廣西壯族自治區(qū)柳州市壯族高膽紅素血癥新生兒G6PD 缺陷及基因突變特點(diǎn)分析

劉艷萍 李可成 黃 婷 謝夢月 潘莉珍 陳大宇

1.廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院檢驗科，廣西柳州 545001；2.廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院遺傳科，廣西柳州 545001

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏癥是由于人體紅細(xì)胞表面膜的G6PD 被破壞，導(dǎo)致發(fā)生溶血的一種遺傳病證，該病存在一定的地域性與民族特異性[1]。新生兒如果患有這種病癥會增加高膽紅素血癥發(fā)生的可能，一旦患兒并發(fā)了高膽紅素血癥，黃疸水平會持續(xù)嚴(yán)重，如果不及時救治，發(fā)生膽紅素腦病概率較大[2]。為探究G6PD缺乏癥與高膽紅素血癥的關(guān)聯(lián)性，本研究回顧性分析廣西壯族自治區(qū)柳州地區(qū)353 例不同程度高膽紅素血癥的壯族患兒G6PD 活性及基因突變特點(diǎn)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018 年6 月至2021 年6 月廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院（以下簡稱“我院”）新生兒病區(qū)確診為高膽紅素血癥的壯族足月新生兒353 例為研究對象，年齡1～15 d，平均（7.26±1.38）d；男247 例，女106 例；疾病程度：重度76 例，中度119 例，輕度158 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①足月新生兒；②確診為高膽紅素血癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝炎病史；②合并梗阻性疾病史；③生理性黃疸。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批同意（20170221 032；快審-科研-2018-088）。

1.2 高膽紅素血癥診斷及分級評價標(biāo)準(zhǔn)

按照《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識》[3]，診斷及分級標(biāo)準(zhǔn)如下：

①診斷標(biāo)準(zhǔn)。已足月的新生兒符合以下情況之一的即可診斷為新生兒高膽紅素血癥：新生兒血清總膽紅素24 h 單位數(shù)值＞102.6 μmol/L，48 h 單位數(shù)值＞154 μmol/L，單位數(shù)值＞220.6 μmol/L（以間接膽紅素為主）＞3d；血清總膽紅素每天上升單位數(shù)值＞85 μmol/L；黃疸癥狀持續(xù)加重或黃疸超過兩周。②分級評價標(biāo)準(zhǔn)。新生兒血清總膽紅素170～256 μmol/L 為輕度高膽紅素血癥，＞256～342 μmol/L 為中度高膽紅素血癥，＞342 μmol/L 為重度高膽紅素血癥。

1.3 研究方法

1.3.1 血清總膽紅素檢測

血清總膽紅素檢測使用重氮法，儀器為美國Roche Modular DDP 全自動生化分析儀及配套試劑盒（批號：42553201）。

1.3.2 G6PD 活性分析

使用葡萄糖-6-磷酸底物定量法，儀器為美國Roche Cobas C702 全自動生化分析儀，試劑由北京利德曼公司提供（批號：20181210）。

1.3.3 G6PD 基因突變檢測

使用2019 年發(fā)布的《新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查與診斷實(shí)驗室檢測技術(shù)專家共識》[4]中推薦的G6PD 基因檢測手段—多色探針熒光PCR 熔解曲線法。試劑盒由廈門致善有限公司提供（試劑批號：18052001、19031501、20011101、20122001），檢測：c.95A＞G、c.383T＞C、c.392G＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A 等12 種在我國出現(xiàn)頻率較高的G6PD基因突變類型。

1.3.3.1 DNA 提取 采用廈門致善生物科技股份有限公司Lab-Aid 820 全自動核酸提取儀及配套的磁珠法核酸提取試劑盒對血濾紙片樣本進(jìn)行核酸提取。

1.3.3.2 多色探針熒光PCR 熔解曲線法檢測G6PD 基因突變 樣本需通過兩個PCR 體系進(jìn)行檢測，每個體系含四色熒光探針，根據(jù)靶序列與探針雜交體熔點(diǎn)的變化檢測G6PD 基因突變，可同時檢測中國人中常見的12 個位點(diǎn)的基因突變及對應(yīng)的野生型，PCR 擴(kuò)增結(jié)果分析在美國Bio-Rad CFX96 實(shí)時熒光PCR 儀完成。參照試劑盒說明書進(jìn)行樣本基因型判讀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示；相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)系數(shù)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 353 例高膽紅素血癥患兒G6PD 活性缺乏檢出率

353 例高膽紅素血癥患兒G6PD 活性缺乏86 例（24.36%），其中男67 例，女19 例。

2.2 353 例高膽紅素血癥患兒基因突變分析

353 例高膽紅素血癥患兒基因突變檢出率為32.29%（114/353）。其中，男性半合子占比為19%（70/353），女性純合子占比為1%（4/353），女性復(fù)合雜合子占比為2%（9/353），女性雜合子占比為8%（31/353）。高發(fā)突變位點(diǎn)為c.1388G＞A，其次為c.1376G＞T、c.95A＞G。復(fù)查雜合突變類型分別是c.1376G＞T/c.1388G＞A，c.95A＞G/c.1388G＞A、c.1004C＞A/c.1388G＞A、c.95A＞G/c.1024C＞T、c.95A＞G/c.1360C＞T、c.392G＞T/c.1360C＞T、c.517T＞C/c.871G＞A。見表1。高頻次突變類型熔解曲線見圖1。

圖1 G6PD 高頻次基因突變類型曲線圖

表1 353 例高膽紅素血癥患兒G6PD 突變位點(diǎn)檢測結(jié)果（次）

2.3 血清總膽紅素水平與G6PD 活性相關(guān)性

114 例G6PD 基因突變的患兒中，重度高膽紅素血癥占比為22%（26/114），中度占比為25%（29/114），輕度占比為51%（59/114）。總膽紅素水平與G6PD 活性呈負(fù)相關(guān)（r=-0.65，P＜0.05）。

3 討論

廣西壯族自治區(qū)是一個多民族相聚而居的地區(qū)，壯族人口占比超過1/3，民族人群G6PD 致病基因的種族異質(zhì)性表達(dá)與其他民族存在一定差別。研究顯示，廣西地區(qū)壯族人群G6PD 缺乏癥發(fā)病風(fēng)險高于非壯族人群[5-6]。在廣西百色及崇左地區(qū)，G6PD 缺乏癥在壯族人群中的發(fā)生率為各民族中最高[7-8]。

高膽紅素血癥在新生兒疾病中的占比非常高，它的發(fā)生可能由于多種因素導(dǎo)致，如果沒有及時診治重癥患者，會導(dǎo)致膽紅素腦病的發(fā)生，造成體內(nèi)各系統(tǒng)損害，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[9]。高膽紅素血癥對患兒的多臟器有很大程度損傷，對兒童的正常生長發(fā)育及地區(qū)人口素質(zhì)構(gòu)成有很大影響，G6PD 缺乏是其中最主要的病理因素之一。研究顯示，近1/3 的永久性神經(jīng)損傷都是G6PD 缺乏引起的[10]。

G6PD 基因定位于Xq28，基本構(gòu)成為12 個內(nèi)含子及13 個外顯子。G6PD 缺乏癥是X 染色體隱性遺傳疾病。其生理特點(diǎn)參與到旁路代謝途徑，提供還原型輔酶Ⅱ，可維持人體血紅蛋白及紅細(xì)胞膜的相對平衡[11-12]。在不同地區(qū)的不同種族中，G6PD 基因突變存在一定差別。數(shù)據(jù)顯示，正常人群G6PD 缺乏癥在兩廣地區(qū)發(fā)生率較高，主要是地域性因素導(dǎo)致，廣東潮州、珠海、江門，廣西欽州等地發(fā)病率為3.36%～10.18%[13-16]。而在新生兒高膽紅素群體中，G6PD 缺乏癥的發(fā)生率比正常人群高。本研究結(jié)果顯示，353 例高膽紅素血癥患兒基因突變檢出率為32.29%，比成都地區(qū)（15.33%）、廈門地區(qū)（17.35%）高[17-18]。本研究結(jié)果顯示，353 例高膽紅素血癥患兒G6PD 高頻次突變類型依次是c.1388G＞A、c.1376G＞T、c.95A＞G，與國內(nèi)相關(guān)報道[19-22]存在一定差別。G6PD 基因的編碼產(chǎn)物單體由515 個氨基酸組成，外顯子的錯義突變造成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物異常，進(jìn)而改變氨基酸序列，是影響酶活性的最常見原因。本研究中高頻次的3 種突變類型均屬于該結(jié)果，但不同突變基因型與酶活性臨床表型的相關(guān)程度，還需要進(jìn)行更深研究如蛋白功能實(shí)驗。

因新生兒的出生多伴隨生理性黃疸，而患有G6PD缺乏癥的新生兒常常會與之混淆，如果將此類型的黃疸視為生理性黃疸，那么高膽紅素血癥發(fā)生的風(fēng)險將會增大[23]。雖然因G6PD 缺乏導(dǎo)致的高膽紅素血癥發(fā)生的概率只占一小部分[24]，但其是新生兒腦損傷發(fā)生的一個很重要的病理因素，臨床中預(yù)防新生兒膽紅素腦病是新生兒黃疸診療工作的重點(diǎn)。而對于高膽紅素血癥的診療，首要是監(jiān)測血清膽紅素的水平是否持續(xù)降低[25]。本研究結(jié)果顯示，總膽紅素與G6PD 活性呈負(fù)相關(guān)。臨床在治療疾病過程中，應(yīng)同時結(jié)合G6PD 突變位點(diǎn)、酶活性及膽紅素動態(tài)水平的評估，及時處置疾病，可預(yù)防嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生[26]。

綜上，G6PD 缺乏癥在廣西壯族自治區(qū)柳州市存在高發(fā)病率，壯族人群的民族異質(zhì)性在G6PD 缺乏癥中的表達(dá)比較明顯，因此壯族聚居地區(qū)，在診療高膽紅素血癥過程中，檢測新生兒的G6PD 活性和基因突變位點(diǎn)是非常有必要的，其不僅可以提前預(yù)防新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生，而且對膽紅素腦病發(fā)病率的降低也很有幫助，對提升本地區(qū)人口素質(zhì)具有指導(dǎo)性意義。