大豆磷鐵養(yǎng)分脅迫響應(yīng)的FER基因鑒定及FER1緩解鐵毒作用

吳麗霞，歐斯艷，麥翠珊，黃麗雅，張亞楠，鄧雅茹，李方劍，王金祥

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)根系生物學(xué)中心 / 廣東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村污染治理與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510642）

鐵是植物必需的微量元素，但細(xì)胞內(nèi)鐵的含量過(guò)高，則會(huì)因鐵的強(qiáng)氧化能力產(chǎn)生氧化脅迫[1]，因此鐵的吸收和利用必須精確調(diào)控，才能維持植物細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)。雙子葉植物如擬南芥 (Arabidopsis thaliana)和番茄 (Solanum lycopersicum)采用機(jī)制Ⅰ進(jìn)行鐵吸收，三價(jià)鐵被還原為二價(jià)鐵后通過(guò)根細(xì)胞膜上的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)子進(jìn)入根細(xì)胞；在低鐵環(huán)境下通過(guò)增加根的還原能力，促進(jìn)質(zhì)子的外排和還原劑的釋放，促進(jìn)鐵的吸收[2]。番茄轉(zhuǎn)錄因子Fer是最早被鑒定的關(guān)鍵鐵營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)因子，它是一個(gè)細(xì)胞核定位的bHLH蛋白[3]。Fer在番茄根尖的表達(dá)不依賴(lài)于鐵的供應(yīng)，其在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)番茄根的發(fā)育和生理進(jìn)而調(diào)節(jié)鐵營(yíng)養(yǎng)。FER-LIKE IRON DEFICIENCYINDUCED TRANSCRIPTION FACTOR (FIT)是擬南芥鐵信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)IT與bHLH38/39/100/101互作而調(diào)控下游缺鐵響應(yīng)基因FERRIC REDUCTION OXIDASE2 (FRO2)、IRON-REGULATED TRANSPORTER1 (IRT1)的表達(dá)[4]。

FERRITIN (FER)是一類(lèi)保守的鐵蛋白，F(xiàn)ER對(duì)維持鐵離子的穩(wěn)態(tài)以及鐵代謝起重要作用[5]。動(dòng)物FER蛋白一般位于細(xì)胞質(zhì)，而植物FER蛋白一般定位于質(zhì)體和線(xiàn)粒體[6]。擬南芥含有4個(gè)FER基因(AtFER1～AtFER4)，擬南芥FER基因受過(guò)量鐵、H2O2、冷害以及ABA誘導(dǎo)表達(dá)，在其啟動(dòng)子區(qū)域存在鐵響應(yīng)元件 (IDS)[7]。敲除擬南芥FER1可導(dǎo)致葉片在光照條件下早衰，以及光合效率下降和葉綠素降解[8]。AtFER4位于線(xiàn)粒體，但fer4突變體表型和野生型沒(méi)有差別，對(duì)鐵毒、鹽害、冷害和百草枯處理引起的氧化脅迫沒(méi)有作用[6]。AtFER1、AtFER3、AtFER4在根、葉均快速 (6 h)受鐵誘導(dǎo)表達(dá)，尤其是 AtFER1；與野生型相比，在 500 μmol/L Fe (Ⅲ)-EDTA培養(yǎng)條件下，擬南芥fer1-3-4三突變體根積累的鐵明顯少[9]。FER蛋白不僅作為一種鐵貯藏蛋白，還參與保護(hù)植物，避免因過(guò)量鐵導(dǎo)致的氧化脅迫。在正常鐵營(yíng)養(yǎng)條件下，fer1-3-4三突變體根部過(guò)氧化氫酶 (catalase， CAT)活性和野生型沒(méi)有差別，但在過(guò)量鐵條件下，fer1-3-4和野生型擬南芥根部CAT活性增加，但fer1-3-4突變體CAT活性增加幅度比野生型多40%[9]。超表達(dá)FER基因可增強(qiáng)葡萄(Vitis vinifera)耐受非生物脅迫的能力[10]。超表達(dá)小麥 (Triticum aestivum L.) FER-5B 可以增強(qiáng)小麥的耐熱能力和清除ROS相關(guān)的非生物脅迫逆境耐受能力[11]。用水稻 (Oryza sativa)種子貯藏蛋白 (Glutelin promoter, GluB-1)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)大豆 (Glycine max)FERRITIN基因在水稻表達(dá)，提高水稻種子鐵含量[12]。大豆SFerH1 和 SFerH2可形成異源多聚體，大豆Ferritin基因表達(dá)可提高鳳梨 (Ananas Mill)鐵和鋅的含量，以及酵母 (Saccharomyces cerevisiae)鐵的含量[13–14]。大豆 FER 基因受 100 μmol/L 檸檬酸鐵誘導(dǎo)表達(dá)，大豆FER基因的表達(dá)量在種子發(fā)育早期積累,后期表達(dá)量下降[15]。在煙草 (Nicotiana tabacum)超量表達(dá)大豆FER基因 (Glyma.18g205800)提高煙草耐低鐵能力，增加轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量和過(guò)氧化物酶 (peroxidase，POD)活性[16]。

我國(guó)南方酸性土常存在有效磷含量低，pH偏低以及鐵含量過(guò)高的問(wèn)題，因此南方大豆需適應(yīng)低磷和鐵過(guò)量的雙重脅迫。磷鐵營(yíng)養(yǎng)間存在相互作用，酸性土壤中鐵含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致土壤有效磷含量降低；磷的存在也會(huì)影響鐵的有效性，從而影響鐵響應(yīng)基因的調(diào)節(jié)。水稻葉子缺鐵失綠只在磷供給充分的條件下出現(xiàn)[17–18]。水稻 HRZs (Hemerythrin Motif-Containing Really Interesting New Gene and Zinc-Finger Protein1) 是磷鐵營(yíng)養(yǎng)互作的節(jié)點(diǎn)。低鐵誘導(dǎo)E3酶基因HRZ 表達(dá)，HRZ與水稻磷信號(hào)關(guān)鍵成員PHR2互作促進(jìn)PHR2在K319和K328的泛素化，進(jìn)而促進(jìn)PHR2的降解；另一方面，水稻PHR負(fù)調(diào)控HRZ的轉(zhuǎn)錄[19]。因此PHR/HRZ是調(diào)控水稻磷鐵營(yíng)養(yǎng)及平衡的關(guān)鍵成員。Aluminum Sensitive3 (ALS3) 基因突變導(dǎo)致擬南芥在低磷條件下根系積累Fe3+，其主根生長(zhǎng)對(duì)低磷過(guò)敏感[20]。LPR1 (Low Phosphate Root1)和 lpr2 (Low Phosphate Root1)編碼鐵氧化酶(ferroxidase)，lpr1和lpr2突變體對(duì)低磷不敏感，根系積累較少的鐵；遺傳分析證明，ALS3 和LPR1/2在一個(gè)信號(hào)通路[21]。近年來(lái)的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，植物FER基因表達(dá)水平受磷水平調(diào)節(jié)[17]。這暗示FER基因可能在磷鐵互作方面起作用。

雖然對(duì)擬南芥FER基因的研究和了解較多，但對(duì)大豆FER基因的研究還不深入。本研究以大豆為試驗(yàn)材料進(jìn)行分析，旨在為今后深入研究大豆FER功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采用的大豆品種為粵春03-3 (YC03-3)，擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型 (Columbia-0，Col-0)。

1.2 研究方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 以4個(gè)擬南芥FER蛋白的氨基酸序列為參考，在植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome網(wǎng)站 (https://phytozome-next.jgi.doe.gov)對(duì)大豆(Glycine max Wm82.a2.v1)蛋白質(zhì)組進(jìn)行BLASTP比對(duì)，比對(duì)矩陣為BLOSUM62，E值設(shè)定為1e-25；結(jié)合保守的FER 結(jié)構(gòu)域 (PF00210)分析，獲得大豆FER基因及其編碼蛋白序列。以大豆、擬南芥(Arabidopsis thaliana TAIR10)、水稻 (Oryza sativa v7.0)、玉米 (Zea mays B84 v1.2)、番茄 (Solanum lycopersicum ITAG4.0)、馬鈴薯 (Solanum tuberosum v6.1)等作物蛋白質(zhì)組的FER蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)，使用軟件MEGA X，用最大似然法重建植物FER蛋白進(jìn)化樹(shù)，bootstrap值設(shè)定為100。

1.2.2 定量PCR 根據(jù)大豆基因組以及轉(zhuǎn)錄組序列，用PerlPrimer程序設(shè)計(jì)特異的GmFER定量PCR引物 (表1)。按照常規(guī)的定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，并計(jì)算GmFER的相對(duì)表達(dá)水平，內(nèi)參基因?yàn)镚mEF1a (Glyma.17G186600)。定量PCR儀器為實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 (Applied Biosystems 7500，F(xiàn)oster City，USA)。

表1 載體構(gòu)建及定量PCR相關(guān)引物Table 1 Vector construction and primers used for quantitative PCR

1.2.3 GmFER1超表達(dá)載體構(gòu)建及GmFER1啟動(dòng)子報(bào)告基因載體構(gòu)建 根據(jù)GmFER1的cDNA序列，利用引物擴(kuò)增GmFER1的ORF，然后按照基于重組克隆 (gateway clone)的方法構(gòu)建pMDC32-GmFER1超表達(dá)載體，35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GmFER1的表達(dá)。

擴(kuò)增GmFER1的啟動(dòng)子序列，通過(guò)重組克隆的方法，利用pMDC162載體構(gòu)建proGmFER1::GUS的報(bào)告載體。測(cè)序無(wú)誤后，按常規(guī)分子生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌。

1.2.4 大豆的培養(yǎng)及養(yǎng)分脅迫處理 采用砂培法進(jìn)行大豆YCO3-3種子催芽。當(dāng)種子萌發(fā)到兩片初生葉(子葉)已完全展開(kāi)，第一片三出復(fù)葉還沒(méi)有完全打開(kāi)、主根長(zhǎng)為8～10 cm時(shí)，選擇正常、長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。

待第一片三出復(fù)葉完全展開(kāi)而第二片三出復(fù)葉未完全展開(kāi)時(shí)，對(duì)幼苗進(jìn)行如下處理：正常磷(NP， 500 μmol/L KH2PO4)、低磷 (LP， 25 μmol/L KH2PO4)、正常鐵 (NF，50 μmol/L Fe-EDTA)、高鐵(HF，500 μmol/L Fe-EDTA)、其中正常磷和正常鐵的營(yíng)養(yǎng)液成分相同。每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。經(jīng)過(guò)14天的長(zhǎng)期處理后采樣，液氮冷凍，?80℃保存。

1.2.5 擬南芥的轉(zhuǎn)化與篩選 用花序浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥[22]，得到單拷貝插入轉(zhuǎn)基因T3代純合材料后，提取轉(zhuǎn)基因材料蓮座葉RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量PCR，確定GmFER1的轉(zhuǎn)錄水平。內(nèi)參基因?yàn)閿M南芥 AtEF1a (At1g07940)。

1.2.6 啟動(dòng)子活性分析 構(gòu)建proGmFER1::GUS的報(bào)告載體后，轉(zhuǎn)化擬南芥，通過(guò)潮霉素篩選獲得單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因材料。對(duì)植株進(jìn)行GUS染色，在立體顯微鏡下觀察拍照，分析啟動(dòng)子活性。

1.2.7 超表達(dá)GmFER1株系的表型分析 對(duì)擬南芥進(jìn)行正常鐵 (50 μmol/L) 和鐵毒處理 (500 μmol/L)。將成熟飽滿(mǎn)的Col-0與兩個(gè)超表達(dá)GmFER1擬南芥株系 (OE-1、OE-9)種子分別播種于含有正常營(yíng)養(yǎng)的1/2 MS培養(yǎng)基上，放置在4℃低溫層積處理2天，然后將其轉(zhuǎn)移到人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，光照/黑暗周期為16 h/8 h，溫度周期為23℃/21℃，光照強(qiáng)度為 100 μmol/(m2·s)，相對(duì)濕度為 70%。3 天后分別挑選若干株長(zhǎng)勢(shì)一致的野生型與超表達(dá)GmFER1擬南芥幼苗于鐵毒培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3次重復(fù)，生長(zhǎng)7天后收樣，測(cè)定相關(guān)根系指標(biāo)，在體視鏡下統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)目。取6株擬南芥苗稱(chēng)重，測(cè)量Col-0與超表達(dá)GmFER1擬南芥 (OE-1)在正常鐵與鐵毒條件培養(yǎng)10天后的鮮重。參照文獻(xiàn)[23]中的方法，用80%丙酮提取葉片的葉綠素，分別在645 nm與663 nm下測(cè)定光吸收值，計(jì)算葉片的總?cè)~綠素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆基因組FER基因的鑒定

2.1.1 生物信息學(xué)分析 基于大豆蛋白質(zhì)組序列(https://phytozome-next.jgi.doe.gov)，以擬南芥4個(gè)FER蛋白的氨基酸序列為種子序列，進(jìn)行迭代BLASTP 比對(duì), 結(jié)合保守的 FER 結(jié)構(gòu)域 (PF00210)分析篩選，確定大豆基因組存在12個(gè)FER基因，命名為GmFER1～GmFER12 (表2)。根據(jù)其編碼的GmFER氨基酸序列，用ProtParam程序 (http://www.expasy.org/tools/protparam.html)分析其相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成和等電點(diǎn) (PI)。大豆FER蛋白的氨基酸數(shù)目范圍為89～265，其中GmFER2、GmFER5和GmFER10氨酸酸數(shù)目較少，分別為136、89、141個(gè)；除GmFER3外，其他GmFER等電點(diǎn)都小于6(表 2)。

根據(jù)GmFERs的氨基酸序列，用PSORT網(wǎng)址(https://psort.hgc.jp)預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位。發(fā)現(xiàn)GmFER1、GmFER3、GmFER4、GmFER6、GmFER8、GmFER9、GmFER11、GmFER12的蛋白定位在葉綠體，GmFER5和GmFER10定位在細(xì)胞質(zhì)，GmFER2定位在細(xì)胞核，GmFER7定位在線(xiàn)粒體基質(zhì)中 (表2)。

表2 大豆FER基因家族及編碼蛋白信息Table 2 SoybeanFER gene family andencoded proteininformation

從Phytozome網(wǎng)站下載GmFER家族的氨基酸序列與基因啟動(dòng)子序列。用MEME Suite (https://memesuite.org/meme/index.html)預(yù)測(cè)GmFER家族序列中的保守基序 (Motif)，發(fā)現(xiàn)GmFER1、GmFER3、GmFER4、GmFER6、GmFER7、GmFER8、GmFER9、GmFER11、GmFER12均具有3個(gè)保守基序，而GmFER2只有兩個(gè)保守基序，GmFER5、GmFER10只有一個(gè)保守基序 (圖1a)。我們用T-coffee程序?qū)Υ蠖笷ER蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì) (alignment)。如圖1b所示，大豆FER家族氨基酸序列的同源程度較高，3個(gè)保守的基序 (Motif)分別用紅色、藍(lán)色和綠色的方框標(biāo)示。

利用alphafold程序 (https://www.alphafold.ebi.ac.uk/)對(duì)GmFER蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。發(fā)現(xiàn)GmFER1、GmFER2、GmFER4、GmFER6、GmFER8、GmFER12 均具有 7 個(gè) α-螺旋 (alphahelix)，GmFER4 還具有 2 個(gè) β-折疊 (beta-sheet)；GmFER3、GmFER7、GmFER9和GmFER11具有6個(gè)α-螺旋；而GmFER5和GmFER10 分別只具有4 個(gè)和 3 個(gè) α-螺旋 (圖 2)。

圖2 GmFER三維結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 Three-D structural chart of GmFERs

2.1.2 GmFER進(jìn)化分析 以大豆GmFER蛋白家族的氨基酸序列作為參考，在Phytozome網(wǎng)站 (https://phytozome-next.jgi.doe.gov/index.php)上進(jìn)行同源蛋白的比對(duì)，選取4個(gè)擬南芥 (AT)、3個(gè)馬鈴薯 (Soltu)、2 個(gè)玉米 (Zm)、2 個(gè)水稻 (Os)、2 個(gè)番茄 (Solyc)等共25個(gè)FER蛋白重建進(jìn)化樹(shù)。如圖3所示，GmFER可以分為 4 個(gè)亞組 (亞組 I～I(xiàn)V)，其中 GmFER3、GmFER7、GmFER8、GmFER10和GmFER11屬于亞組I，GmFER2和GmFER9同屬亞組II；GmFER5獨(dú)屬于亞組III，和禾本科植物水稻和玉米的FER同屬亞組III；GmFER1、GmFER4、GmFER6、GmFER12屬于亞組IV。

圖3 大豆FER蛋白家族進(jìn)化分析Fig. 3 Evolutionary analysis of soybean FER protein family

通過(guò)NCBI網(wǎng)站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行同源蛋白的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GmFER1、GmFER4、GmFER6和GmFER12與AtFER1高度同源，其中，GmFER1與AtFER1的同源性 (identity)為75%。分析的6種植物間FER蛋白的蛋白質(zhì)序列同源性介于54%～91%。

2.1.3 大豆FER基因啟動(dòng)子元件分析 基于擬南芥FER基因受PHR1、bHLH105/IRL等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，啟動(dòng)子區(qū)域存在 IDRS (Iron-Dependent RegulatorySequence)、G-BOX 以及 P1BS (PHR1-binding sequence)等元件[25]。本研究分析了大豆FER基因是否存在這些順式元件。從Phytozome網(wǎng)站下載大豆 (W82.a2版本) FER基因啟動(dòng)子序列，即從起始密碼子ATG上游截取2000 bp序列進(jìn)行上述3個(gè)響應(yīng)元件分析。如表3所示，大豆FER基因啟動(dòng)子沒(méi)有IDRS序列，僅GmFER8啟動(dòng)子含有G-box元件，GmFER8、GmFER9、GmFER10啟動(dòng)子含有P1BS元件。

表3 大豆FER基因啟動(dòng)子元件及其位置Table 3 Promoter elements and their positions in soybean FER gene

2.1.4 大豆FER基因在不同器官以及不同脅迫條件下的表達(dá)水平分析 從大豆公共數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站 (www.soybase.org)下載了大豆FER基因在不同器官的表達(dá)水平數(shù)據(jù)，制成熱圖。GmFER11是所有GmFER基因在葉中的表達(dá)水平最高的；GmFER8、GmFER4、GmFER3在花內(nèi)的表達(dá)水平位于前三；GmFER1和GmFER12在種子中的表達(dá)量最高；GmFER8、GmFER12和GmFER3在根的表達(dá)水平相對(duì)較高；而GmFER12在根瘤的表達(dá)水平最高 (圖4A)。但因?yàn)楫?dāng)時(shí) (2010)大豆基因組和轉(zhuǎn)錄組序列還不完善，沒(méi)有注釋GmFER10基因。因此圖4A沒(méi)有顯示GmFER10相關(guān)結(jié)果。

通過(guò)查閱文獻(xiàn)，分析了GmFER基因?qū)︷B(yǎng)分、干旱等脅迫的響應(yīng)。如圖4B所示，GmFER1與GmFER4在大豆根受鋁毒誘導(dǎo)表達(dá)[26]；GmFER4、GmFER8與GmFER12受干旱誘導(dǎo)，而GmFER7與GmFER11被干旱脅迫抑制表達(dá)[27]；在低鐵條件下，GmFER7與GmFER11在葉的表達(dá)受抑制[28]；在低鉀條件下，GmFER4與GmFER6在葉的表達(dá)受抑制，而GmFER11在根表達(dá)受抑制[29]；缺鋅脅迫會(huì)導(dǎo)致GmFER1在葉上調(diào)表達(dá)，而GmFER1在根下調(diào)表達(dá)[30]。缺磷脅迫導(dǎo)致植株根中的GmFER6、GmFER11與GmFER12上調(diào)表達(dá)[31]。這些結(jié)果說(shuō)明，大豆FER蛋白可能參與應(yīng)答和應(yīng)對(duì)多種養(yǎng)分及干旱等非生物脅迫。

圖4 GmFER基因在不同部位(A)以及不同脅迫條件(B)下的表達(dá)水平熱圖Fig. 4 Heat map of expression levels of GmFER genes in different parts and under different stress conditions

2.2 大豆FER基因的表達(dá)模式分析

2.2.1 大豆FER對(duì)低磷脅迫的響應(yīng) 為了鑒定GmFER基因?qū)Φ土酌{迫的響應(yīng)，運(yùn)用定量PCR技術(shù)檢測(cè)GmFER基因在大豆根和葉的表達(dá)水平。對(duì)大豆進(jìn)行了長(zhǎng)期 (14天)低磷 (LP)脅迫處理，然后分別提取根、葉的RNA進(jìn)行了定量PCR分析。與正常磷 (NP)相比，LP條件下在根上調(diào)表達(dá)的有GmFER1、GmFER4、GmFER6、GmFER7、GmFER12 (P<0.05)；在葉明顯上調(diào)表達(dá)的有GmFER1、GmFER5、GmFER6、GmFER7、GmFER8、GmFER12 (P<0.05)；在根和葉均受LP誘導(dǎo)的有GmFER1、GmFER6、GmFER7、GmFER12；而GmFER3在根葉均不響應(yīng)LP脅迫 (圖5)。我們嘗試了很多對(duì)引物檢測(cè)GmFER2、GmFER9、GmFER10表達(dá)水平，但PCR結(jié)果均不好，因此沒(méi)有展示這3個(gè)基因的結(jié)果。

圖5 正常磷和低磷下GmFER基因在根部和葉片中的相對(duì)表達(dá)水平Fig. 5 The relative expressions of GmFERs in root and leaves of soybean under nomal and low P treatments

2.2.2 大豆FER基因?qū)﹁F毒脅迫的影響 過(guò)去的研究表明，擬南芥FER基因表達(dá)受鐵調(diào)控，且在高鐵條件下蛋白水平增加以結(jié)合鐵，緩解過(guò)多鐵帶來(lái)的脅迫。為了明確GmFERs對(duì)鐵毒 (過(guò)量鐵)的響應(yīng)，我們檢測(cè)了GmFERs在大豆根和葉的表達(dá)水平。設(shè)置對(duì)照正常鐵 (NF，50 μmol/L Fe)、高鐵 (HF，500 μmol/L Fe)，進(jìn)行長(zhǎng)期 (14天)培養(yǎng)。然后分別提取根、葉的RNA，進(jìn)行定量PCR分析。與NF相比，HF誘導(dǎo)GmFER1、GmFER6在根表達(dá)，HF誘導(dǎo)GmFER6、GmFER11在葉表達(dá) (圖6)。這些結(jié)果暗示GmFER1、GmFER6、GmFER11 在緩解大豆鐵毒脅迫方面起重要作用。

2.3 擬南芥GmFER1啟動(dòng)子活性分析

基于GmFER1響應(yīng)鐵毒脅迫 (圖6)，為了進(jìn)一步分析GmFER1基因的啟動(dòng)子活性及對(duì)鐵毒的響應(yīng)，我們構(gòu)建了GmFER1基因啟動(dòng)子融合GUS 報(bào)告基因的載體，然后轉(zhuǎn)化擬南芥，得到了proGmFER1::GUS-1、proGmFER1::GUS-3、proGmFER1::GUS-4等3個(gè)報(bào)告基因株系。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選擇proGm-FER1::GUS-4 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 高鐵與正常鐵下GmFER基因在根部和葉片中的相對(duì)表達(dá)水平(t檢驗(yàn))Fig. 6 The relative expression level of GmFERs in root and leaves of soybean under high and normaliron Fe treatments (t-test)

為了探究不同鐵濃度條件下GmFER1啟動(dòng)子的組織活性，播proGmFER1:: GUS-4的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子于正?；|(zhì)，在正常條件下生長(zhǎng)3天后，將幼苗移到缺鐵 (LF，0 μmol/L Fe)、正常鐵 (NF，50 μmol/L Fe)、和鐵毒 (HF，500 μmol/L Fe)不同的鐵濃度環(huán)境中，培養(yǎng)7天后，進(jìn)行GUS染色。將染色后的根尖放置在顯微鏡下進(jìn)行觀察。在NF條件下，GmFER1啟動(dòng)子在主根根尖分生區(qū)、延長(zhǎng)區(qū)及成熟區(qū)活動(dòng)，不在根冠活動(dòng)；和NF處理相比，HF處理7天后的植株主根GUS染色程度更深 (圖7)，說(shuō)明鐵毒增強(qiáng)GmFER1啟動(dòng)子活動(dòng)。這與定量PCR結(jié)果一致。

為了探究不同鐵毒處理時(shí)間下GmFER1啟動(dòng)子的組織化學(xué)定位，播種proGmFER1::GUS-4的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子于正?；|(zhì)，在正常條件下生長(zhǎng)3天后，將幼苗移到HF條件基質(zhì)中，分別進(jìn)行0、3、24 h的鐵毒處理。從整株染色后的植株可以看出，植株的根、莖、葉均能觀察到GUS染色，且隨著鐵毒處理時(shí)間的增長(zhǎng)，GUS染色的范圍增大、程度更深 (圖 8)。

與0、3 h 鐵毒處理的植株葉片相比，經(jīng)過(guò)24 h鐵毒處理過(guò)后的植株葉片GUS染色更加明顯 (圖8)，這就說(shuō)明在植株的葉片部位，隨著鐵毒處理時(shí)間的延長(zhǎng)，GmFER1基因啟動(dòng)子活動(dòng)增強(qiáng)。

0 h 鐵毒處理的植株根尖，幾乎沒(méi)有GUS染色；3 h 鐵毒處理的植株根尖，仔細(xì)觀察會(huì)發(fā)現(xiàn)有弱的染色；24 h鐵毒處理的植株根尖，整個(gè)主根根尖部分都觀察到有明顯的GUS染色 (圖8)。

圖7和圖8結(jié)果說(shuō)明，短期 (3 、24 h)和長(zhǎng)期(7天)鐵毒脅迫均促進(jìn)GmFER1啟動(dòng)子在根和葉的活動(dòng)。

圖7 不同鐵濃度處理7天植株根部的GUS染色Fig. 7 GUS staining of plant roots treated with different iron concentrations for 7 days

圖8 不同鐵毒處理時(shí)間后植株葉與根部位的GUS染色Fig. 8 GUS staining of leaves and roots after different hours of iron toxicity treatment

2.4 超表達(dá)GmFER1對(duì)擬南芥耐受鐵毒脅迫的影響

為了初步探究GmFER1的功能，我們構(gòu)建GmFER1超表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0，篩選獲得T3代純合轉(zhuǎn)基因材料 (GmFER1OE-1、GmFER1OE-8、GmFER1OE-9、GmFER1OE-10)。定量PCR分析發(fā)現(xiàn)GmFER1OE-1與GmFER1OE-9轉(zhuǎn)基因株系中GmFER1的相對(duì)表達(dá)量顯著增加 (圖9)，因此選擇GmFER1OE-1與GmFER1OE-9進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖9 GmFER1 過(guò)表達(dá)株系鑒定Fig. 9 Identification of overexpressing GmFER1 lines

鑒于GmFER1受鐵毒誘導(dǎo)，因此重點(diǎn)分析GmFER1超量表達(dá)對(duì)擬南芥耐鐵毒 (HF)的影響。Col-0、GmFER1OE-1、GmFER1OE-9在正常條件培養(yǎng)3天，然后移到HF下培養(yǎng)7天后測(cè)定根系相關(guān)參數(shù)。在NF條件下，Col-0、GmFER1OE-1和GmFER1OE-9 的主根長(zhǎng)度和側(cè)根密度沒(méi)有差異 (數(shù)據(jù)未列出)。和NF相比，HF處理抑制Col-0主根的生長(zhǎng)和增加側(cè)根密度，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]。在HF條件下，GmFER1OE-1和GmFER1OE-9的主根長(zhǎng)度明顯比Col-0的長(zhǎng)，分別是Col-0的1.36倍和1.32倍(P <0.001，圖 10 a, b )。

在HF條件下，GmFER1OE-1和GmFER1OE-9的側(cè)根數(shù)明顯比Col-0多，和Col-0比，兩個(gè)超表達(dá)系側(cè)根數(shù)目分別增加 253% 和 188% (P<0.001，圖 10 b)。

在HF條件下，GmFER1OE-1和GmFER1OE-9 的側(cè)根密度分別是 Col-0 的 1.9 和 1.5 倍 (P<0.05，圖 10 b )。

圖10 GmFER1超表達(dá)增加擬南芥在鐵毒條件下主根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)目和側(cè)根密度Fig. 10 Overexpression of GmFER1 increases the primary root length, lateral root number, and density of lateral root in Arabidopsis under iron toxicity

GmFER1超量表達(dá)除了能改善擬南芥在HF條件下根系的生長(zhǎng)與發(fā)育，還能改善植株的整體生長(zhǎng)狀況。因?yàn)镚mFER1OE-1材料GmFER1的表達(dá)水平比GmFER1OE-9材料的高 (圖9)，后續(xù)試驗(yàn)采用GmFER1OE-1 材料。在對(duì)照正常鐵 (NF， 50 μmol/L Fe)條件下，GmFER1OE-1和Col-0 的鮮重和葉綠素含量沒(méi)有差異。在 HF (500 μmol/L Fe)處理下，與Col-0相比，GmFER1OE-1材料的鮮重明顯比Col-0的大，是Col-0的1.09倍 (P<0.001，圖11)。在HF條件下，GmFER1基因超表達(dá)材料GmFEROE-1的葉綠素含量明顯比Col-0高，是Col-0的1.05倍(P<0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明，GmFER1超表達(dá)改善根系生長(zhǎng)和發(fā)育，提高了植株中葉綠素含量，增加鮮重，GmFER1超表達(dá)增強(qiáng)擬南芥對(duì)鐵毒的耐受能力。

圖11 超表達(dá)GmFER1增加擬南芥在鐵毒下鮮重和葉綠素含量Fig. 11 Overexpression of GmFER1 increases the fresh weight and chlorophyll content in Arabidopsis under iron toxicity

3 討論

鐵是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素。但在有氧條件下，鐵能夠與H2O2反應(yīng) (Fenton反應(yīng))生成活性氧 (ROS)，過(guò)多ROS對(duì)植物是有害的。因此植物鐵的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及在細(xì)胞內(nèi)的分布受到嚴(yán)格調(diào)控。FER作為植物體內(nèi)儲(chǔ)存結(jié)合鐵的蛋白，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、氧化脅迫相關(guān)的逆境抵抗和維持鐵營(yíng)養(yǎng)穩(wěn)態(tài)方面起重要作用。動(dòng)物細(xì)胞主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控FER[32]，而植物FER主要在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控[32]。

陳華濤等[15]分析了大豆FER基因家族，沒(méi)有本研究報(bào)道的GmFER2、GmFER5、GmFER9、GmFER10 (表2)。本研究發(fā)現(xiàn)，大豆12個(gè)FER基因共分為 4 個(gè)亞組 (圖 3)。GmFER1、GmFER4、GmFER6、GmFER12與AtFER1同屬一個(gè)亞組，表明同源性高。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，大豆FER蛋白可定位于細(xì)胞質(zhì)、線(xiàn)粒體或葉綠體 (表2)。擬南芥基因組只有4個(gè)FER基因，而大豆具有12個(gè)，這可能與大豆基因組更大更復(fù)雜有關(guān)。GmFER12和GmFER8在根瘤和根中的表達(dá)水平高 (圖4A)，說(shuō)明這兩個(gè)基因可能在調(diào)節(jié)根和根瘤鐵穩(wěn)態(tài)和抗氧化脅迫方面起重要作用。此外，GmFER1和GmFER12在大豆種子中的表達(dá)水平高 (圖4A)，暗示利用這兩個(gè)基因進(jìn)行作物遺傳轉(zhuǎn)化，可以提高作物種子中的鐵含量。

擬南芥FER基因啟動(dòng)子元件還存在G-BOX元件 (CACGTG)。在鐵不過(guò)量的條件下，ILR3通過(guò)結(jié)合在FER基因的G-BOX元件從而抑制FER1、FER3、FER4的轉(zhuǎn)錄[24–25]。而和IRL3同組的其他bHLH轉(zhuǎn)錄因子，如bHLH34、bHLH104 和bHLH115則不抑制FER的轉(zhuǎn)錄，IRL3的調(diào)控作用需要bHLH47/PYE與其蛋白互作[25]。大豆基因組也存在很多bHLH基因，推測(cè)大豆bHLH也調(diào)控GmFER的轉(zhuǎn)錄。明確哪些bHLH類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合在GmFERs基因啟動(dòng)子及其互作元件，將有助揭示GmFERs的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制。ZmFer1和AtFer1基因啟動(dòng)子存在IDRS元件，IDRS元件僅與ZmFer1和AtFer1在低鐵條件下轉(zhuǎn)錄受抑制關(guān)聯(lián)，而不負(fù)責(zé)氧化脅迫導(dǎo)致的FER轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)[32]，但GmFERs啟動(dòng)子上沒(méi)有IDRS元件(表 3)。

擬南芥PHR1和PHL1是磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路非常關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合下游低磷脅迫響應(yīng)基因，如

PHT1 (Phosphater Transporter1)、 SPX (SYG1/PHO81/XPR1)等啟動(dòng)子的 P1BS (PHR1 binding sequence)元件。AtFER1啟動(dòng)子上也存在P1BS元件，且AtFER1受低磷誘導(dǎo); 而在phr1 phl1雙突變體中，AtFER1不受低磷誘導(dǎo)。在低磷條件下，phr1 phl1雙突變體鐵的濃度比野生型高，phr1 phl1雙突變體葉片鐵的分布發(fā)生了改變[33]。這說(shuō)明PHR1和PHL1調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，GmFER1、GmFER4、GmFER5、GmFER6、GmFER7、GmFER8、GmFER12 在根或葉受低磷誘導(dǎo) (圖5)。啟動(dòng)子元件分析發(fā)現(xiàn)，大豆GmFER8、GmFER9、GmFER10啟動(dòng)子均存在P1BS元件 (表3)。暗示大豆PHR類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)節(jié)這3個(gè)GmFER基因的轉(zhuǎn)錄。

本研究通過(guò)定量PCR檢測(cè)了在HF (鐵毒)供給水平下GmFER基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)GmFER1、GmFER6、GmFER11基因受鐵毒誘導(dǎo)表達(dá) (圖6)。但因?yàn)榧夹g(shù)和引物特異性問(wèn)題，盡管?chē)L試了很多次，但誤差還是特別大，因此沒(méi)有展示GmFER2、GmFER10 的定量PCR結(jié)果。數(shù)據(jù)挖掘分析發(fā)現(xiàn)，大豆FER基因還受鉀、磷、鋅、鋁毒、干旱等脅迫的調(diào)控 (圖4B)，這說(shuō)明GmFER基因可能通過(guò)調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)和或ROS的水平而參與應(yīng)答這些非生物脅迫。本研究發(fā)現(xiàn)低鐵抑制GmFER7、GmFER11的表達(dá)(圖4B)，外施檸檬酸鐵誘導(dǎo)大豆FER基因表達(dá)[15]; 外施鐵快速誘導(dǎo)AtFER1、AtFER3、AtFER4在擬南芥根、葉的表達(dá)[10]。這說(shuō)明外源鐵水平調(diào)節(jié)FER基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制是保守的。需指出的是，在擬南芥FER1-FER14啟動(dòng)子還存在其他逆境響應(yīng)元件。

IRT1是鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也被認(rèn)為是鐵轉(zhuǎn)運(yùn)受體 (transceptor)。CaFer1 與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)子 IRT1 互作[34], 至于GmFER是否與大豆IRT互作還需研究。在木薯(Cassava)表達(dá)擬南芥IRT1和AtFER1可以提高塊狀根中鐵的含量和鋅的含量，分別提高7～18倍以及3～10倍[35]。 這說(shuō)明，將來(lái)通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)，同時(shí)將大豆IRT、FER、FRO或NAS等多個(gè)和鐵營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入大豆、水稻、玉米等作物，可增加種子鐵含量，改善人類(lèi)健康。

過(guò)多鐵抑制擬南芥主根分生區(qū)長(zhǎng)度、主根長(zhǎng)度、平均一級(jí)側(cè)根長(zhǎng)度以及側(cè)根密度[9]。與此一致的是，超表達(dá)GmFER1可以改善轉(zhuǎn)基因擬南芥在高鐵(鐵毒)下的生長(zhǎng)，促進(jìn)主根生長(zhǎng)、側(cè)根形成和側(cè)根密度 (圖10)；增加葉綠素含量和鮮重 (圖11)，耐受鐵毒的能力增強(qiáng)，但具體的生理和分子機(jī)制還需要深入研究?？紤]到GmFER1與AtFER1蛋白的同源性高達(dá)75%，推測(cè)GmFER1調(diào)節(jié)擬南芥在過(guò)量鐵條件下根系發(fā)育的機(jī)制是保守的。

4 結(jié)論

本研究揭示大豆基因組共有12個(gè)FER基因，明確了受低磷脅迫或鐵毒脅迫誘導(dǎo)的GmFER基因，超表達(dá)GmFER1改善擬南芥根系的生長(zhǎng)，增強(qiáng)擬南芥耐鐵毒的能力。本研究為今后深入研究GmFER的功能提供了線(xiàn)索，今后需要利用基因編輯技術(shù)深入研究大豆FER基因家族的功能。