基層獸醫(yī)常用的采樣監(jiān)測(cè)技術(shù)

黃平全，陳 林，王杜紅，鐘 飛，尹念春*

（1.四川省蓬溪縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 蓬溪 629100；2.四川省遂寧市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 遂寧 629000）

1 血清學(xué)樣品采集

血清學(xué)樣品主要包括全血樣品、抗凝血樣品以及血清樣品。

1.1 全血樣品采集 全血樣品主要用于分離制備血清并檢測(cè)血清中的抗體，常用來(lái)評(píng)價(jià)免疫效果。采集全血樣品前要了解畜禽健康狀況及免疫狀況，一般懷孕、發(fā)病畜禽不予采樣，畜禽免疫2～3周后方可采樣。采樣要嚴(yán)格遵守《動(dòng)物疫病采樣技術(shù)規(guī)范》（DB51/T 949-2018），按照適時(shí)、典型、無(wú)菌、適量和生物統(tǒng)計(jì)的原則進(jìn)行采樣。用于抗體檢測(cè)的全血樣品，一般家畜采集5～6 mL，家禽采集3～5 mL。用于病原學(xué)檢測(cè)的全血樣品，采集量可適當(dāng)減少一些。

家禽一般于翅下靜脈采血，用靜脈采血針配合真空采血管進(jìn)行采樣，其優(yōu)點(diǎn)是回血快速、不易溶血、不受外界污染，缺點(diǎn)是除保定人員外，一般還需一人配合將靜脈采血針的另一端插入到真空采血管中。也可用5 mL 一次性注射器進(jìn)行采樣，其優(yōu)點(diǎn)是方便快捷，缺點(diǎn)是將血液轉(zhuǎn)移到樣品采集管時(shí)，如操作不當(dāng)（如用力猛推），容易導(dǎo)致溶血。

采集豬全血樣品，小豬一般用5～10 mL注射器采集前腔靜脈血。大豬可用保定繩或保定桿保定后，采集前腔靜脈血，注意每采集一頭豬，要對(duì)保定繩或保定桿進(jìn)行消毒。在運(yùn)輸車上或者其他不方便對(duì)豬進(jìn)行保定的情況下，可用一次性三棱針或較粗大的針頭刺破耳靜脈，讓血液直接滴入采血管。每采集一頭豬，要更換一次三棱針或針頭。

羊一般用5 mL 注射器于頸靜脈采血。牛一般用三棱針或較粗大的針頭刺破耳靜脈，讓血液直接滴入采血管，也可用腕力瞬時(shí)將針頭刺入頸靜脈，再套上注射器抽取血液或直接用樣品采集管接取血液。在牛保定良好的情況下，可用帶短粗針頭的注射器在尾靜脈采血。采集牛全血時(shí)，要注意防止牛側(cè)踢傷人。

1.2 抗凝血樣品采集 抗凝血樣品采集方法與全血樣品相同，但是需要使用抗凝管。常用抗凝劑有乙二胺四乙酸（EDTA）、肝素、枸櫞酸鈉和草酸鈉等。

進(jìn)行非洲豬瘟監(jiān)測(cè)時(shí)，要使用含有EDTA 的無(wú)菌采血管，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。大豬采血需一豬一繩保定，繩用完銷毀，否則會(huì)傳播疫病。采樣人員要佩戴手套，采集一頭豬更換一副手套，并確保衣服不接觸豬的頭部。

1.3 血清分離制備 血清分離制備采用自然析出法，全血采集后，試管約45°傾斜放置，直到析出血清為止，中途不能變換傾斜角度，不能劇烈顛簸，不能置于0 ℃以下冷凍儲(chǔ)存。一般室溫下靜置0.5～2 h 即可析出血清，也可放在2～8 ℃冰箱中靜置，慢慢析出血清。

如急需檢測(cè)或在靜置下沒(méi)有析出血清，可采用離心分離法。離心轉(zhuǎn)速要適宜，不能過(guò)低，否則無(wú)法分離血清，轉(zhuǎn)速也不宜過(guò)高，否則易導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂而產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。離心機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)至2 500～3 000 r/min，離心2～3 min 即可分離出血清，沒(méi)有分離出血清的，可輕輕攪拌全血后再離心。離心時(shí)離心管要一對(duì)一對(duì)配平，對(duì)稱放置，保持對(duì)稱的兩邊重量大體一致，否則離心時(shí)離心機(jī)會(huì)發(fā)出刺耳的震動(dòng)聲，甚至導(dǎo)致離心機(jī)損壞。

2 病原學(xué)樣品采集

2.1 組織樣品采集 夏季應(yīng)在6 h 內(nèi)，冬季應(yīng)在24 h內(nèi)采集死亡畜禽的組織樣品。一般先采集肺臟、肝臟、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)等實(shí)質(zhì)臟器，再采集腸管、氣管等。采集的臟器組織塊放入無(wú)菌容器內(nèi)，每塊組織單獨(dú)放在無(wú)菌容器中，并注明采樣動(dòng)物名稱、采樣日期、采樣組織名稱等。組織樣品按要求采集，組織塊不能過(guò)大，也不能過(guò)小，一般采成1～2 cm3的小方塊為宜。

2.2 拭子樣品采集 禽類常采集咽喉拭子和泄殖腔拭子，采樣時(shí)將棉簽插入咽、腔捻轉(zhuǎn)2～3圈，兩個(gè)拭子一并置入盛0.8 mL 左右生理鹽水或0.01 M PBS（含雙抗）的1.5 mL離心管中。其他動(dòng)物拭子采集類似，環(huán)境拭子的采集要注意多點(diǎn)位、代表性。

2.3 家畜OP 液采集 家畜口蹄疫的病原學(xué)監(jiān)測(cè)需要采集OP液（食道咽部分泌物）。家畜采樣前禁食12 h以上（可適量飲水），避免采樣時(shí)胃內(nèi)容物返出污染OP液。

OP液探杯用前徹底消毒。家畜站立保定，打開口部，將消毒探杯伸入到食道上部，隨著吞咽動(dòng)作進(jìn)入，切勿用蠻力，避免插入氣管或造成食道咽部損傷。進(jìn)入后，在食道上部10 cm 左右輕輕反復(fù)移動(dòng)3 次，再將探杯拉出。若采集的樣品有胃內(nèi)污染物，需用清水或生理鹽水清洗家畜口腔后重新采樣。采樣后，將探杯采集到的OP 液倒入帶蓋的滅菌離心管中（離心管事前加入10 mL的PBS液，用PBS沖洗探杯并倒入離心管內(nèi)）。離心管密封、搖勻、編號(hào)后放入冷藏箱或冰箱中冷凍保存，盡快送檢，如不能及時(shí)送檢，應(yīng)置于-30 ℃冷凍保存。

探杯使用后徹底消毒，每頭家畜采樣后都要進(jìn)行清洗消毒，防止污染導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。應(yīng)經(jīng)常檢查探杯質(zhì)量，避免探杯斷裂進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)或探杯損壞對(duì)動(dòng)物造成損傷。

3 牛結(jié)核病監(jiān)測(cè)

牛結(jié)核病主要是由牛分枝桿菌引起的一種人畜共患慢性消耗性傳染病，奶牛的易感性較高。診斷牛結(jié)核病常采用結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，應(yīng)嚴(yán)格按照《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》（GB/T 18645-2020）進(jìn)行結(jié)核病監(jiān)測(cè)。出生20 d 的牛即可采用牛型PPD 進(jìn)行試驗(yàn)，皮內(nèi)注射時(shí)，斜直進(jìn)針后回抽針芯，若有回血，表明針頭刺入血管內(nèi)，此時(shí)應(yīng)稍拔針，不見(jiàn)回血時(shí)再注射結(jié)核菌素。注射應(yīng)緩慢，拔針后應(yīng)無(wú)液體滲出。陰性牛和疑似反應(yīng)牛于注射后96 h 和120 h再各觀察一次，以防個(gè)別牛出現(xiàn)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。判為可疑反應(yīng)的，42 d 后進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果仍為可疑或陽(yáng)性的，判為陽(yáng)性。

4 采樣注意事項(xiàng)

4.1 重視人員安全 開展采樣和牛結(jié)核病監(jiān)測(cè)工作時(shí)，人員要穿戴好口罩、乳膠手套、防護(hù)服、防護(hù)帽、膠靴等防護(hù)用品。開展布魯氏菌病等易通過(guò)氣溶膠傳播的動(dòng)物疫病的采樣監(jiān)測(cè)時(shí)還需戴上護(hù)目鏡。

穿防護(hù)用品務(wù)必按照以下步驟：戴口罩—戴帽子—穿防護(hù)服—戴防護(hù)眼鏡—穿鞋套或者膠鞋—戴手套。脫防護(hù)用品務(wù)必按照以下步驟：摘下防護(hù)眼鏡—脫掉防護(hù)服—摘下手套—脫掉帽子—脫掉膠鞋或鞋套—摘下口罩。規(guī)范使用防護(hù)服務(wù)器才能最大限度保障人員安全。樣品采集完成后，嚴(yán)格按照生物安全要求妥善處理相關(guān)污染物品，避免造成人畜感染和環(huán)境污染。

4.2 重視動(dòng)物福利 開展畜禽樣品采集和牛結(jié)核病監(jiān)測(cè)要規(guī)范操作，動(dòng)作輕柔，避免大力驅(qū)趕，暴力保定，減少對(duì)動(dòng)物的刺激。采血時(shí)可由養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）的飼養(yǎng)管理人員對(duì)動(dòng)物進(jìn)行保定，采血人員由側(cè)面逐漸靠近動(dòng)物，采血前輕摸動(dòng)物頭面部，安撫情緒，盡量讓動(dòng)物保持安靜，避免產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。進(jìn)行血清學(xué)樣品采集時(shí)，動(dòng)物保定一定要牢靠，小畜禽保定不牢靠，不容易采集到全血，大家畜保定不牢靠，不僅不易采到血，還容易導(dǎo)致人員受傷。采血完畢要及時(shí)壓迫止血，以免形成血腫。水禽采血后不要立即放入池塘，以防傷口感染。

4.3 規(guī)范操作 采樣務(wù)必要注意樣品的代表性、時(shí)效性和針對(duì)性，避免無(wú)效采樣、重復(fù)采樣。樣品采集，特別是病原學(xué)樣品采集要無(wú)菌操作，并做好樣品的運(yùn)輸和保存，確保樣品質(zhì)量。監(jiān)測(cè)牛結(jié)核病，牛的保定一定要牢靠，要特別注意人員安全，防止發(fā)生人員被撞傷、踩傷、壓傷等安全事故。注射結(jié)核菌素，拔針后有腫脹（突起），邊緣無(wú)明顯浸潤(rùn)、無(wú)藥液流出表明皮內(nèi)注射成功。最好由同一人測(cè)量皮褶厚度，以免結(jié)果出入較大。