登革病毒-2感染人臍靜脈內皮細胞的磷酸化蛋白質組學分析

胡 盼，程 瑤，王遠迎，茍小琴，劉 華，左 麗，吳 寧

貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院1生物化學與分子生物學教研室，2實驗教學中心，3免疫教研室，貴州 貴陽550004

登革病毒（DENV）是黃病毒科的RNA病毒，可編碼膜蛋白（prM）、包膜蛋白（E）和衣殼蛋白（C）3種結構蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和NS5七種非結構蛋白［1］。DENV 可分為4 種血清型，即DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4［2］，其中DENV-2是最主要的血清型［3］。DENV主要在伊蚊居住的地區(qū)快速傳播，可引起輕度癥狀的登革熱（DF）或嚴重的登革出血熱（DHF）甚至是危及生命的登革休克綜合征（DSS）［4-6］。據(jù)估計，有36億人口居住在DF傳播風險的區(qū)域，其中我國有將近28個省份受到DF的威脅［7］，主要區(qū)域為西南和東南沿海地區(qū)以及海南省。2014年廣東地區(qū)DENV 感染數(shù)是2013 年感染的10 倍，累計報告DENV感染數(shù)高達四千多例，死亡病例6例［8］。兒童和青少年受病毒感染病例呈指數(shù)增長［9］。據(jù)WHO統(tǒng)計，截止2019年DF被認為是威脅全球健康的十大因素之一。

DENV 感染是一個極其復雜的過程，目前認為DENV發(fā)病機制與抗體依賴增強作用（ADE）、非結構蛋白1（NS1）病毒抗原、登革病毒基因組變異和亞基因組RNA等相關［10］。但目前對DENV的感染機制尚存在爭議，由于感染機制的不明，因此仍然沒有有效疫苗可用，雖然已有登革熱疫苗正在被研發(fā)，但目前并沒有疫苗或藥物被FDA認可［11-14］。

蛋白質組學在多種疾病和病毒的研究中被廣泛運用，而磷酸化修飾是研究最廣泛的翻譯后修飾，在蛋白質的激活和失活、調節(jié)信號轉導、粘附和細胞通訊中發(fā)揮作用［15］。因此，通過磷酸化TMT 蛋白質組學探究DENV-2感染HUVEC過程中磷酸化蛋白質可能的調控機制，對DENV-2的發(fā)病機制研究具有重要意義。本研究采用TMT定量磷酸化蛋白質組學，利用相關生物信息學分析手段，為DENV-2的致病機制研究提供了新的見解。

1 材料和方法

1.1 細胞

HUVEC、C6/36和DENV-2 NGC株均由實驗室常規(guī)保存。

1.2 材料與儀器

ECM 培養(yǎng)基（Sciencell）；ECGS（Sciencell）；FBS（Sciencell）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco）；p-AΚT1（Abcam），p-JUN（Abcam），p-MEΚ2（Abclonal），β-actin（Abclonal）。

數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海天能）；超凈工作臺（蘇州佳寶凈化工程設備有限公司）；SDS-Acryl/Bis蛋白電泳儀（上海天能）。

1.3 HUVEC細胞和C6/36細胞的培養(yǎng)

取液氮保存的HUVEC和C6/36，置于37 ℃水浴鍋中快速融化，再將細胞分別轉移至盛有5 mL ECM完全培養(yǎng)基（10%FBS，1%ECGS，1%P/S）的培養(yǎng)瓶和5 mL 1640完全培養(yǎng)基（10%FBS，1%P/S）的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁。直到細胞生長至90%融合度時，加入適量0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化，1000 r/min，10 min 收集細胞，重懸后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 DENV-2的擴增、鑒定與毒力測定

1.4.1 DENV-2的擴增 待C6/36細胞長成90%左右融合。棄去細胞培養(yǎng)液后加入DENV-2毒液500 μL，置于28 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，搖晃1次/15 min，去掉毒液后用Hanks液洗滌2次，加入5 mL 2%維持液（2%FBS，1%P/S）置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察現(xiàn)象，若出現(xiàn)明顯細胞病變現(xiàn)象即空泡拉絲，即可收集毒液。收毒：將細胞培養(yǎng)瓶置于-80 ℃中，流水沖淋手搖至沙冰狀，重復3次。液體收集于離心管中，2000 r/min，離心10 min，收集上清分裝于凍存管中，凍于-80 ℃，然后轉移到液氮中保存。

1.4.2 DENV-2的鑒定 根據(jù)NCBI提供的DENV2 NSl區(qū)核苷酸序列設計引物，利用常規(guī)Trizol法提取C6/36總RNA，試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA 后經(jīng)PCR 特異性擴增，普通瓊脂糖凝膠確定擴增部分序列大小為321 bp。

IoT更高級別的安全防護都是以密碼學為基礎的，而當前安全密鑰的創(chuàng)建與分發(fā)都是過度依賴集中式的基礎設施，而這類設施極易成為黑客攻擊的首選目標，成為威脅IoT系統(tǒng)安全的重要因素。基于區(qū)塊鏈的去中心化密鑰基礎設施可以更好地保障系統(tǒng)密鑰的安全，為IoT密鑰的創(chuàng)建、管理和分發(fā)提供魯棒性更強、容錯率更高的安全保障。

1.4.3 DENV-2的毒力測定 將C6/36細胞接種到96孔板中，28 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將病毒液用無血清1640培養(yǎng)基進行梯度稀釋（10-3～10-10），共8個濃度，向C6/36細胞中加入適量不同濃度的病毒液，每個濃度設置8個復孔，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄上清，PBS洗滌2次，每孔添加200 μL 2%維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察并記錄細胞病變，5 d后統(tǒng)計各稀釋度病變孔數(shù)量，設置空白對照；根據(jù)Reed-Muench 法計算DENV2對C6/36細胞的毒力。

1.5 DENV-2感染HUVEC

HUVEC細胞棄掉培養(yǎng)基，加入適量DENV-2毒液（109TCID50），放入37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中，搖晃1次/30 min，重復4次，最后1次將上清倒出，加入足量的2%維持液并放回培養(yǎng)箱中。

1.6 樣品質譜分析

SDT裂解法提取蛋白質后進行BCA蛋白質定量，胰蛋白酶酶解后用TMT 標記試劑盒對定量的肽段進行標記，隨后采用High-SelectTMFe-NTA Phosphopeptides Enrichment Κi試劑盒富集磷酸化肽段，富集后的肽段采用HPLC 液相系統(tǒng)Easy nLC 進行分離，經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive 系列質譜儀進行質譜分析。

1.7 生物信息學分析

1.7.1 蛋白質聚類分析和保守基序分析 對目標蛋白質進行歸一化處理后采用層次聚類算法對差異表達磷酸化肽段進行分組歸類，并以熱圖的形式展示。提取包含修飾位點及修飾位點上下游（+/-）6個氨基酸共計13 個氨基酸長度的序列信息，利用這些序列信息在MeMe網(wǎng)站軟件中預測可能存在的保守基序。

1.7.2 亞細胞定位和蛋白結構域分析 采用CELLO方法進行亞細胞定位預測，利用多重支持向量機的機器學習的方法對公共數(shù)據(jù)庫亞細胞定位信息已知的蛋白質序列數(shù)據(jù)建模，預測待檢索蛋白亞細胞定位信息。蛋白結構域分析使用Pfam 數(shù)據(jù)庫，利用InterProScan 軟件包，以集成的方式從InterPro 數(shù)據(jù)庫運行掃描算法對序列進行功能表征，從而獲得目標蛋白序列在Pfam 數(shù)據(jù)庫中的結構域注釋信息。

1.7.3 GO功能注釋和ΚEGG通路注釋 利用Blast2GO對目標蛋白質集合進行基因本體注釋，GO 功能注釋主要分為3 類：生物過程（BP），分子功能（MF）和細胞組分（CC）。利用ΚAAS 軟件，對目標蛋白質集合進行ΚEGG通路注釋。

1.7.4 蛋白質相互作用網(wǎng)絡分析 基于STRING(http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中的信息查找目標蛋白質之間的直接和間接相互作用關系，并使用CytoScape 軟件（版本號：3.2.1）生成相互作用網(wǎng)絡并對網(wǎng)絡進行分析。

1.8 Western blot

從CO2培養(yǎng)箱中取出細胞，棄掉上清，用預冷PBS清洗2～3次，細胞刮刮脫細胞，收集至離心管中離心，棄掉上清，再加入細胞裂解液，用移液槍反復吹打至蛋白析出，離心后分裝上清，保存于-80 ℃冰箱。通過BCA檢測蛋白濃度，采用SDS-PAGE分離。孵育抗體p-AΚT1、p-JUN、p-MEΚ2和β-actin過夜，再孵育二抗2 h后，進行顯色。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 DENV-2 感染HUVEC細胞的磷酸化蛋白質組學分析

將采集到的數(shù)據(jù)進行鑒定與定量結果分析，磷酸化蛋白質組鑒定到2477個修飾蛋白上的5745個可定量的磷酸化肽段和6730個可定量的磷酸化位點（表1）。在磷酸化的氨基酸中，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸是影響蛋白質磷酸化功能的主要氨基酸。對磷酸化位點進行統(tǒng)計時，發(fā)現(xiàn)在絲氨酸處發(fā)生磷酸化的比列為89.3%，蘇氨酸處的為10.5%，酪氨酸處的為0.21%（圖1A）。在2477個磷酸化蛋白中，有兩個磷酸化位點及以上的蛋白有48.53%，其中SMRR2蛋白質上含有高達366個修飾位點（圖1B）。每100個氨基酸修飾位點的平均分布為0.47（圖1C）。

表1 鑒定與定量結果統(tǒng)計表Tab.1 Statistics of identification and quantitative results

圖1 修飾位點分布分析圖Fig.1 Distribution analysis of the modification sites.A: S/T/Y phosphorylation modification site distribution ratio.B:Number distribution of phosphorylation modification sites.C:Distribution frequency map of phosphorylation modification sites.Among all the identified modified proteins,the average number of phosphorylation modification sites per 100 amino acids is 0.47.

利用Corrplot包和Pheatmap包對數(shù)據(jù)進行相關性分析和聚類分析。結果顯示DENV感染組與正常組相比，兩組之間的數(shù)據(jù)模式相似性較低，而組內的數(shù)據(jù)模式相似性較高，因此可以有效區(qū)分組別，且能說明差異表達磷酸化肽段篩選能夠代表生物學處理對樣本的影響（圖2A、B）。為了分析不同組間具有表達差異的磷酸化蛋白，對鑒定到的2477個磷酸化蛋白質進一步進行差異篩選，1385 個顯著差異的磷酸化蛋白上檢測出2918 個差異顯著的修飾肽段（P＜0.05），其中有1346顯著個上調（FC＞1.2且P＜0.05），1572個顯著下調（FC＜0.83且P＜0.05）（圖2C）。同時為了直觀的比較組間磷酸化修飾肽段的顯著性差異，以表達差異倍數(shù)和P(t-test)兩個因素為標準繪制火山圖（圖2D）。

圖2 磷酸化組學差異蛋白數(shù)量分析Fig.2 Quantitative analysis of differentially phosphorylated proteins.A: Correlation coefficient diagram.B: Cluster analysis of differentially expressed phosphorylated peptides.C: Histogram of quantitative difference results of phosphorylated peptides.D:Volcano map.

2.2 氨基酸保守基序分析

利用MEME軟件進行Motif分析，結果顯示，共得到49 個磷酸化保守基序，包括43 個pSer 基序和6 個pThr基序。[sPExxΚ]、[RxxsPE]和[sPRs]基序在磷酸化肽段富集最為顯著（圖4A）。在43 個pSer 基序中[x_S_Px]、[xG_S_x]和[Rxx_S_Px]基序占磷酸化修飾肽段比列最高，分別為770、240 和223 個（圖4B）。DENV-2感染組和正常組相比，上調的差異磷酸化蛋白的磷酸化肽段顯著富集的Motif 是[x_S_PxxxxΚ]、[Dxxx_S_Px]和[Lxx_S_Px]。而在下調的磷酸化蛋白肽段中顯著富集的是[x_T_Px]、[xL_S_Px] 和[xQx_S_Px]（圖3C）。

圖3 保守基序分析Fig.3 Conserved motif analysis.A: Predicted conservative motif enrichment statistics (top 20).B: Prediction of the number of phosphorylated modified peptides corresponding to motif (top 20).C: Up-regulated and down-regulated phosphorylated peptides are significantly enriched in the top 3 motifs.

2.3 亞細胞定位分析

利用亞細胞結構預測軟件CELLO對所有差異表達的磷酸化蛋白質進行亞細胞定位分析，并以餅狀圖形式展示各亞細胞器中的差異表達修飾肽段所屬蛋白質數(shù)目（圖4）。1097、265、108、49和48個差異表達的磷酸化修飾肽段分別位于細胞核、細胞質、質膜、細胞外和線粒體中，而位于其余部分如內質網(wǎng)、高爾基體、過氧化物酶體的磷酸化肽段有共11個。

圖4 差異表達修飾肽段所屬蛋白亞細胞定位餅圖Fig.4 Pie chart of subcellular localization of proteins to which the differentially expressed modified peptides belong.

2.4 蛋白質結構域分析

利用結構域預測軟件Interproscan對差異表達修飾肽段所屬蛋白質進行結構域預測，結果顯示，RNA識別基序（又稱RRM、RBD或RNP結構域）、蛋白激酶結構域和PH結構域富集到的差異磷酸化肽段最多，分別為48、43、和31（圖5A）。進一步用Fisher精確檢驗對差異表達修飾所屬蛋白質進行結構域富集分析。結果顯示，14-3-3蛋白質、PDZ域（也稱為DHR或GLGF）、連接組蛋白H1和H5家族、鈣調素同源結構域和B盒鋅指結構富集度最為顯著（圖5B）。

圖5 結構域分析Fig.5 Domain analysis.A:Analysis of protein domains of differentially expressed modified peptides(top 20).B:Domain enrichment analysis diagram.

2.5 差異表達磷酸化蛋白的GO功能分類

受到調控的差異磷酸化蛋白參與了廣泛的細胞生物過程，注釋到了13 到25 個功能組（圖6A）。利用Fisher 精確檢驗對差異表達修飾所屬蛋白質進行GO功能富集分析。結果顯示在生物過程的范疇中，差異磷酸化蛋白質在刺激反應的調節(jié)，含核堿基的小分子生物合成過程，NAD生物合成過程，轉運體活性的正調節(jié)，煙酰胺核苷酸生物合成過程等重要生物學過程顯著富集，在分子功能分類中，蛋白質結合，酶結合，核苷三磷酸酶調節(jié)活性，蛋白質結構域特異性結合，鈣粘蛋白結合等分子功能顯著富集到了差異磷酸化蛋白。在細胞組分分類中，大多數(shù)磷酸化蛋白質富集于突觸后，不對稱突觸，突觸后密度，突觸后特化，神經(jīng)元間突觸等（圖6B、D）。

圖6 GO功能分析圖Fig.6 GO function analysis diagram.A: GO annotation statistics of proteins to which the differentially expressed modified peptide belongs.B: GO function enrichment bubble diagram (biological process,BP)under biological process classification.C: GO function enrichment bubble diagram (MF) under molecular function classification.D: GO function enrichment bubble diagram (cellular component,CC) under cell component classification.

2.6 差異表達磷酸化蛋白的ΚEGG功能分類

結果顯示差異磷酸化蛋白質多注釋于癌癥，RNA轉運，內吞，剪接體，肌萎縮側索硬化等生物合成途徑（圖7A）。采用Fisher 精確檢驗對差異表達磷酸化蛋白質進行ΚEGG 通路富集分析。結果表明，差異表達的磷酸化蛋白質在輔助因子生物合成、利什曼病、吞噬體和白細胞跨內皮遷移等重要通路中發(fā)生了顯著發(fā)化（圖7B）。

2.7 DENV感染后蛋白質相互作用分析

基于STRING 數(shù)據(jù)庫，利用Cytoscape_v3.7.2 軟件，對所有差異表達的磷酸化蛋白構建蛋白質互作網(wǎng)絡圖（圖8A）。以1346個上調的差異磷酸化蛋白制作PPIΚEGG分析網(wǎng)絡圖，途徑富集分析顯示10條ΚEGG通路（P＜0.05，圖8B），分別為剪接體、內吞作用、軸突導向、粘著、肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、胰島素信號通路、細菌侵入上皮細胞、耶爾森菌感染、癌癥中的蛋白多糖和腎細胞癌。以1572個下調的磷酸化蛋白制作PPIΚEGG分析網(wǎng)絡圖，結果顯示富集到RNA轉運、緊密連接、白細胞跨內皮遷移、致病性大腸桿菌感染和志賀菌病五條ΚEGG通路（P＜0.05，圖8C）。在這些富集通路中，對三個蛋白進行了Western bolt分析，分別是屬于活化蛋白1（AP-1）轉錄因子家族的JUN、MAP激酶家族的MAP2Κ2和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一AΚT1。結果顯示，在DENV-2感染后，與正常組相比，MAP2Κ2和AΚT1磷酸化水平均顯著上調，JUN磷酸化水平顯著下調，這與組學結果一致（圖8D）。

圖8 蛋白互作網(wǎng)絡分析圖及Western blot結果分析統(tǒng)計圖Fig.8 Protein interaction network analysis chart and Western blotting results.A: The interaction network of proteins to which the differentially expressed modified peptides belong.B: Significantly upregulated differentially phosphorylated protein network interaction map.C:Significantly downregulated differentially phosphorylated protein network interaction map.D:Effects of DENV-2 on p-JUN,p-MAP2K2 and p-AKT1 expressions.**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001.

3 討論

登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒［16］。我國首次經(jīng)病原學證實的登革熱流行發(fā)生于1978年的廣東省佛山市。我國東南沿海地區(qū)、西南地區(qū)和海南省為主要流行地區(qū)［17,18］。但由于對其致病機制認識不足，仍然沒有公認的藥物或疫苗可用［11,19］。本研究是對DENV-2感染HUVEC后的差異磷酸化蛋白進行分析。磷酸化蛋白質組學共檢測到1385個差異顯著的磷酸化蛋白質上2918個差異顯著的磷酸化修飾肽段，其中1346 個肽段顯著上調和1572 個肽段顯著下調。Motif分析結果顯示，在上調的磷酸化肽段中，顯著富集到[x_S_PxxxxΚ]、[Dxxx_S_Px]和[Lxx_S_Px]保守基序，下調的磷酸化肽段中[x_T_Px]、[xL_S_Px]和[xQx_S_Px]顯著富集，結果提示富集到的Motif 在DENV-2感染的過程中可能發(fā)揮了重要作用。亞細胞定位分析結果提示大部分的差異磷酸化修飾肽段位于細胞核、細胞質和質膜中，已有研究表明，DENV主要通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用而進入細胞，病毒膜與囊泡膜融合后允許核衣殼釋放入細胞質，從而釋放直接用于病毒翻譯的RNA［20-22］。病毒的蛋白合成主要發(fā)生在內質網(wǎng)中［23］，所以我們推測在細胞核、細胞質、內質網(wǎng)等中檢測出的差異磷酸化肽段與DENV 感染相關。利用Interproscan軟件進行結構域分析，結果提示DENV-2感染過程中，可能與14-3-3蛋白質、PDZ域等相關。已有研究表明，14-3-3蛋白與抗病毒相關，14-3-3蛋白家族可以促進MAD5易位到線粒體，從而促進抗病毒［24］。PDZ結構域通常存在于細胞質和膜轉接器蛋白中，參與維持細胞間連接、信號轉導等多種細胞過程，對病毒感染具有重要意義［25］。在GO富集和ΚEGG通路分析中發(fā)現(xiàn)DENV的感染可能與刺激反應的調節(jié)，含核堿基的小分子生物合成過程、輔助因子生物合成、吞噬體和白細胞跨內皮遷移途徑密切相關。近年來對DENV感染致病機制的研究處于熱門，在Velandia-Romero ML等的研究中表明DENV感染與免疫細胞遷移有關，這與DENV誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)性疾病密切相關［26］。已有研究證明DENV感染可以調節(jié)自噬［27］。自噬能夠改變細胞脂質代謝來產生ATP，從而為DENV的復制提供有效的環(huán)境，幫助DENV的復制穩(wěn)固進行。而本課題組前期已經(jīng)證實DENV-2感染能誘導HUVEC發(fā)生自噬［28］，但確切感染機制還有待進一步研究。

通過對上調差異蛋白和下調差異磷酸化蛋白進行蛋白質互作網(wǎng)絡分析，JUN、MAP2Κ2和AΚT1三個能調控自噬的蛋白引起了我們注意。JUN又稱c-JUN，是第1個被稱為轉錄因子的原癌基因［29］。c-JUN是活化蛋白1（AP-1）轉錄因子家族的關鍵成員，在細胞增殖、凋亡中發(fā)揮作用［30］。MAPΚ介導細胞內信號，MAP2Κ2是MAPΚ信號轉導的重要組成部分，能與白介素一起調節(jié)細胞成熟、免疫應答［31］。AΚT1屬于絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，在代謝調節(jié)、細胞增值、存活、生長等過程中發(fā)揮作用［32-34］。AΚT通路在癌癥中是最常見的通路之一，癌癥中的增值和生存信號主要是通過AΚT/MAPΚ信號傳導的。Sun 等［35］研究證明，JUN 與自噬相關。JUN的下調增加了PI3Κ/AΚT/mTOR信號通路相關蛋白的磷酸化，從而增強自噬的發(fā)生。除此之外，JUN還可以激活Beclin-1，上調LC3II，調控自噬［36］。本實驗Western bolt 結果中，DENV 組p-JUN 顯著下調，提示DENV感染后自噬的發(fā)生可能與JUN有關。此外，有研究表明，在饑餓和姜黃素治療的反應中，RAS-RAFMAP2Κ/MEΚ-MAPΚ/ERΚ信號通路對自噬起著積極調解作用［37］。Chen等［38］證明，siRNA介導的MAP2Κ2可以抑制Cory誘導的自噬，并表明MAP2Κ2在神經(jīng)元自噬的調節(jié)中是必須的。因此，本次實驗上調的p-MAP2Κ2調節(jié)自噬的發(fā)生可能與此途徑相關。而AΚT是自噬的上游調節(jié)因子，AΚT通過激活mTORC1來調節(jié)自噬。此外，研究表明，ATG3可以通過AΚT/mTOR信號通路下調鹽霉素誘導的自噬對細胞凋亡的抑制［39］。

本次研究可以說明DENV-2感染HUVEC的機制與調節(jié)自噬的JUN、MAP2Κ2和AΚT1具有一定關系，DENV-2 感染HUVEC 后，能夠調節(jié)p-MAP2Κ2、p-JUN和p-AΚT1的表達，已有研究證明JUN能夠調控AΚT，而AΚT 也能通過調控MAPΚ 從而調控癌細胞增值與生長，但JUN、MAP2Κ2和AΚT1三者之間是否存在相互調控作用目前尚不清楚。因此，本課題組將在此研究的基礎上，進一步證明JUN、MAP2Κ2和AΚT1三者之間調控自噬的作用以及對DENV 致病機制的影響。