黃芪多糖通過PI3K/AKT/mTOR促進(jìn)激素性骨質(zhì)疏松癥大鼠成骨細(xì)胞增殖

孫文星 黃萬新 劉傳慧 陳建停

鄭州市骨科醫(yī)院綜合內(nèi)外科，河南 鄭州 450015

骨質(zhì)疏松癥是一種全身代謝性疾病，伴有骨丟失和與代謝異常相關(guān)的骨組織結(jié)構(gòu)損傷[1]。糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，主要表現(xiàn)為成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同維持骨形成和骨吸收之間的平衡。雙膦酸鹽被認(rèn)為是GIOP最常用的藥物[2]，但雙膦酸鹽類藥物也存在諸多不良反應(yīng)，亟需探索更健康、更安全的治療方案。

目前，天然藥物是各種疾病的熱門研究課題。黃芪是黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge的干燥根，是一種用于中藥的草本植物[3]。黃芪多糖是黃芪的有效成分，具有多種藥理活性。黃芪多糖最近已被用于治療骨質(zhì)疏松[4]。Li等[5]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能有效緩解去卵巢大鼠氧化應(yīng)激介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥，與其調(diào)節(jié)FoxO3a/Wnt2/β-catenin通路的抑制有關(guān)。此外，黃芪多糖通過減少骨吸收和抑制破骨細(xì)胞生成對小鼠卵巢切除致骨質(zhì)疏松癥小鼠的骨丟失具有保護(hù)作用[6]。

總之，黃芪多糖能夠抑制骨質(zhì)疏松癥，但黃芪多糖在GIOP中的作用尚未得到明確研究。PI3K/AKT/mTOR信號通路在包括GIOP在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮重要作用[7]。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，Lin等[9]發(fā)現(xiàn)抑制轉(zhuǎn)錄的沉默信息調(diào)節(jié)因子1激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，進(jìn)一步增強(qiáng)成骨細(xì)胞的自噬，從而保護(hù)成骨細(xì)胞。

本研究通過PI3K/AKT/mTOR信號通路探討黃芪多糖對GIOP的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要耗材

黃芪多糖(≥98%，美國Selleck Chemicals公司)；地塞米松磷酸鈉(北京索萊寶生物工程有限公司)；DMEM(南京森博生物科技有限公司)；胎牛血清(北京索萊寶生物工程有限公司)；β-甘油磷酸鈉、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、抗壞血酸(美國Sigma-Aldrich公司)；PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑LY294002(美國Selleck Chemicals公司)；CCK-8試劑盒(南京建成工程技術(shù)有限公司)；酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司)；堿性磷酸酶染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；單丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色溶液(北京索萊寶生物工程有限公司)；熒光顯微鏡(德國Leica公司)；Rapid Gold BCA試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；PVDF膜(美國Thermo Fisher公司)；一抗p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Beclin-1、p62和GAPDH以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗IgG(英國Abcam公司)；增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液、iBrightTMFL1500gel成像系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)；DXA小動物骨密度儀(中國上海冉哲儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 GIOP大鼠模型的建立

動物實(shí)驗(yàn)按照鄭州市骨科醫(yī)院倫理委員會關(guān)于實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)和使用的原則進(jìn)行，動物倫理審查號為：ZZSGKYY20190031。將60只體重(220±25)g、6～7周齡的SD雌性大鼠隨機(jī)分為5組。PBS組大鼠正常喂養(yǎng)，肌肉注射PBS緩沖液(與地塞米松磷酸鈉等量)；其他組大鼠以1 mg/kg的劑量每周兩次肌肉注射地塞米松磷酸鈉，建立GIOP模型[10]，在脛骨近端測量骨礦物質(zhì)密度(BMD)，以確認(rèn)模型已成功建立。大鼠常規(guī)喂養(yǎng)8周。然后，測量骨礦物質(zhì)密度。用戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉后處死大鼠，取所需組織。

1.3 含有黃芪多糖的血清制備

含有黃芪多糖的血清獲自GIOP大鼠。GIOP大鼠分為3組，分別以5、10、15 μmol/L的黃芪多糖灌胃，每天2次，連續(xù)3 d。第4天，在給藥后1 h后采集大鼠主動脈血樣(將大鼠麻醉并固定在平板上。腹部消毒，切開皮膚暴露腹主動脈。使用采血針采集動脈血。離心后收集血清，過濾，-80 ℃保存)。

1.4 成骨細(xì)胞分化

BM-MSCs獲自上海復(fù)盛實(shí)業(yè)有限公司并被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。傳代后將BM-MSCs接種到96孔板中，密度為1×104/cm2。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分主要包括DMEM，10-8mol/L地塞米松，20 mL/L胎牛血清，50 mmol/L β-甘油磷酸鈉、25 μL骨形態(tài)發(fā)生蛋白和50 μmol/L抗壞血酸。每4天更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在第15天和第25天進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色以鑒定成骨細(xì)胞。培養(yǎng)30 d后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)色和紫色顆粒時，認(rèn)為成骨細(xì)胞分化成功，取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究[16]。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

成骨細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)融合度達(dá)到80%～90%時，將成骨細(xì)胞以4×105個細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中。然后對細(xì)胞進(jìn)行處理，分為PBS組、模型組、黃芪多糖組、LY294002組、LY294002+黃芪多糖組。在PBS組中，PBS處理細(xì)胞作為對照。模型組細(xì)胞給予地塞米松(10-5mol/L)48 h。黃芪多糖(5、10、15 μmol/L)組在模型組細(xì)胞分別用含5、10、15 μmol/L黃芪多糖的血清培養(yǎng)48 h。在模型組治療的基礎(chǔ)上，LY294002組細(xì)胞用20 μmol/L PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑干預(yù)48 h。LY294002+黃芪多糖組的細(xì)胞用20 μmol/L的LY294002和15 μmol/L含黃芪多糖的血清處理48 h。

動物分組：PBS組(注射PBS緩沖液)；模型組(地塞米松肌注)；LY294002組(GIOP大鼠模型腹腔注射PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑LY294002)；黃芪多糖組(GIOP大鼠模型口服黃芪多糖20 g/kg)；LY294002+黃芪多糖組(GIOP大鼠模型肌注LY294002，黃芪多糖20 g/kg口服)。注射地塞米松磷酸鈉1 h后，LY294002組大鼠腹腔注射PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑，劑量為5 mg/(kg·d)[11]。黃芪多糖組大鼠口服黃芪多糖，劑量為20 g/(kg·d)[12-13]；LY294002+黃芪多糖組大鼠腹腔注射PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑，灌胃服用黃芪多糖。大鼠常規(guī)喂養(yǎng)并給藥8周。

1.6 CCK-8

連續(xù)干預(yù)48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，接種至96孔板，密度為5×103/孔。24 h后，更換新的DMEM培養(yǎng)基(含1% FBS)，每孔加入10 μL CCK-8溶液。孵育4 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度。

1.7 通過ALP染色檢測細(xì)胞分化能力

連續(xù)干預(yù)48 h后，通過5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate(BCIP)/Nitroblue tetrazolium chloride(NBT)ALP染色試劑盒檢測細(xì)胞分化。然后將處理過的細(xì)胞接種到96孔板中，用PBS洗滌3次并用多聚甲醛固定。再用PBS洗滌3次后，將細(xì)胞與BCIP/NBT染色液混合，避光孵育30 min。然后棄去染料溶液，用蒸餾水洗滌細(xì)胞以終止反應(yīng)。細(xì)胞用核固紅染色液孵育3 min，PBS洗滌后顯微鏡下觀察反應(yīng)。

1.8 MDC染色

干預(yù)48 h后，細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化1 min，然后接種到6孔板中。24 h后，將裝有細(xì)胞的板放入培養(yǎng)箱中避光30 min。離心后，將細(xì)胞用1×洗滌緩沖液重新懸浮。然后收集90 μL細(xì)胞懸液并與10 μL MDC染色溶液在暗室中混合30 min。將細(xì)胞在800 g中離心5 min，用1×洗滌緩沖液洗滌，然后重新懸浮。將細(xì)胞懸液滴在載玻片上并密封。使用熒光顯微鏡(在355 nm和512 nm)觀察染色結(jié)果。按照常規(guī)程序?qū)⒔M織制成石蠟切片，固定、包埋、脫水，然后按照試劑盒說明書進(jìn)行染色。

1.9 蛋白質(zhì)印跡

將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌，然后與細(xì)胞裂解液混合后在冰上完全裂解。離心后獲得蛋白質(zhì)樣品(組織樣品在含有蛋白酶抑制劑的緩沖溶液中切成片，然后在液氮中研磨。離心10 min后，收集上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn))。通過Rapid Gold BCA 試劑盒對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。在10% SDS-GAGE中分離蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。在5%脫脂牛奶中密封1 h后，將膜與靶向p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Beclin-1、p62和GAPDH一抗在4 ℃過夜；TBST洗3次后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗IgG孵育1 h。然后將膜與增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液一起孵育。使用iBrightTMFL1500gel成像系統(tǒng)和Image J軟件對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行灰度分析。結(jié)果顯示為目標(biāo)蛋白的灰度與內(nèi)參GAPDH的比值。

1.10 測量骨密度

大鼠脛骨骨密度采用DXA小動物骨密度儀測定。大鼠保持仰臥位，后肢向外旋轉(zhuǎn)。根據(jù)說明書掃描脛骨。

1.11 骨形態(tài)學(xué)分析

脛骨遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)通過微型CT(SkyScan 1272，Bruker，Germany)測量。分析骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨表面積與骨體積比(bone surface/bone volume，BS/BV)并繪制相應(yīng)圖表。具體操作按照CT操作手冊進(jìn)行。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析。每個實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組間的差異，采用單因素方差分析結(jié)合LSD-t檢驗(yàn)比較組間差異。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖和分化能力

通過CCK-8和ALP染色法評價成骨細(xì)胞的增殖和分化能力。結(jié)果顯示，與對照組相比，其余各組細(xì)胞增殖分化能力均降低(P<0.05)。此外，黃芪多糖治療組細(xì)胞增殖分化能力較模型組增強(qiáng)(P<0.05)。同時，隨著黃芪多糖用量的增加，細(xì)胞的增殖分化能力也增強(qiáng)，15 μmol/L處理的細(xì)胞增殖分化能力最強(qiáng)(圖1)。

圖1 不同組別黃芪多糖增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖和分化能力Fig.1 Astragalus polysaccharide enhances the proliferation and differentiation of osteoblasts注：與PBS組比較，*P<0.05；與模型組比較，^P<0.05。

2.2 黃芪多糖激活PI3K/AKT/mTOR信號通路

為進(jìn)一步探討黃芪多糖對成骨細(xì)胞的作用機(jī)制，采用Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，其他各組PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)，以及p-PI3k、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖治療組PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，而p-AKT、p-mTOR表達(dá)均升高(P<0.05)。此外，15 μmol/L黃芪多糖處理組增加最為明顯(圖2)。

圖2 黃芪多糖激活PI3K/AKT/mTOR信號通路Fig.2 Astragalus polysaccharide activates PI3K/AKT/mTOR signaling pathway注：與PBS組比較，*P<0.05；與模型組比較，^P<0.05。

2.3 黃芪多糖可能挽救了PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑的作用

如圖3所示，采用PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑進(jìn)一步探索黃芪多糖對成骨細(xì)胞的作用機(jī)制。與模型組相比，黃芪多糖處理組細(xì)胞增殖分化能力增強(qiáng)(P<0.05)，而LY294002組結(jié)果正好相反(P<0.05)。與LY294002組相比，LY294002+黃芪多糖處理組細(xì)胞增殖和分化能力也增強(qiáng)(P<0.05)，說明黃芪多糖部分逆轉(zhuǎn)了PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑的作用。

圖3 黃芪多糖可能挽救了PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑的作用Fig.3 Astragalus polysaccharide may rescue the effect of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitor注：與PBS組比較，*P<0.05；與模型組比較，^P<0.05；與15 μmol/L黃芪多糖組比較，#P<0.05；與LY294002組比較，&P<0.05。

2.4 黃芪多糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞自噬

自噬是維持成骨細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)的機(jī)制之一，因此還研究了黃芪多糖對成骨細(xì)胞自噬體形成以及自噬相關(guān)因子Beclin-1和p62表達(dá)的影響。MDC染色和Western blot結(jié)果顯示，與模型組相比，黃芪多糖處理組陽性細(xì)胞率升高，自噬體數(shù)量增加，Beclin-1表達(dá)升高，p62表達(dá)降低(P<0.05)。同時，與模型組相比，LY294002組陽性細(xì)胞率降低，自噬體數(shù)量減少，Beclin-1表達(dá)降低，p62表達(dá)升高(P<0.05)。與LY294002組相比，LY294002+黃芪多糖處理組的Beclin-1表達(dá)更高(P<0.05)。見圖4。

圖4 黃芪多糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞自噬Fig.4 Astragalus polysaccharide induces autophagy in osteoblasts注：與PBS組比較，*P<0.05；與模型組比較，^P<0.05；與15 μmol/L黃芪多糖組比較，#P<0.05；與LY294002組比較，&P<0.05。

2.5 黃芪多糖改善GIOP大鼠的骨質(zhì)疏松癥

建立GIOP大鼠模型，分析骨密度和骨形態(tài)。結(jié)果顯示，黃芪多糖處理組BMD、BS/BV、Tb.N、Tb.Th值高于模型組，Tb.Sp值低于模型組，LY294002組則相反(P<0.05)。與LY294002組相比，LY294002+黃芪多糖處理組上述指標(biāo)被逆轉(zhuǎn)，BMD、BS/BV、Tb.N、Tb.Th升高，Tb.Sp降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 黃芪多糖改善GIOP大鼠的骨質(zhì)疏松癥Fig.5 Astragalus polysaccharide relieves osteoporosis in GIOP rats注：與PBS組比較，*P<0.05；與模型組比較，^P<0.05；與黃芪多糖組比較，#P<0.05；與LY294002組比較，&P<0.05。

3 討論

黃芪多糖關(guān)節(jié)腔注射治療大鼠骨關(guān)節(jié)炎可促進(jìn)退變軟骨的修復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖干預(yù)可以緩解小鼠軟骨損傷，抑制了膝關(guān)節(jié)組織基質(zhì)金屬蛋白酶3和基質(zhì)金屬蛋白酶13水平，增加了蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達(dá)水平[14]。首先在細(xì)胞水平上分析了黃芪多糖的功能。結(jié)果表明，隨著黃芪多糖劑量的增加，成骨細(xì)胞的增殖、分化能力和堿性磷酸酶活性均增加，表明黃芪多糖具有治療GIOP的潛力。然后分析了黃芪多糖的相關(guān)機(jī)制。一些研究報道，地塞米松通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制成骨分化[15]。其他一些研究指出，CS-NPs通過激活mTOR/ULK1通路誘導(dǎo)自噬來促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[16]。本研究中，黃芪多糖處理后與PI3K/AKT/mTOR相關(guān)的磷酸化和蛋白的表達(dá)增加，說明黃芪多糖處理激活了PI3K/AKT/mTOR信號通路。此外，成骨細(xì)胞的增殖分化能力和堿性磷酸酶活性均被通路抑制劑抑制，而通路抑制劑的抑制作用被黃芪多糖部分逆轉(zhuǎn)。因此，筆者推測黃芪多糖通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化。

自噬是一種應(yīng)激防御機(jī)制，通過降解受損細(xì)胞和細(xì)胞器形成自噬體來維持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)[17]。據(jù)報道，自噬促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成和晚期成骨[18]。本研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞自噬被黃芪多糖促進(jìn)，而被PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑抑制。黃芪多糖治療部分逆轉(zhuǎn)了通路抑制劑對自噬的抑制作用。因此，本研究表明黃芪多糖通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞自噬。骨質(zhì)疏松癥的主要特征是骨骼中大孔和不完整的骨骼結(jié)構(gòu)，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了GIOP大鼠模型。骨密度測定和顯微CT顯示黃芪多糖治療后BMD、BS/BV、Tb.N、Tb.Th值升高，Tb.Sp值降低，進(jìn)一步證明黃芪多糖在GIOP中的作用。

綜上所述，黃芪多糖通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路、促進(jìn)成骨細(xì)胞自噬、促進(jìn)增殖分化、增加骨密度等對GIOP的治療具有價值。然而，該藥物的作用機(jī)制非常復(fù)雜。除了本研究中提到的機(jī)制外，黃芪多糖達(dá)到治療目的的其他機(jī)制也可能存在。因此，未來還將結(jié)合臨床病例進(jìn)一步探索其他機(jī)制。