HPLC-ELSD 測(cè)定黃芪阿膠口服液中黃芪甲苷的含量

鄭 燕，湯麗昌，程妮婭

（北海市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西北海 536000）

黃芪阿膠口服液是以黃芪、阿膠、熟地黃、當(dāng)歸、黨參和葡萄糖酸亞鐵為主要成分加工成的口服液，它具有改善營(yíng)養(yǎng)性貧血的功效。黃芪阿膠口服液中黃芪為改善營(yíng)養(yǎng)性貧血的主要功效來(lái)源，黃芪中主要成分是黃芪甲苷，黃芪甲苷的含量對(duì)于臨床用藥的安全性及其活性有較大的指導(dǎo)意義[1-2]。黃芪中黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為質(zhì)量控制成分，其中黃芪甲苷含量指標(biāo)低限是毛蕊異黃酮葡萄糖苷的4 倍[3]。因此，采用高效液相色譜法對(duì)黃芪阿膠口服液中含量較高的黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定研究，可為黃芪阿膠口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

3 批黃芪阿膠口服液，均為市售品（批號(hào)分別為20220602、20220102、20211102）。

1.2 試劑與儀器

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201515，供實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)用），中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；正丁醇為色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；氨水為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；水為超純水，密理博純水儀制備；0.45 μm 針筒式微孔濾膜過(guò)濾器，天津市科藝隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1260II 高效液相色譜儀（配蒸發(fā)光檢測(cè)器），安捷倫科技有限公司；HH-6 恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；XS205DU 萬(wàn)分之一電子天平，梅特勒有限公司；CPX5800H-C 超聲波清洗儀，上?？茖?dǎo)儀器有限公司；Simplicity 純水儀，美國(guó)密理博。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品50.15 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 含有黃芪甲苷1.003 mg 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，該溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用。

1.3.2 供試品溶液制備

取批號(hào)為20220602 的黃芪阿膠口服液10 支，取其內(nèi)容物混合，精密量取20 mL 置于分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2 次，每次30 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，備用。

1.3.3 樣品含量測(cè)定

分別取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋成系列濃度的溶液及3 批供試品溶液，采用高效液相色譜儀進(jìn)行峰面積數(shù)據(jù)采集，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)數(shù)方程計(jì)算含量。

1.3.4 色譜條件

Waters XBridge-C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（35 ∶65，V/V），等比例洗脫，流速為1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.5 檢測(cè)器條件

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；蒸發(fā)溫度：90 ℃；漂移管溫度：75 ℃；氣體流速：1.6 L·min-1。

1.3.6 方法學(xué)考察驗(yàn)證

（1）線(xiàn)性關(guān)系考察試驗(yàn)。吸取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋成系列濃度的溶液，精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（黃芪甲苷質(zhì)量濃度為1.015 mg·mL-1） 5 mL、2 mL，置100 mL 棕色容量瓶中，然后加甲醇并稀釋至刻度，精密吸取對(duì)照品溶液（黃芪甲苷質(zhì)量濃度為1.015 mg·mL-1）5 mL、2 mL、1 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中，然后加甲醇并稀釋至刻度，制得0.020 06 mg·mL-1、0.050 15 mg·mL-1、0.100 30 mg·mL-1、0.200 60 mg·mL-1和0.501 50 mg·mL-1系列濃度標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液。按“1.3.4、1.3.5”優(yōu)化得到的儀器條件，分別注入20 μL 對(duì)照品待測(cè)液，記錄峰面積。以峰面積（mV）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)數(shù)方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

（2）精密度考察試驗(yàn)。精密吸取（1）步驟下所得0.100 30 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下優(yōu)化得到的儀器條件，連續(xù)進(jìn)樣6 針，分別測(cè)其峰面積，并計(jì)算RSD。

（3）穩(wěn)定性考察試驗(yàn)。取同一批號(hào)（批號(hào)：20220602）制備所得供試品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h 和24 h 進(jìn)樣20 μL，記錄黃芪甲苷峰面積，并計(jì)算RSD。

（4）重復(fù)性考察試驗(yàn)。按照“1.3.2”項(xiàng)下，取同一批號(hào)（批號(hào)：20220602）平行制備供試品溶液6 份，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)樣，記錄黃芪甲苷峰面積，并計(jì)算RSD。

（5）加標(biāo)回收考察試驗(yàn)。精密量取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL 黃芪甲苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各3 份，氮?dú)獯蹈桑謩e精密加入混合后的樣品溶液（批號(hào)：20220602）各20 mL。按“1.3.2”項(xiàng)下的制樣方法制備，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)樣，記錄黃芪甲苷峰面積，計(jì)算平均回收率及RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖分析

取制備好的對(duì)照品溶液、樣品溶液分別注入液相色譜儀，在“1.3.4、1.3.5”條件下進(jìn)樣分析，對(duì)照品色譜圖結(jié)果見(jiàn)圖1，供試品色譜圖結(jié)果見(jiàn)圖2。由供試品色譜圖結(jié)果可以看出，黃芪甲苷峰不受其他成分干擾，其分離度良好，分離度＞24，理論塔板數(shù)均＞12 000。

圖1 黃芪甲苷對(duì)照液色譜圖

圖2 供試品色譜圖

2.2 樣品含量測(cè)定

精密量取混合后的3 批樣品各20 mL，按“1.3.2”步驟的制樣方法制備供試品溶液，然后按“1.3.4、1.3.5”條件進(jìn)行測(cè)定，將所測(cè)得的黃芪甲苷峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程中，計(jì)算。各樣品黃芪甲苷含量見(jiàn)表1。

表1 黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果表

2.3 方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 線(xiàn)性關(guān)系結(jié)果

對(duì)黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品的線(xiàn)性范圍進(jìn)行考察，以峰面積Y（mV）的對(duì)數(shù)值與對(duì)照品待測(cè)液濃度X（mg·mL-1）的對(duì)數(shù)值進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程為lgY=4.29+1.77 lgX，相關(guān)系數(shù)r為0.999 6。結(jié)果表明，黃芪甲苷在0.020 06 ～0.501 50 mg·mL-1線(xiàn)性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。

圖3 黃芪甲苷溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

2.3.2 精密度考察結(jié)果

精密吸取1.3.6（1）步驟下所得0.100 30 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下優(yōu)化得到的儀器條件，連續(xù)進(jìn)樣針，記錄其峰面積為302.81、299.50、303.48、306.51、313.94 和312.60，計(jì)算峰面積RSD 為1.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

取同一批號(hào)（批號(hào)：20220602）按照“1.3.2”制備供試品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h 和24 h 進(jìn)樣20 μL，含量測(cè)定結(jié)果為0.013 48 mg·mL-1、0.013 61 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 57 mg·mL-1、0.013 47 mg·mL-1和0.013 49 mg·mL-1，計(jì)算RSD 為0.8%，結(jié)果表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性考察結(jié)果

按照“1.3.2”取同一批號(hào)（批號(hào)：20220602）平行制備供試品溶液6 份，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)樣，含量測(cè)定結(jié)果為分別為0.013 52 mg·mL-1、0.013 60 mg·mL-1、0.013 71 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 16 mg·mL-1和0.013 76 mg·mL-1，計(jì)算RSD 為1.7%，結(jié)果表明此分析方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加標(biāo)回收考察結(jié)果

精密量取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL 黃芪甲苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（1.015 mg·mL-1）各3 份，氮?dú)獯蹈桑謩e精密加入混合后的樣品溶液（批號(hào)：20220602）各20 mL。按“1.3.2”項(xiàng)下的制樣方法制備，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)樣，每個(gè)樣品進(jìn)兩針，記錄黃芪甲苷峰面積，計(jì)算平均回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，測(cè)定方法可靠、符合分析測(cè)試要求。

表2 黃芪阿膠口服液加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

采用2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》[3]方法測(cè)定黃芪阿膠口服液中黃芪甲苷發(fā)現(xiàn)，由于該產(chǎn)品是糖漿劑，含有大量蔗糖，受其影響即便優(yōu)化色譜柱、流動(dòng)相及流動(dòng)相比例也無(wú)法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分與其他成分的有效分離。因此，采取正丁醇液萃取除去糖分及部分極性較強(qiáng)的其他成分[4-5]，優(yōu)選合適的色譜柱、流動(dòng)相及其比例，再次測(cè)定所得色譜峰型較好，且能和其他成分實(shí)現(xiàn)完全分離，所得色譜峰理論塔板數(shù)高。對(duì)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示蒸發(fā)溫度為90 ℃、漂移管溫度為75 ℃時(shí)響應(yīng)值最高。

本研究所采用的方法所用儀器較為常見(jiàn)，可普遍適用于各生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)控、產(chǎn)品檢驗(yàn)等環(huán)節(jié)。本法分析時(shí)間較短，線(xiàn)性、精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均良好，回收率符合檢測(cè)要求，可為含黃芪甲苷保健食品的質(zhì)量控制提供理論參考。