后，提取上清液制作待測(cè)樣本，選擇測(cè)定絕對(duì)吸光度值（測(cè)定吸光度值-空白吸光度值）在0.05～0.35的濃度為最佳取樣濃度。樣本加入酶工作液1 mL，顯色劑0.2 mL，混勻后37 ℃水浴反應(yīng)10 min，各加入終止液2 mL。紫外分光光度計(jì)在1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值A(chǔ)530nm。

1.2.5 ATP含量檢測(cè) 按5×104/孔接種在六孔板中，給藥24 h后，吸除培養(yǎng)基，加入試劑盒中的裂解液裂解細(xì)胞后離心取上清液測(cè)定。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度配平樣品濃度，后95 ℃煮2 min 以充分釋放ATP。多功能酶標(biāo)儀測(cè)量RLU 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ATP含量。

1.2.6 免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn) 將3×104人肝癌SMMC-7721細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿培養(yǎng)至貼壁，空白培養(yǎng)基和紫草素給藥后培養(yǎng)細(xì)胞24 h。用1 mL 4%甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，200 μL 0.5%甲醇通透15 min，500 μL 5%BSA室溫封閉30 min，然后加入混合稀釋的PΚM2和PHD3一抗100 μL，4 ℃孵育過夜。加入100 μL相對(duì)應(yīng)的混合熒光二抗室溫避光孵育1 h，最后加入200 μL 核染色劑Hoechst 33258室溫避光孵育30 min。PBS清洗后加1 mL PBS用蔡司顯微鏡觀察拍攝。

1.2.7 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，加入結(jié)合緩沖液和1 mmol/L的蛋白酶抑制劑冰上裂解10 min，離心收集上清即抗原樣品。將免疫沉淀磁珠用結(jié)合緩沖液洗滌兩次進(jìn)行磁性分離，加入抗體工作液與磁珠室溫反應(yīng)15 min進(jìn)行磁性分離，得到磁珠-抗體復(fù)合物。磁珠抗體復(fù)合物中加入抗原樣品于4 ℃反應(yīng)過夜，加入結(jié)合緩沖液洗滌并轉(zhuǎn)移至新的EP管中進(jìn)行磁性分離得到磁珠-抗體-抗原復(fù)合物。后加入1×SDS-PAGE Loading Buffer 95 ℃加熱5 min，執(zhí)行磁性分離收集上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.8 Annexin V/PI雙染實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞給藥處理24 h后，用不含EDTA的胰酶消化處理，1500 r/min離心5 min，棄去上清，細(xì)胞沉淀中加入400 μLAnnexin-V結(jié)合液和5 μL Annexin V-FITC 染液，避光冰浴15 min，后加入10 μL PI 染液立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.9 siRNA干擾實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞5×105/孔接種到6孔板中，加入空白培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，分別用250 μL Opti-MEM 稀釋siRNA 和Lipofectamine 2000 室溫靜置5 min，然后將稀釋的siRNA 和Lipofectamine 2000 混合室溫靜置20 min。最后將500 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到六孔板中并加入1.5 mL空白培養(yǎng)基，4～6 h后換成正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后用于實(shí)驗(yàn)。PΚM2的siRNA序列為：5'-3':CCAUAAUCG UCCUCACCAAUU。

1.2.10 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，加Trizol 于冰上裂解提取RNA。根據(jù)試劑盒提供方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后進(jìn)行定量PCR。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示（圖1），在紫草素處理24 h后肝癌SMMC-7721 細(xì)胞活性呈劑量依賴性降低（IC50=8.041 μmol/L），而正常肝細(xì)胞L-02的活性變化不明顯（IC50=31.75 μmol/L）。

圖1 紫草素抑制肝癌細(xì)胞活力Fig.1 Shikonin inhibits viability of SMMC-7721 cells.

2.2 紫草素抑制SMMC-7721細(xì)胞有氧糖酵解

細(xì)胞經(jīng)紫草素處理后，檢測(cè)細(xì)胞中糖酵解產(chǎn)物乳酸和ATP含量的變化，乳酸和ATP含量均呈紫草素濃度依賴性降低（圖2），同時(shí)糖酵解蛋白PΚM2、HIF-1α表達(dá)也受到抑制（圖3A）。

圖2 紫草素抑制SMMC-7721細(xì)胞有氧糖酵解Fig.2 Shikonin inhibited aerobic glycolysis in SMMC-7721 cells.A: Effect of shikonin on Lactate in the cells.B:Effect of shikonin on ATP in the cells.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group.

2.3 紫草素靶向PΚM2抑制HIF-1α和PHD3蛋白表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示細(xì)胞給予紫草素處理后，PΚM2和HIF-1α蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低，并且在細(xì)胞核中表達(dá)量也降低（圖3A）。此外，PHD3蛋白的表達(dá)也呈紫草素濃度依賴性降低（圖3B）。PΚM2表達(dá)敲低后Western blot結(jié)果顯示PΚM2蛋白表達(dá)隨著siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增高而降低，表明轉(zhuǎn)染成功（圖3C），qRT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了在SMMC-7721細(xì)胞中PΚM2基因沉默的成功構(gòu)建（圖3D）。在PΚM2基因敲低后，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與未構(gòu)建低表達(dá)細(xì)胞相比PHD3和HIF-1α蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì)（圖3E）。

圖3 紫草素靶向PΚM2抑制HIF-1α和PHD3蛋白表達(dá)Fig.3 Shikonin inhibits the expression of HIF-1α and PHD3 proteins by targeting PKM2.A: Expression of HIF-1α and PKM2 in the cytoplasm and nucleus measured by Western blotting.B: Expression of PHD3 detected by Western blotting.C: Expression of PKM2 detected by Western blotting in cells transfected with PKM2 siRNA.D:PKM2 mRNA level measured using qRT-PCR.E:Expression of PHD3 and HIF-1α detected by Western blotting in cells with PKM2 knockdown.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group.

2.4 紫草素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中PΚM2與PHD3復(fù)合物的影響

通過免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PΚM2與PHD3蛋白在紫草素處理后二者相互作用的變化，發(fā)現(xiàn)隨著紫草素給藥濃度的增加PHD3 和PΚM2熒光強(qiáng)度變?nèi)?，并且抑制了PΚM2的核易位（圖4A），PHD3與PΚM2在紫草素給藥下均降解，這與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致（圖3A、B）。此外，由圖4A結(jié)果顯示紫草素抑制了PΚM2與PHD3的共定位，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論（圖4B）。

圖4 紫草素破壞PΚM2和PHD3的相互作用Fig.4 Shikonin impairs the interaction between PKM2 and PHD3.A: Immunofluorescence assay showing that shikonin (4 μmol/L) suppresses the co-localization of PKM2/PHD3 in SMMC-7721 cells (Original magnification,×200).B: Interaction between PHD3 and PKM2 detected by immunoprecipitation assay in SMMC-7721 cells treated with shikonin(4 μmol/L)for 24 h.*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group.

2.5 紫草素誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡

紫草素給藥24 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，圖5A可見細(xì)胞凋亡水平隨紫草素濃度依賴性增高，并且凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低（圖5B）。

圖5 紫草素誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡Fig.5 Shikonin induces apoptosis of SMMC-7721 cells.A: Apoptosis of SMMC-7721 cells assessed using annexinV-FITC/PI staining.B: Expressions of Bcl-2,Bax,and cleaved caspase-3 detected by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group.

3 討論

迄今為止，肝癌仍然是一個(gè)全球性的健康挑戰(zhàn)，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增長(zhǎng)［28］，嚴(yán)重威脅人們健康，對(duì)肝癌藥物治療的相關(guān)研究一直是醫(yī)學(xué)科研的熱點(diǎn)。紫草素是一種天然化合物，具有多種生物活性，在抗癌、抗菌、抗炎等方面均有報(bào)道［29-31］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們用不同濃度的紫草素處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L-02發(fā)現(xiàn)紫草素顯著抑制了肝癌細(xì)胞活力，而對(duì)正常肝細(xì)胞無明顯影響。研究表明紫草素可以通過HIF-1α/PΚM2信號(hào)通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［32］，HIF-1α活性與細(xì)胞凋亡減少有關(guān)，PΚM2和PHD3的相互作用影響著HIF-1α的轉(zhuǎn)錄［33］。研究發(fā)現(xiàn)，在用紫草素處理后，SMMC-7721細(xì)胞呈一個(gè)濃度依賴性的方式發(fā)生凋亡且凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示紫草素造成細(xì)胞凋亡的同時(shí)抑制了PΚM2、PHD3、HIF-1α 三個(gè)蛋白的表達(dá)，且PΚM2與PHD3結(jié)合作用降低，PΚM2與HIF-1α蛋白易位到細(xì)胞核減少。因此，我們猜測(cè)紫草素可能通過破壞PΚM2/PHD3的作用，影響HIF-1α的轉(zhuǎn)錄從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。王和楚等人發(fā)現(xiàn)PHD3 的表達(dá)與HIF-1α和PΚM2的表達(dá)呈相反的趨勢(shì)影響癌細(xì)胞活性［34,35］，這與紫草素抑制了HIF-1α、PHD3和PΚM2的表達(dá)同時(shí)影響凋亡相矛盾，因PΚM2是紫草素的靶蛋白猜測(cè)紫草素可能通過靶向PΚM2影響PHD3和HIF-1α的表達(dá)，為驗(yàn)證這一猜想，檢測(cè)了PΚM2敲低后PHD3和HIF-1α的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，和未敲低組相比PHD3和HIF-1α的表達(dá)明顯降低。

在腫瘤生長(zhǎng)過程中，會(huì)因其增生過快而導(dǎo)致局部組織缺氧，此時(shí)HIF-1α能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞發(fā)生適應(yīng)性改變，包括改變細(xì)胞的供能方式，從線粒體氧化磷酸化過渡到有氧糖酵解［36］，從而減弱缺氧損傷和減少凋亡［37］。PHD3在糖酵解過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)PHD3的敲低能降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1，乳酸脫氫酶A和丙酮酸脫氫酶激酶1的表達(dá)及葡萄糖的攝取與乳酸的產(chǎn)生，并增加氧氣消耗［38］。此外，PΚM2作為糖酵解過程的關(guān)鍵酶之一，其與HIF-1α、PHD3之間相互作用，維持糖酵解穩(wěn)定供能［25］。紫草素作為一種天然化合物是公認(rèn)的PΚM2抑制劑［39］，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明在紫草素處理24 h后，破壞了PΚM2和PHD3之間相互作用，PHD3、PΚM2和HIF-1α蛋白表達(dá)水平降低且ATP和乳酸含量明顯下降，表明紫草素通過PΚM2/PHD3/HIF-1α信號(hào)通路調(diào)節(jié)SMMC-7721細(xì)胞的有氧糖酵解。這跟羅等人的研究［25］，PHD3促進(jìn)PΚM2對(duì)HIF-1α反轉(zhuǎn)錄激活和重編程腫瘤細(xì)胞中的葡萄糖代謝相一致。

綜上所述，有氧糖酵解和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖凋亡有著密不可分的聯(lián)系，PΚM2、PHD3和HIF-1α三者相互作用形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的糖酵解和凋亡。綜上所述，紫草素可能通過PΚM2 介導(dǎo)PΚM2/PHD3/HIF-1α信號(hào)通路影響肝癌SMMC-7721細(xì)胞的代謝和凋亡。