雙酚類化合物對人胚腎細胞HEK293的毒性和氧化應(yīng)激的研究

李專， 陳力可， 汪雪格， 李廣柱， 邊德軍*

(1.長春工程學(xué)院水利與環(huán)境工程學(xué)院， 長春 130012； 2.吉林省城市污水處理重點實驗室， 長春 130012； 3.海南省環(huán)境科學(xué)研究院， 海口 571126)

雙酚類化合物(bisphenols， BPs)是一類對環(huán)境和健康具有潛在風(fēng)險的新型持久性有機污染物。主要應(yīng)用于合成高分子聚合材料，如聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂等，以及其他工業(yè)產(chǎn)品和日常生活消費品[1]。BPs 經(jīng)排放進入水體、沉積物、空氣、土壤等環(huán)境介質(zhì)中，通過各種途徑進入生物體并在體內(nèi)蓄積[2-6]。其中，雙酚A(bisphenol A， BPA)是最典型且產(chǎn)量最高的BPs，大量研究表明BPA對生殖和發(fā)育、神經(jīng)和心血管、肝腎代謝等方面會產(chǎn)生負面影響[7-9]。因此，加拿大、美國、歐洲和中國先后出臺相關(guān)法律政策，禁止和限制含BPA制品的生產(chǎn)和使用[10]，這一舉措刺激了BPA替代品的生產(chǎn)和使用。其中，雙酚S(bisphenol S， BPS)、雙酚F(bisphenol F， BPF)和雙酚AF(bisphenol AF， BPAF)是最常見的BPA替代品。BPS 主要用于個人護理品、環(huán)氧樹脂膠水、食品罐頭包裝及熱敏紙、染料的改良劑和穩(wěn)定劑。BPF常用于清漆、襯墊、塑料粘合劑、牙科密封劑及食品包裝中。BPAF 可作為交聯(lián)劑，應(yīng)用于氟橡膠、電子和光纖等聚合物的生產(chǎn)中[11-12]。雙酚類化合物的產(chǎn)量及應(yīng)用在全球范圍內(nèi)的迅速增長，其安全性也受到越來越多的關(guān)注。多項研究顯示，雙酚類化合物經(jīng)過度排放進入環(huán)境介質(zhì)中，并通過食物鏈的放大作用在生物體內(nèi)累積，在水體、沉積物、顆粒物、動植物及人體血液、尿液甚至母乳等樣本中均發(fā)現(xiàn)了雙酚類化合物的存在，其中BPA、BPS、BPF和BPAF是最主要的貢獻單體[13-16]。

迄今為止，已有大量關(guān)于BPA對生物機體的毒性效應(yīng)的研究，主要集中在生殖發(fā)育、心血管和腎臟病理學(xué)等方面。研究證明BPA可以誘導(dǎo)不同的細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致細胞凋亡。美國環(huán)境保護署(U.S. Environmental Protection Agency，EPA)根據(jù)系列動物的劑量暴露實驗所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)將BPA的安全濃度設(shè)置為50 μg/(kg·d)，同時有研究表明50 mg/kg的 BPA 就能對大鼠腎臟功能產(chǎn)生中度損傷[17]。腎是人體重要的代謝器官，夠維持體內(nèi)電解質(zhì)的穩(wěn)定和酸堿平衡，排泄有毒物質(zhì)，對于機體內(nèi)部的穩(wěn)定和正常的新陳代謝起到至關(guān)重要的作用。Yuan等[18]的研究結(jié)果表明，氧化應(yīng)激、細胞凋亡和 DNA 損傷在BPA(1、10、100和1 000 μmol/L)誘導(dǎo)恒河猴胚胎腎細胞Marc-145的毒性機制中起了關(guān)鍵作用。近年來由于BPA替代品的使用量劇增，BPA替代品已逐漸成為威脅環(huán)境和健康的重要風(fēng)險因子。然而，BPA替代品對腎臟系統(tǒng)的毒性效應(yīng)的研究尚未被廣泛探索，缺乏足夠的毒理學(xué)數(shù)據(jù)來支持健康風(fēng)險評估。

為了比較4種常見的雙酚類化合物BPA、BPS、BPF和BPAF對具有代謝功能的人胚腎細胞HEK293的毒性影響，現(xiàn)通過測定細胞活力，胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的水平，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)等氧化應(yīng)激指標的水平及細胞內(nèi)Ca2+的含量，探討B(tài)Ps對HEK293細胞氧化損傷作用，從氧化應(yīng)激的角度分析BPs 對生物體的損傷作用，為深化了解雙酚類化合物的毒理學(xué)系統(tǒng)研究和風(fēng)險評估提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雙酚A[99%， 2，2-雙(4-羥基苯基)丙烷，BPA]、雙酚F[99%，雙(4-羥苯基)甲烷，BPF]、雙酚S[99%，4，4′-磺?；椒樱珺PS]、雙酚AF[99%，2，2-雙(4-羥基苯基)六氟丙烷，BPAF]、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司；人胚胎腎細胞系HEK293購自中國科學(xué)研究所上海細胞生物資源中心，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)購自康寧公司(Manassas，VA，USA)，胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)購自GIBCO公司(Grand Island，NY，USA)。其他試劑均為分析純，購自北京化工制藥廠。

1.2 實驗設(shè)計

選取人胚胎腎細胞HEK293作為實驗?zāi)Ｐ?，該細胞為貼壁細胞，培養(yǎng)在含有10% FBS、100 U/mL青霉素100 U/mL鏈霉素改良的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HEK293細胞，用胰蛋白酶消化細胞，調(diào)整細胞密度至2×105個/mL，接種于6孔培養(yǎng)板，在CO2培養(yǎng)箱中(37℃、5% CO2)培養(yǎng)12 h后棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗兩遍，分別加入含有不同濃度(0、1、5、10、50和100 μmol/L)的BPA、BPS、BPF和BPAF培養(yǎng)基(含0.08%的DMSO)繼續(xù)培養(yǎng)。對照組為含有0.08% DMSO的完全培養(yǎng)基。

1.3 細胞活力的測定

細胞暴露于不同濃度組BPA、BPS、BPF和BPAF 24 h和48 h后，利用倒置光學(xué)顯微鏡(Leica， DMI 3000B，Germany)觀察細胞的形態(tài)，利用MTT細胞活性檢測試劑盒(碧云天，中國)測定細胞活力，調(diào)整細胞密度至5×104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板中，每孔加入10 μL(MTT)溶液，在37 ℃下孵育4 h，吸出上清液，每孔加入100 μL Formazan溶解液，酶標儀(Epoch，Biotek，美國)在570 nm波長處檢測每孔的光密度。

1.4 活性氧含量(ROS)的測定

活性氧檢測試劑盒是一種通過測量熒光探針DCFH-DA水平，測定細胞內(nèi)ROS含量試劑盒。將細胞分別暴露于不同濃度BPA、BPS、BPF和BPAF 24 h和48 h后，去除細胞培養(yǎng)基，稀釋細胞懸液至105個/mL，每孔加入1 mL稀釋好的DCFH-DA溶液(終濃度10 μmol/L)，避光37 ℃孵育30 min，中間每隔10 min輕搖1次，PBS緩沖液洗滌2～3次，使用酶標儀在 525 nm 波長處測量吸光度。

1.5 超氧化物歧化酶(SOD)的測定

將暴露于不同濃度組BPA、BPS、BPF和BPAF后的細胞用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2遍，按照每106個細胞加入100 μL的比例加入試劑盒提供的SOD樣品制備液，吹打以充分裂解細胞，離心(4 ℃，10 000 g)3 min，取上清作為待測樣品，將樣品、工作液依次加入96孔板中，37 ℃ 孵育30 min，使用酶標儀在450 nm 處測量吸光度。

1.6 總谷胱甘肽(GSH)的測定

收集暴露于不同濃度組BPA、BPS、BPF和BPAF后的細胞，離心，棄上清液，用PBS緩沖液重懸細胞兩次，加入細胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑M溶液，用液氮和37 ℃水浴將細胞快速凍融兩次，然后冰浴 5 min再離心(4 ℃，10 000 g)10 min，取上清液，依次加入工作液至 96 孔板，使用酶標儀在412 nm波長處測量吸光度。

1.7 丙二醛(MDA)的測定

將暴露于各組BPA、BPS、BPF和BPAF后的細胞，用細胞裂解液處理后，離心(10 000 g)10 min，后取上清，依次加入MDA工作液，沸水水浴15 min，冷卻至室溫離心10 min(1 000 g)后取上清200 μL轉(zhuǎn)移至96孔板，利用酶標儀再532 nm波長處測量吸光度。

1.8 Ca2+水平的測定

利用 Ca2+熒光探針 Fluo-4 AM 檢測細胞內(nèi) Ca2+水平。Fluo-4 AM 是一種可以穿透細胞膜的熒光染料，本身熒光非常弱，進入細胞后可以被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-4滯留在細胞內(nèi)，F(xiàn)luo-4結(jié)合Ca2+后能可以產(chǎn)生較強的熒光。將暴露于BPA、BPS、BPF和BPAF后的細胞用PBS 洗滌細胞 3 次，每孔中加入工作濃度為 4 μmol/L的熒光探針 Fluo-4 AM 和0.1% Pluronic F-127，于37 ℃孵育 30 min。PBS緩沖液洗滌細胞3次，之后消化收集細胞，離心棄上清，PBS緩沖液重懸細胞，利用酶標儀在488 nm波長下測量吸光度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗每組做3個平行。實驗數(shù)據(jù)用平均值(mean)±標準偏差(SD)表示，利用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，并進行單因素方差分析(ANOVA)。以P<0.05為差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞活力

為了驗證雙酚類化合物(BPs)在體外對人胚腎細胞HEK293的活力影響，將HEK293細胞分別暴露于不同濃度的BPA、BPS、BPF和BPAF 24 h及48 h后，用MTT法測定細胞活力，實驗結(jié)果(圖1)顯示，隨著BPs濃度和暴露時間的增長，HEK293細胞活力均受到不同程度的抑制作用，且細胞活力呈濃度和時間(24 h和48 h)依賴性下降。

圖1 BPA、BPS、BPF和BPAF暴露24 h及 48 h后對細胞活力的影響Fig.1 Effects of BPA、 BPS、BPF and BPAF on the cell viability of HEK293 after 24 h and 48 h exposure

當(dāng)細胞分別暴露于100 μmol/L的BPA、BPS、BPF和BPAF 24 h后，細胞活力分別降至對照組的 52.1%、88.6%、62.5%、24.6%；當(dāng)細胞分別暴露于100 μmol/L的BPA、BPS、BPF和BPAF 48 h后，細胞活力分別降至對照組的 45.2%、82.6%、53.1%、21.5%。可見，BPAF對人胚腎細胞HEK293的活力抑制作用最強，BPA和BPF對HEK293的細胞活力抑制作用次之，BPS在暴露劑量范圍內(nèi)對HEK293的活力抑制作用最小。當(dāng)BPAF濃度僅10 μmol/L作用24 h和48 h后，細胞活力分別降至對照組的74.3%和66.3%。這可能時由于BPAF具有較強的親脂性，更容易穿透細胞膜。此外，和BPA比較，BPAF的對位上的CF3基團為強吸電子基團，和細胞能產(chǎn)生更強的反應(yīng)性，導(dǎo)致BPAF更容易進入細胞導(dǎo)致細胞損傷[19]。Russo等[20]研究了7種雙酚類化合物對3T3-L1、MCF-7、C6和HeLa 4種細胞的毒性效應(yīng)，研究結(jié)果顯示，相比其他幾種BPs，BPAF對這4種細胞均能產(chǎn)生強烈的急性毒性，其中對3T3-L1成纖維細胞的毒性效應(yīng)最強，IC50可達11 μmol/L左右。與BPA相比，BPF和BPS表現(xiàn)出較小的細胞毒性效應(yīng)，針對不同細胞毒性略有差異，該研究結(jié)果與本項研究結(jié)果比較一致。

2.2 活性氧(ROS)

細胞在受到外源刺激時，會導(dǎo)致細胞內(nèi) ROS 水平大幅上升，出現(xiàn)氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和 DNA 的氧化損傷。氧化應(yīng)激是BPA誘導(dǎo)細胞損傷的主要機制之一，本研究利用 DCFH-DA 探針檢測在不同濃度的雙酚類化合物(BPA、BPS、BPF、BPAF)暴露下的HEK293細胞內(nèi) ROS 水平的變化。實驗結(jié)果顯示(圖2)，在本實驗所選的劑量范圍內(nèi)，HEK293細胞暴露于不同濃度組BPA、BPS、BPF和BPAF 24 h和48 h后，細胞內(nèi)ROS水平隨BPs的濃度增加而上升，與對照組相比，當(dāng)細胞暴露于BPA(10～100 μmol/L)、BPS(100 μmol/L)、BPF(10～100 μmol/L)、BPAF(1～100 μmol/L)后，細胞內(nèi)ROS水平顯著上升。說明BPs能夠以劑量依賴性的方式誘導(dǎo) HEK293 細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致細胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激。當(dāng)細胞暴露于BPS(1、5、10、50 μmol/L)及低濃度BPA(1、5 μmol/L)、BPF(5 μmol/L)24 h后，與對照組相比，細胞內(nèi)ROS 水平略有上升，繼續(xù)暴露48 h后ROS 水平較24 h時有所下降。這說明細胞能自發(fā)的調(diào)節(jié) ROS 水平，細胞在24 h 內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧自由基分子，而隨著暴露時間的延長，抗氧化酶發(fā)揮作用，消除了細胞內(nèi)產(chǎn)生的 ROS，當(dāng)繼續(xù)暴露到48 h 時，ROS水平又逐漸回落，維持了細胞內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡。

圖2 BPA、BPS、BPF和 BPAF暴露24 h及 48 h后對細胞活性氧水平的影響Fig.2 Effects of BPA、BPS、BPF and BPAF on the intracellular ROS level in HEK293 after 24 h and 48 h exposure

2.3 氧化應(yīng)激參數(shù)

為了進一步研究雙酚類化合物對HEK293細胞的氧化應(yīng)激作用[21-23]，本研究檢測了暴露于不同濃度BPA、BPS、BPF和 BPAF后HEK293細胞氧化應(yīng)激生化指標的水平。超氧化物歧化酶(SOD)作為生物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能夠協(xié)助清除自由基，降低細胞的氧化損傷[19]。GSH是細胞內(nèi)重要的非酶抗氧化劑，能夠清除細胞內(nèi)過量的ROS，穩(wěn)定細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，在一定程度上能反映機體抗氧化的能力。MDA是細胞內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，MDA的含量能夠反映出細胞氧化損傷的程度。

由圖3～圖5可知，在所選劑量范圍和時間內(nèi)，與對照組相比，隨BPs濃度增加，細胞內(nèi)SOD和GSH的水平呈濃度依賴性降低。暴露于100 μmol/L BPA、BPS、BPF和 BPAF下24 h后細胞內(nèi)SOD含量分別降至對照組的78.2%、91.9%、72.6%和51.9%。GSH含量分別降至對照組的54.8%、85.5%、62.3%和33.1%。說明BPs能導(dǎo)致細胞內(nèi)抗氧化能力的下降。當(dāng)細胞暴露于低濃度BPA、BPS和BPF處理組，SOD的活性與對照組相比呈現(xiàn)先升后降的趨勢。說明在低濃度BPs的作用下，細胞中的抗氧化酶被激活，因此SOD活性略有上升，來分解氧化應(yīng)激產(chǎn)物，以減少氧化應(yīng)激對細胞的氧化損傷。當(dāng)BPs濃度繼續(xù)增大，HEK293細胞中SOD活性受到了抑制，細胞中的抗氧化系統(tǒng)不足以應(yīng)對高濃度的BPs引起的氧化應(yīng)激，過量的ROS誘發(fā)了細胞的氧化損傷。在HEK293細胞中MDA的水平隨BPs的濃度增加而上升。暴露于100 μmol/L BPA、BPS、BPF和 BPAF下24 h后細胞內(nèi)MDA含量分別約為對照組的1.60倍，1.18倍，1.57倍和3.04倍。這說明ROS 在細胞中過量累積誘發(fā)了氧化應(yīng)激效應(yīng)，細胞的抗氧化能力減弱，導(dǎo)致細胞脂質(zhì)過氧化損傷。在正常生理條件下，ROS 在低濃度下以受控方式產(chǎn)生，并作為細胞生長的信號分子發(fā)揮作用[24-26]。ROS 的產(chǎn)生受到內(nèi)源性細胞抗氧化劑的嚴格調(diào)節(jié)，包括 SOD、GSH以及其他抗氧化劑。ROS 的產(chǎn)生速率與消除速率相平衡。在外源的刺激作用下，細胞產(chǎn)生的 ROS 濃度無法通過正常的保護性抗氧化機制控制，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的氧化應(yīng)激狀態(tài)，增加了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的濃度。Meng等[27]研究了BPA、BPF和BPAF對雄性小鼠肝功能的影響，研究結(jié)果顯示，BPA、BPF和BPAF的暴露會損害小鼠肝臟的抗氧化防御系統(tǒng)，增加脂質(zhì)過氧化，并導(dǎo)致肝臟氧化損傷。

圖3 BPA、BPS、BPF和 BPAF暴露24 h 及48 h 后 對細胞SOD水平的影響Fig.3 Effects of BPA、BPS、BPF and BPAF on the intracellular SOD level in HEK293 after 24 h and 48 h exposure

圖4 BPA、BPS、BPF和 BPAF暴露24 h 及 48 h 后對細胞GSH水平的影響Fig.4 Effects of BPA、BPS、BPF and BPAF on the intracellular GSH level in HEK293 after 24 h and 48 h exposure

圖5 BPA、BPS、BPF和 BPAF暴露24 h 及48 h 后 對細胞內(nèi)MDA水平的影響Fig.5 Effects of BPA、BPS、BPF and BPAF on the intracellular MDA level in HEK293 after 24 h and 48 h exposure

2.4 Ca2+水平

Ca2+作為細胞內(nèi)重要的信號分子，當(dāng)細胞受到外源刺激時，會導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+代謝失衡，鈣信號功能紊亂，導(dǎo)致細胞凋亡[28-29]。本文研究評估了暴露于不同濃度BPA、BPS、BPF和BPAF下細胞內(nèi)Ca2+的水平。結(jié)果(圖6)顯示，在所選濃度范圍內(nèi)，細胞內(nèi)Ca2+水平隨著BPs濃度的增加而上升。高濃度的BPs，特別是BPAF，能引起細胞內(nèi) Ca2+水平的顯著上升，細胞中Ca2+的積累會誘導(dǎo)線粒體功能異常，促進 ROS水平上升，是雙酚類化合物作用于細胞后的常見反應(yīng)。Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，BPA能破壞大鼠神經(jīng)元中的鈣穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致Ca2+水平升高，并通過調(diào)節(jié)蛋白激酶 A(PKA)和蛋白激酶 C(PKC)活性來抑制Ca2+電壓門控通道。Lee等[30]的研究表明，BPAF 能誘導(dǎo)HT-22細胞中Ca2+水平上升，促使細胞內(nèi)活性氧含量升高，并導(dǎo)致細胞凋亡。

圖6 BPA、BPS、BPF和 BPAF暴露24 h 及48 h 后 對胞內(nèi)Ca2+水平的影響Fig.6 Effects of BPA、BPS、BPF and BPAF on intracellular calcium(Ca2+) level in HEK293 after 24 h and 48 h exposure

圖7 不同處理時間對胞內(nèi)Ca2+水平的影響Fig.7 Effects on intracellular Ca2+ level in HEK293 after exposure for the indicated period of time

為了探尋短時間內(nèi)BPs對HEK293細胞內(nèi)Ca2+水平的影響，對暴露不同時長后細胞內(nèi)Ca2+水平進行檢測，實驗結(jié)果(圖7)顯示，細胞暴露于 10 μmol/L BPAF溶液1、4、12、24、48 h后，與對照組相比Ca2+水平分別上升了11.1%、37.4%、42.7%、49.2%和58.3%。細胞暴露于 100 μmol/L BPA溶液1、4、12、24、48 h后，與對照組相比Ca2+水平分別上升了10.6%、22.4%、27.9%、35.1%和38.0%。說明BPs在短時間內(nèi)能促使細胞內(nèi)Ca2+水平顯著提升。

3 結(jié)論

在本文研究選定的劑量范圍和時間內(nèi)，BPA、BPS、BPF 和BPAF均能抑制HEK293細胞的活力。其中，BPAF對人胚腎細胞HEK293的活力抑制作用最強，BPA和BPF次之，BPS對HEK293的細胞活力抑制作用相對較小。細胞內(nèi)活性氧的水平隨著BPA、BPS、BPF 和BPAF濃度的增大而上升，特別是BPAF及高濃度的BPA和BPF能顯著提高細胞內(nèi)活性氧的水平，隨著BPs濃度的增加，SOD和GSH水平顯著下降，MDA水平顯著增加，并且細胞內(nèi)Ca2+水平在短時間內(nèi)顯著上升。這表明BPs 能夠誘導(dǎo)HEK293 細胞產(chǎn)生ROS并發(fā)生氧化應(yīng)激，通過抑制細胞內(nèi)抗氧化酶的產(chǎn)生，破壞細胞內(nèi)氧化和抗氧化之間的平衡機制，誘導(dǎo)氧化損傷。

綜上所述，本研究所選的4種常見的雙酚類化合物BPA、BPF、BPS 和BPAF能夠抑制HEK293細胞活力，通過促進氧化應(yīng)激產(chǎn)生 ROS，降低抗氧化能力，增加細胞內(nèi) Ca2+水平，誘導(dǎo)HEK293細胞損傷。在本研究所選的濃度范圍內(nèi)，BPAF對HEK293細胞的毒性最大，作為BPA的替代品的安全性需引起更多的注意；BPF和BPA對HEK293細胞的毒性比較接近，BPS作為聚合物合成和熱敏紙生產(chǎn)中BPA的主要替代品，對HEK293細胞毒性遠低于BPA。研究結(jié)果將為評估雙酚類化合物的毒性效應(yīng)和風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)。