肺泡灌洗液宏基因組對重癥支原體肺炎患兒的診斷和治療分析

宋延剛 陳雪 孫合圣

肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）是一種常見的病原微生物，10%～40%的兒童社區(qū)獲得性肺炎病例由MP引起[1]。近年來，支原體引起的重癥肺炎呈逐漸增多趨勢，且常有其他細菌、病毒及真菌的混合感染，易合并多種肺外系統(tǒng)受累等嚴重并發(fā)癥[2]。特別是在患兒中，支原體及多種病菌的檢出率和檢出度至關(guān)重要。為提高該效率，本研究對重癥肺炎支原體肺炎患兒進行肺泡灌洗液病原學(xué)宏基因檢測及病原體檢測；兩組患兒在常規(guī)病原學(xué)檢測的基礎(chǔ)上給予纖維支氣管鏡灌洗病原學(xué)宏基因檢測及病原體檢測。根據(jù)檢測結(jié)果給予針對病原體的相應(yīng)治療。選取2020年4月—2021年4月于陽光融和醫(yī)院兒科住院患兒300例重癥支氣管肺炎患兒，探討纖維支氣管肺泡灌洗液宏基因組分析對重癥支原體肺炎患兒治療的診斷價值并進行治療分析。通過肺泡灌洗聯(lián)合宏基因組分析提高肺炎支原體所致嚴重肺炎檢出率，提高臨床癥狀的改善率和不良反應(yīng)發(fā)生率。文章的研究結(jié)果為重癥支原體肺炎患兒的診斷和治療后期標準制定提供了借鑒內(nèi)容。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年4月—2021年4月于陽光融和醫(yī)院兒科住院，臨床癥狀、體征及胸部X線均符合第7版《諸福棠實用兒科學(xué)》[3]中重癥肺炎診斷標準的患兒為研究對象，患兒監(jiān)護人簽署知情同意書。本研究由醫(yī)院倫理委員會批準開展。排除標準：（1）既往有先天性心臟病、先天性呼吸道疾病或免疫功能低下等基礎(chǔ)疾病的患兒。（2）對阿奇霉素過敏或者頭孢曲松過敏的患兒。（3）入院前已經(jīng)應(yīng)用免疫球蛋白、激素等治療的患兒。選取300例進入本研究，患兒年齡為0～14歲，其中男142例，女158例。全部病例在無差異的吸痰、霧化支持等綜合治療措施的基礎(chǔ)上進行隨機分組，觀察組150例患兒行肺泡灌洗液（metagenomics next generation sequencing，mNGS）+免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）檢測，對照組150例患兒行血清支原體IgM抗體檢測?；純夯九R床信息，兩組患兒年齡、性別比例、血常規(guī)（white blood cell count，WBC）、C- 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CPR）及血清鐵指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可對比，見表1。IgM抗體一般在感染后4～5 d出現(xiàn)，3～4周后達到高峰，持續(xù)1～3個月甚至更長，可作為近期感染的診斷標準。

表1 兩組患兒一般資料比較

1.2 方法

兩組全部患兒均進行常規(guī)治療，應(yīng)用頭孢曲松鈉（中國臺灣泛生制藥廠股份有限公司，國藥準字：HC20150030，2.0 g）60～ 80 mg/（kg·d），1次 /d靜脈滴注。在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，觀察組mNGS檢測陽性患兒和對照組IgM檢測陽性患兒給與阿奇霉素（美國Pfizer Inc.，國藥準字：H20140685，規(guī)格：0.5 g）靜脈滴注 10 mg/（kg·d），1次/d，共5 d一療程，停4 d后給予第二療程。入院時抽取患兒3 mL空腹靜脈血，2 h內(nèi)進行檢測，采用膠體金MP-IgM試劑盒（珠海麗珠試劑有限公司，50人份/盒）進行檢測。陽性檢測線出現(xiàn)，則該患兒為支原體IgM抗體陽性。

對照組行IgM抗體檢測及病原體檢測；觀察組行IgM+纖維支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)：在對照組基礎(chǔ)上，在征得患兒家長的同意，并給予完善的告知及知情的情況下，給予纖維支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)進行診斷，同時給予完善宏基因檢測及病原體檢測。

肺泡灌洗液病原體mNGS檢測：纖維支氣管肺泡灌洗液采集由臨床醫(yī)生按光學(xué)纖維支氣管鏡操作規(guī)程進行。患兒局麻后，纖維支氣管鏡被插入左肺舌段的支氣管，頂端在支氣管分支開口，緩慢加入37℃滅菌生理鹽水，每次40 mL，總量200 mL。注液后以-13.3～-19.95 kPa（-100～-150 mmHg）負壓吸出。兒科患兒只能灌入1.5 mL/kg，兒童的回收量約為10 mL；最后從回收液中取出3 mL以上樣本，放入無菌管中，旋緊蓋子，即刻送檢進行常規(guī)病原體檢測和mNGS檢測。提取DNA，通過DNA片段化，末端修復(fù)，接頭連接和PCR擴增構(gòu)建DNA文庫，然后進行測序。在mNGS分析中，使用TIANamp Micro DNA試劑盒（TIANGEN，DP316）按照說明書直接從300 μL樣本中提取DNA。提取的DNA經(jīng)超聲破碎，得到200～300 bp的片段。DNA文庫通過末端修復(fù)接頭構(gòu)建，并對提取的DNA進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增。在高通量二代測序儀（BGISEQ-100，華大基因平臺上測序的DNA文庫使用Agilent 2100進行質(zhì)量控制。去除低質(zhì)量和短（長度＜35 bp）讀數(shù)，將測序數(shù)據(jù)與人類參考基因組（hg19）進行比對，以使用Burrows-Wheeler比對去除人源序列。其余數(shù)據(jù)通過同時比對四個微生物基因組數(shù)據(jù)庫進行分類，包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲。

兩組患兒均根據(jù)病原菌進行治療，低熱患者給予物理降溫，高熱患兒進行退熱處理，同時通過補鉀藥物糾正鉀含量。針對不同并發(fā)癥，進行對癥治療。

1.3 觀察指標

IgM值超過1.1 AU/mL則患兒屬于陽性，治療過程中記錄退熱平均時間，咳嗽消退時間，胸部影像好轉(zhuǎn)時間，平均住院時間，肺外并發(fā)癥發(fā)病率，降鈣素原（procalcitonin，PCT），C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）和白細胞介素（interleukin-1，IL-1）水平。同時，本研究臨床療效指標包括通過臨床觀察和患兒反饋記錄不良反應(yīng)，包括消化系統(tǒng)（嘔吐、腹瀉）、血液系統(tǒng)（貧血、血小板減少）、心血管系統(tǒng)（心慌、胸悶）、神經(jīng)系統(tǒng)（頭疼、抽搐）、皮膚黏膜損害（皮膚紅疹、口腔潰瘍）和其他（關(guān)節(jié)疼痛）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清IGM抗體檢測與肺泡灌洗液mNGS對比分析

已納入300例重癥肺炎患兒，對照組150例患兒行血清支原體IgM抗體檢測，其中陽性患兒共109例。觀察組150例患兒行肺泡灌洗液mNGS檢測，mNGS肺炎支原體陽性患兒共120例，檢出率為80%，對照組、觀察組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），觀察組中mNGS肺炎支原體陽性與陰性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），比例均高于IgM抗體檢出率，見表2。

表2 血清IGM抗體檢測與肺泡灌洗液mNGS對比分析[例（%）]

2.2 mNGS病原體檢出結(jié)果

兩組患者150例全部進行病原體檢測，兩組無差異。通過對肺泡灌洗液樣本的mNGS檢測，觀察組共檢測出20例混合病原感染。相比于對照組常規(guī)病原體檢測，mNGS檢出率高，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。mNGS病原體檢測及常規(guī)病原體檢測結(jié)果見表3。

表3 mNGS病原體與常規(guī)病原體檢出結(jié)果[例（%）]

2.3 療效比較

根據(jù)血清IgM抗體檢測，肺泡灌洗液mNGS和病原體檢出結(jié)果制訂個體化治療方案，患兒治療后，記錄兩組患兒的臨床療效。觀察組患兒退熱平均時間、咳嗽消退時間、肺部影像好轉(zhuǎn)時間、平均住院時間，相比于對照組均顯著縮短，見表4。治療前，觀察組和對照組，CRP和IL-1指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，PCT，CRP和IL-1指標均顯著降低，觀察組和對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表4 兩組患兒臨床療效比較（）

表4 兩組患兒臨床療效比較（）

平均住院時間（d）觀察組 150 2.9±0.8 5.6±0.5 12.0±2.0 8.8±1.7對照組 150 4.1±0.9 8.3±0.7 15±5 11.7±2.1 t值 - 12.205 38.441 6.823 13.146 P值 - ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001組別 例數(shù) 退熱平均時間（h）咳嗽消退時間（d）胸部影像好轉(zhuǎn)時間（d）

表5 兩組患兒治療前及治療后血清PCT、CRP、IL-1水平比較（）

表5 兩組患兒治療前及治療后血清PCT、CRP、IL-1水平比較（）

組別 例數(shù) PCT （ng/mL） CRP（mg/L） IL-1（pg/mL）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后觀察組 150 0.47±0.17 0.14±0.06 28.15±4.72 12.31±5.46 66.75±26.84 26.97±10.78對照組 150 0.45±0.21 0.19±0.03 27.97±5.13 15.63±5.33 65.49±28.14 31.23±12.35 t 值 - 0.907 9.129 0.316 5.239 0.397 3.183 P值 - 0.365 ＜ 0.001 0.752 ＜ 0.001 0.692 0.002

2.4 患兒肺外并發(fā)癥情況

兩組嚴重支原體肺炎患兒均發(fā)生不同程度的肺外并發(fā)癥。其中，消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)病率較高，其次是神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚黏膜系統(tǒng)和其他并發(fā)癥。其中，一些患兒發(fā)生多種肺外并發(fā)癥。觀察組的整體發(fā)病率低于對照組（P＜0.05），見表6。

表6 兩組患兒肺外并發(fā)癥情況比較[例（%）]

3 討論

肺炎支原體不僅是學(xué)齡期和學(xué)齡前期兒童肺炎常見病原，在1～5歲兒童中亦不少見[4]。肺炎支原體感染占社區(qū)獲得性肺炎的10%～40%，一年四季均有病例出現(xiàn)，流行具有周期性，每4～7年在不同地區(qū)出現(xiàn)發(fā)病率高峰[5]。重癥肺炎患兒具有起病和進展速度快，相關(guān)病原體情況復(fù)雜，因此診斷時間是治療重癥肺炎的重要因素[6]。當前診斷的局限性在于結(jié)果的延遲使醫(yī)護人員無法做出正確的醫(yī)療決定[7]。宏基因組二代測序（mNGS）是一種新型微生物檢測技術(shù)，直接從感染樣本中的提取核酸進行高通量測序，獲得有關(guān)可疑病原體種類的信息，mNGS 以公正的方式檢測細菌、真菌、病毒、寄生蟲和其他病原體。張弦等[8]研究納入21例患兒，mNGS檢出陽性病原體18例次，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)僅發(fā)現(xiàn)2次白色念珠菌，病原體數(shù)量和種類明顯多于傳統(tǒng)培養(yǎng)，此外，mNGS可以檢測血液培養(yǎng)無法檢測到的“不可培養(yǎng)”細菌、微量細菌和病毒，有望提高樣本中病原體的檢出率[9-10]。mNGS 提供更多菌株特定信息，有助于識別新病原體，并可能有助于追蹤和控制疫情[11]。另外，mNGS檢測結(jié)果受抗菌藥物的影響較小，因此，在治療過程中mNGS結(jié)果對用藥情況的調(diào)整依然具有較好的指導(dǎo)作用[12]。

支氣管肺泡灌洗技術(shù)取材病變部位更加精準，敏感性高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，在兒童肺炎支原體肺炎的診斷及治療中有常規(guī)診斷技術(shù)及傳統(tǒng)治療不可比擬的優(yōu)勢，并且安全可靠，患兒痛苦少[13]?？煽焖儆行У厍宄潞粑鲤こ矸置谖锛坝泻Φ牟≡⑸?，改善氣道阻塞，減少肺不張等并發(fā)癥的發(fā)生，減輕病原的損害，阻斷了部分的免疫反應(yīng)；縮短肺炎吸收時間。對于支原體肺炎患兒氣道分泌物的清除，MP患兒伴有肺不張、塑形性支氣管炎等并發(fā)癥的治療療效顯著[14-15]。

本研究中，對照組150例患兒行血清支原體IgM抗體檢測，其中陽性患兒共109例。觀察組150例患兒行肺泡灌洗液mNGS檢測，mNGS肺炎支原體陽性患兒共120例，檢出率為80%，且通過對肺泡灌洗液樣本的mNGS檢測，觀察組共檢測出20例混合病原感染，顯著高于對照組9例，與WANG等[16]的研究基本吻合。根據(jù)纖維支氣管肺泡灌洗液宏基因組分析對重癥支原體肺炎患兒的個體化治療方案并實施后，觀察組患兒退熱平均時間，咳嗽消退時間，肺部影像好轉(zhuǎn)時間，平均住院時間為均顯著縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療前，觀察組和對照組PCT，CRP和IL-1指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，PCT，CRP和IL-1指標均顯著降低，觀察組和對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組的肺外并發(fā)癥發(fā)病率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此，纖維支氣管肺泡灌洗液宏基因組分析對重癥支原體肺炎患兒治療可能有積極的臨床意義，但限于條件限制及樣本數(shù)量較少，且為單中心研究，尚需進一步的臨床研究證實mNGS及耐藥檢測對重癥支原體肺炎患兒治療的臨床價值。

綜上所述，纖維支氣管肺泡灌洗液宏基因組分析檢出率高，準確度高，對重癥支原體肺炎患兒治療有臨床指導(dǎo)意義。