基于紅外光譜法對不同連作茬次地黃土壤光譜特征分析

喬 璐， 劉瑞娜， 張 瑞， 趙博宇， 韓盼盼，2， 周春亞，3， 張雨晴，4， 董誠明*

1. 河南中醫(yī)藥大學藥學院， 河南 鄭州 450046 2. 廣州中醫(yī)藥大學藥學院， 廣東 廣州 510006 3. 江西中醫(yī)藥大學藥學院， 江西 南昌 330004 4. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所， 北京 100193

引 言

地黃(RehmanniaglutinosaLiBosch.)是玄參科植物， 以新鮮或干燥塊莖入藥[1]。 主產(chǎn)于河南焦作的懷地黃， 在種植過程中存在著嚴重的連作障礙， 每茬地黃收獲后須隔8～10年后方可再種植[2]。 早在《本草乘雅半偈》就有記載[3]。 具體表現(xiàn)為病蟲害加劇， 塊根不能正常膨大， 多須根， 產(chǎn)量和品質(zhì)下降， 嚴重影響了地黃藥用價值， 并制約了道地產(chǎn)區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展。

目前研究認為， 地黃連作障礙主要由3種原因造成： 一是土壤肥力下降[4-7]； 二是地黃連作后， 根際土壤中微生物變化， 大量病原菌迅速滋生， 導致病蟲害加劇， 地黃產(chǎn)量下降[8-12]； 三是植物根系的化感自毒作用。 植物連作時， 根系會向土壤中分泌一些次生代謝物質(zhì)， 這些物質(zhì)的成分到底是什么， 目前尚無通論。 有學者認為這些次生代謝物質(zhì)可能是酚酸類成分或者鞣質(zhì)[11]。 國內(nèi)外研究地黃連作障礙的手段多聚焦于高效液相色譜法， 微生物培養(yǎng)法以及分子水平研究DNA[3-12]， 但前期樣品需求量大、 處理繁瑣、 分析時間長， 成本較高。 紅外光譜法可以通過分析吸收峰的吸收強度、 位置和形狀， 確定官能團， 直觀地反映出地黃土壤的差異信息。 本研究采用傅里葉紅外衰減全反射(FTIR-ATR)在4 000～400 cm-1波段對正茬1年(YA-one)、 重茬1年(YA-two)、 10年前種植過(YA-ten)、 未種植過地黃的土壤(CK)進行掃描， 提取特征光譜之間的差異性， 建立二維紅外相關(guān)光譜， 確定官能團， 分析土壤中化合物的指紋圖譜。 為地黃連作障礙研究提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料

土壤樣品為2019年4月26日采集于河南省焦作市武陟縣地黃種植基地(GPS坐標113°16′40″， 34°59′55″)2009年—2019年間分別種植地黃的土壤， 土壤質(zhì)地是砂質(zhì)壤土， 土壤類型為壚土， 屬石灰性褐土亞類火褐泥砂土土屬。 氣候條件： 暖溫帶大陸性季風氣候， 年日照時數(shù)2 484 h， 無霜期220 d， 年積溫4 714.9(≥10 ℃)， 濕度45%， 年平均溫度18 ℃， 年平均降水量544.96 mm。 去除土壤表面植物、 腐殖質(zhì)及表面干燥的土壤， 用滅菌鏟挖取5～20 cm深的土樣， 采用“S”形五點取樣法混合， 在4個樣地取樣， 采集信息見表1。

表1 地黃土壤采集信息Table 1 Soil collection information of Rehmannia glutinosa

1.2 儀器及試劑

INVENIOS型傅里葉變換紅外光譜儀(美國BRUKER公司)， 配有DTGS檢測器， 衰減全反射(ATR)附件， pH計(上海雷磁pHS-3E)。

1.3 地黃土壤紅外光譜數(shù)據(jù)采集

取表1中4份地黃土壤樣品各適量， 風干粉碎， 過篩。 采用傅里葉紅外衰減全反射(FTIR-ATR)， 儀器分辨率為4 cm-1， 樣品掃描時間32 s， 背景掃描時間32 s， 掃描范圍4 000～400 cm-1。 將取適量收集到的土壤樣品放入ATR附件的紅外透光晶體表面， 以空氣為參比， 扣除H2O和CO2干涉背景后采集光譜圖， 按上述試驗條件進行掃描， 每個樣品重復掃描3次， 求平均光譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理

OMNIC9.2對不同間隔年限種植地黃土壤的光譜進行Norris濾噪平滑， 求二階導數(shù)， 然后利用Origin2019b作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同間隔年限種植地黃土壤的光譜

圖1 不同間隔年限種植地黃土壤的光譜Fig.1 Soil spectra of Rehmannia glutinosaplanted in different interval years

2.4 不同間隔年限種植地黃土壤的二階圖譜

為了提高光譜分辨率， 區(qū)分重疊的特征峰， 增大信息量[15]。 對土壤樣品紅外光譜進行Norris平滑濾噪+二階導數(shù)處理(圖2和圖3)。

圖2 不同間隔年限地黃種植土壤的二階光譜(4 000～1 200 cm-1)Fig.2 Second-order spectra of Rehmannia glutinosa planting soils with different interval years (4 000～1 200 cm-1)

二階導數(shù)光譜的極小值點(波谷)對應原始光譜的吸收峰位置， 從圖4中可以明顯看到在4 000～1 200 cm-1波段中的差異性。 其中， 3 750 cm-1在CK、 YA-one、 YA-ten中都有明顯吸收峰， 但在樣品編號YA-two中。 在3 652 cm-1附近， CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten曲線都出現(xiàn)了吸收峰， YA-two的吸收峰強度最大。 在2 925和2 857 cm-1吸收位置處是糖苷類中飽和亞甲基—CH2的伸縮振動， CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten在此位置處都有吸收， 但不同的是YA-two的吸收強度最小， YA-ten的吸收強度最大。 說明重茬土壤中， 糖苷類成分下降。 1 743 cm-1吸收區(qū)CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten都出現(xiàn)了吸收峰， 而YA-two的吸收強度最小。

在1 548 cm-1出現(xiàn)芳環(huán)和芳雜環(huán)的特征吸收峰， CK、 YA-one、 YA-ten有兩小吸收峰， 不太明顯， 但YA-two在此波段的兩個小吸收峰合并成一個。 1 488 cm-1處CK、 YA-one、 YA-ten都出現(xiàn)了吸收峰， 但YA-two的吸收峰不明顯幾近消失。

2.5 不同間隔種植年限的地黃土壤的二維相關(guān)譜

二維相關(guān)紅外光譜(2D-IR)是利用不同的外界微擾(如溫度)， 在第二維度上展開FTIR 光譜。 二維光譜可以提高光譜的分辨率， 將重疊峰甚至是被掩蓋的一些小峰清晰地顯示出來， 可用于研究各組分基團分子振動行為的差異， 簡化復雜光譜的重疊峰， 揭示各官能團的相互作用[16]。 原譜圖在指紋區(qū)重疊峰較多， 為了更明顯地提高分辨率， 得到更為細致的光譜圖， 以未種植地黃的土壤(CK)為標準， 對樣品YA-one、 YA-two、 YA-ten在920～1 750 cm-1波段進行二維紅外相關(guān)光譜處理， 又進一步選取特征波段1 490～1 710和1 500～1 548 cm-1得到圖4， 圖5和圖6。

圖4 YA-one的二維紅外相關(guān)光譜(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1Fig.4 2D-IR of YA-one(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1

圖4是YA-one的二維紅外相關(guān)光譜， 在(a)波段920～1 750 cm-1， 有5個自動峰[18]1 033， 1 634， 1 655， 1 679和1 682 cm-1； 1 033和1 655 cm-1這兩個自動峰強度最大； 有三組交叉峰， 按照強弱順序依次為(1 655， 1 033)， (1 550， 1 033)和(1 655， 1 550) cm-1。 在(b)波段1 490～1 710 cm-1， 有1 508， 1 542， 1 550， 1 628， 1 634， 1 655， 1 679和1 682 cm-18個自動峰， 其中1 634和1 655 cm-1這兩個自動峰最為明顯； 在此波段的交叉峰按照強弱順序依次為(1 655， 1 634)， (1 682， 1 655)， (1 682， 1 634)， (1 655， 1 550)和(1 655， 1 542) cm-1。 在(c)波段1 500～1 548 cm-1中， 有1 506和1 542 cm-1這2個自動峰； 還有(1 542， 1 524)和(1 518， 1 506) cm-1這2組交叉峰。

圖5是YA-two的二維紅外相關(guān)光譜， 在(a)波段920～1 750 cm-1， 有兩個自動峰， 分別為1 033和1 634 cm-1， 1 033 cm-1的自動峰比1 634 cm-1強； 但在此波段沒有交叉峰。 在(b)波段1 490～1 710 cm-1， 有1 542， 1 603和1 634 cm-1三個自動峰， 1 603和1 634 cm-1這兩個自動峰相對較強； 還有兩組交叉峰， 按照強弱順序依次是(1 634， 1 603)和(1 628， 1 542) cm-1。 在(c)波段1 500～1 548 cm-1中， 出現(xiàn)一個很強的自動峰， 為1 542 cm-1， 一組交叉峰， 為(1 542， 1 524) cm-1。

圖5 YA-two的二維紅外相關(guān)光譜(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1Fig.5 2D-IR of YA-two(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1

圖6是YA-ten的二維紅外相關(guān)光譜， 從圖中可以看到， 在(a)波段920～1 750 cm-1， 有4個自動峰， 分別為1 033， 1 628， 1 634和1 655 cm-1， 其中1 033和1 634 cm-1這2個自動峰更為明顯； 在此波段中還有5組交叉峰， 按照強弱順序依次為(1 655， 1 628)， (1 634， 1 033)， (1 655， 1 033)， (1 634， 1 550)， (1 679， 1 634)和(1 550， 1 033) cm-1。 在(b)波段1 490～1 710 cm-1中， 有5個自動峰， 分別為1 550， 1 628， 1 634， 1 655和1 682 cm-1， 其中1 628， 1 634和1 655 cm-1這3種自動峰較為明顯； 在此波段中， 還有3組交叉峰， 按照交叉峰的強弱順序依次為(1 655， 1 628)， (1 682， 1 634)和(1 634， 1 550) cm-1。 在(c)波段1 500～1 548 cm-1中， 有3組自動峰最明顯， 分別為1 506， 1 542和1 550 cm-1； 在此波段中， 有6組交叉峰， 按照交叉峰強弱順序依次為(1 542， 1 506)， (1 518， 1 506)， (1 548， 1 506)， (1 548， 1 542)， (1 530， 1 506)和(1 542， 1 518) cm-1。

圖6 YA-ten的二維紅外相關(guān)光譜(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1Fig.6 2D-IR of YA-ten(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1

綜上所述， 不同間隔種植年限的地黃土壤在波段920～1 750， 1 490～1 710和1 500～1 548 cm-1中， 自動峰和交叉峰的位置、 個數(shù)、 以及強弱都不相同， 說明二維紅外相關(guān)光譜可以用來區(qū)分不同種植茬次的地黃土壤。

3 結(jié) 論