傅里葉紅外光譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的渣馴優(yōu)劣鑒別研究

李子儀， 李瑞蘭， 李燦琳， 王柯入， 范久余， 古 銳*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院， 四川 成都 611130 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 四川 成都 611130 3. 重慶市中藥研究院， 重慶 400065

引 言

藏藥“渣馴”， 意譯為“巖精”， 為巖石中流出的一種黑色有機(jī)質(zhì)與鼯鼠屬、 鼠兔屬動物糞便的混合物[1]， 藥材性狀見圖1(a—d)。 渣馴具有治療肝病、 胃病的功效， 是治療肝病的首選藥物之一[2-3]， 在其他醫(yī)學(xué)體系中也有著廣泛的使用， 如在阿育吠陀和尤納尼醫(yī)學(xué)體系中主要用于治療陽痿、 增強(qiáng)體質(zhì)， 其提取物在美國、 俄羅斯等多個國家廣泛使用。 國內(nèi)外渣馴藥理實驗也表明渣馴具有抗腎毒性[4]、 補(bǔ)充體力[5]、 抗炎[6]、 治療肝損傷等[7]作用， 具備廣闊的臨床應(yīng)用潛力。 渣馴傳統(tǒng)等級區(qū)分僅根據(jù)糞便比例判別， 糞粒少則質(zhì)優(yōu)。 但藥材市場出售和藏醫(yī)院使用的通常為渣馴膏， 顏色均為棕黑色， 僅根據(jù)傳統(tǒng)性狀判斷方法無法區(qū)分其質(zhì)量優(yōu)劣。

圖1 不同等級渣馴(a)： Ⅰ級； (b)： Ⅱ級； (c)： Ⅲ級； (d)： 代用品Fig.1 Zhaxun of different grades(a)： Grade Ⅰ； (b)： Grade Ⅱ； (c)： Grade Ⅲ； (d)： Substitute

隨著現(xiàn)代技術(shù)發(fā)展， 出現(xiàn)了更多的藥材鑒別方法， 比如薄層色譜鑒別[8]、 理化鑒別[9]、 分子鑒定[10]、 熒光光譜鑒別[11]、 高效液相色譜鑒別[12]等方法， 但這些方法存在耗時長， 效率低， 價格昂貴等缺點。 近紅外光譜(NIRS)是傳統(tǒng)藥材鑒別的有效方法， 但NIRS受溫濕度影響明顯， 特征信息較少， 如趙明明等采用NIRS能夠區(qū)分代用品與其他等級渣馴[13]， 但無法區(qū)分其他3個等級渣馴。 綜上， 現(xiàn)有的鑒別技術(shù)存在檢測時間長， 檢測效率低等問題， 近紅外光譜技術(shù)獲取信息量較少， 仍沒有完全區(qū)分不同等級渣馴， 因此有必要進(jìn)一步研究渣馴優(yōu)劣快速評價方法。 FTIR是目前發(fā)展較快且具有良好應(yīng)用前景的分析技術(shù)之一， 根據(jù)光譜圖的不同特征， 鑒別未知物質(zhì)和特殊化學(xué)官能團(tuán)[14]， 與近紅外光譜測定波數(shù)范圍不同， 在中藥的有效成分、 產(chǎn)地鑒別等有著廣泛的應(yīng)用[15]。 通過傅里葉變換紅外光譜技術(shù)為渣馴藥材及渣馴膏優(yōu)劣鑒別提供研究基礎(chǔ)， 為建立渣馴(膏)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫Cary610顯微紅外光譜儀(DTGS檢測器， 美國安捷倫公司)； BSA124S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)； PC-5壓片機(jī)(天津市精拓儀器科技有限公司)； 溴化鉀(KBr)(光譜純， 成都市科隆化學(xué)品有限公司)； DHG-9245A鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)[16]。

1.2 材料

通過藥材市場購買、 產(chǎn)地收購及產(chǎn)地自采的方式共收集56批次渣馴藥材及代用品樣品， 52批作為測試集， 4批作為外部驗證集。 成都中醫(yī)藥大學(xué)古銳教授根據(jù)藥材的色澤和斷面糞粒數(shù)量， 將渣馴分為4個等級， Ⅰ級為傳統(tǒng)鑒別的優(yōu)等品， 質(zhì)重色黑， 極少糞粒， Ⅱ級次之[13]， Ⅲ級斷面糞粒較多， 質(zhì)較輕， 代用品為糞粒凝結(jié)團(tuán)塊， 表面黃棕色或黑棕色， 樣品信息見表1。 依據(jù)《六省區(qū)藏藥標(biāo)準(zhǔn)》中渣馴炮制標(biāo)準(zhǔn)方法， 將得到的渣馴干膏打粉后過80目篩， 備用。

表1 渣馴藥材來源信息表Table 1 Sample information form of Zhaxun

1.3 方法

1.3.1 實驗環(huán)境

渣馴紅外圖譜測定在成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院實驗室完成， 室內(nèi)溫度(25±2) ℃， 空氣濕度57 RH%。

1.3.2 樣品制備及測定

將渣馴膏粉末裝入西林瓶中在50～55 ℃烘箱中過夜去除水分， 瑪瑙研缽中先加入KBr粉末， 作為空白對照。 烘干后的渣馴膏粉末與KBr以2 mg∶100 mg的比例混合研磨至細(xì)粉， 粉末均勻后在壓片機(jī)中壓片， 每個渣馴樣品均制備3個樣片。 使用紅外光譜儀測定薄片透光度， 取平均圖譜， 每個樣品掃描32次， 掃描時扣除H2O和CO2[17]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

通過OMINIC 8.2軟件測得試樣紅外光譜， 圖譜預(yù)處理方法見圖2， 通過預(yù)處理得到校正光譜， 同一等級所有渣馴的校正紅外光譜圖得到各等級渣馴平均圖譜； 各等級平均圖譜經(jīng)過二階導(dǎo)數(shù)轉(zhuǎn)化， 獲得對應(yīng)各級別樣品二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜； 對各等級的紅外平均光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行分析， 得到各等級渣馴紅外光譜峰指標(biāo)信息， 從而分析各等級渣馴峰差異[18]。

基于二階導(dǎo)數(shù)圖譜數(shù)據(jù)， 分別采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行HCA(hierarchical cluster analysis)分析， SIMCA 14.0軟件進(jìn)行PCA(principal component analysis)、 PLS-DA(partial least squares iscriminent analysis)分析， 數(shù)據(jù)處理流程見圖2。

圖2 數(shù)據(jù)處理流程圖Fig.2 Flow chart of data processing

1.4 方法學(xué)考察

選取編號“1-1”的樣品進(jìn)行方法學(xué)考察， 驗證方法可行性[19]。

1.4.1 精密度實驗

按“樣品制備與測定”項中方法， 連續(xù)重復(fù)掃描5次。

1.4.2 穩(wěn)定性實驗

按“樣品制備與測定”項中方法， 每隔10 min掃描1次， 總共掃描5次。

1.4.3 重復(fù)性實驗

按“樣品制備與測定”項中方法， 按“1.3.2”項方法分別壓制5片。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

精密度實驗中， 不同等級紅外圖譜的相關(guān)系數(shù)為0.998 6～0.999 2， RSD=0.090(n=5)， 精密度良好； 穩(wěn)定性實驗中， 不同等級紅外圖譜的相關(guān)系數(shù)為0.999 7～0.999 8， RSD=0.017(n=5)， 穩(wěn)定性良好； 重復(fù)性實驗中， 不同等級紅外圖譜的相關(guān)系數(shù)為0.999 1～0.999 7， RSD為0.044(n=5)， 重復(fù)性良好。

2.2 不同等級渣馴紅外光譜比較

不同等級渣馴的平均紅外光譜見圖3， 四個等級渣馴紅外光譜相似度高。 各等級渣馴指紋吸收區(qū)為1 800～400 cm-1。 指紋區(qū)范圍內(nèi)， 1 800～1 400 cm-1的峰表明， 該區(qū)域峰表征苯環(huán)骨架伸縮振動和O—H面內(nèi)彎曲振動， 1 300～1 000 cm-1峰表征， 該區(qū)域峰的振動形式為C—O伸縮振動， 1 000～500 cm-1峰表明， 該區(qū)域峰的振動形式為苯環(huán)C—H的面外彎曲振動和酚類O—H的面外振動。

圖3 四個等級渣馴平均紅外光譜圖Fig.3 Average infrared spectrum of Zhaxun of four grades

2.3 不同等級渣馴二階導(dǎo)數(shù)對比

圖4中四個等級渣馴的整體吸收區(qū)域相似度較高， 對于二階導(dǎo)數(shù)光譜中的指紋區(qū)(1 800～400 cm-1)進(jìn)行放大， 如圖5， ①號區(qū)域內(nèi)， 1 768 cm-1附近Ⅰ等級渣馴和Ⅱ等級渣馴峰強(qiáng)度明顯強(qiáng)于Ⅲ等級渣馴和渣馴代用品， 1 779 cm-1附近僅有Ⅰ等級渣馴和Ⅱ等級渣馴有吸收峰。 ②號區(qū)域內(nèi)， 1 660 cm-1附近Ⅰ， Ⅱ和Ⅲ級渣馴均出現(xiàn)吸收峰， 僅代用品渣馴無吸收峰。 ③號區(qū)域內(nèi)， 吸收峰強(qiáng)度變化與渣馴等級具有明顯關(guān)系， 傳統(tǒng)分級品質(zhì)越好的峰強(qiáng)度越大。 ④號區(qū)域內(nèi)， 僅渣馴代用品在1 257 cm-1具有吸收峰， 其他等級渣馴均無吸收峰。 ⑤號區(qū)域內(nèi)僅Ⅱ、 Ⅲ等級樣品具有吸收峰， Ⅰ等級樣品和代用品無吸收峰。 ⑥號區(qū)域內(nèi)僅代用品無吸收峰出現(xiàn)， Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ等級樣品均有吸收峰。 ⑦號區(qū)域內(nèi)吸收峰差異與渣馴等級具有明顯關(guān)系， 傳統(tǒng)分級品質(zhì)越好的峰強(qiáng)度越大。 1 660 cm-1附近僅代用品渣馴無吸收峰， 1 257 cm-1僅代用品具有吸收峰， 均可作為代用品渣馴的鑒別依據(jù)； ③號區(qū)域內(nèi)及⑦號區(qū)域吸收峰差異均與傳統(tǒng)分級相關(guān)， 品質(zhì)越好的峰強(qiáng)度越大， 可作為多批次渣馴驗證區(qū)域。

圖4 四個等級渣馴二階導(dǎo)數(shù)平均紅外光譜Fig.4 Second derivative average infrared spectra of Zhaxun of four grades

圖5 四個等級渣馴指紋區(qū)二階導(dǎo)數(shù)平均紅外光譜Fig.5 Second derivative average infrared spectra of fingerprint areas of Zhaxun of four grades

2.4 化學(xué)計量學(xué)分析

2.4.1 主成分分析(PCA)

PCA結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)生成四個等級渣馴得分圖， 結(jié)果如圖6所示， Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ等級渣馴區(qū)分度小， 僅代用品渣馴區(qū)分度較高， 結(jié)果表明PCA能夠區(qū)分代用品渣馴與其他等級渣馴。

圖6 四個等級渣馴PCA三維得圖Fig.6 3D scattered plot of PCA of Zhaxun of four grades

2.4.2 偏最小二乘法分析(PLS-DA)

通過傳統(tǒng)分級法進(jìn)行分組， 采用PLS-DA進(jìn)行組別標(biāo)注， 得到四個等級的PLS-DA三維得分圖， 如圖7所示， Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ等級與代用品出現(xiàn)分離， 聚類效果好， 四個等級渣馴單獨聚類， 且具有一定分布規(guī)律， 代用品渣馴與其他三個等級渣馴差異較大。 PLS-DA對渣馴分組進(jìn)行預(yù)測結(jié)果更易區(qū)分。

圖7 四個等級渣馴PLS-DA三維得分圖Fig.7 3D scattered plot of PLS-DA of Zhaxun of four grades

2.5 外部驗證實驗

將自采的4個樣品ZX1-19， ZX2-20， ZX3-21和ZX4-16按“2.3”中構(gòu)建的4個等級渣馴的PLS-DA鑒別方法進(jìn)行鑒別。 從外部驗證結(jié)果的三維圖(圖8)能夠看出， ZX1-19明顯與Ⅰ等級渣馴聚為一類， ZX2-20明顯與Ⅱ等級渣馴聚為一類， ZX3-21明顯與Ⅲ等級渣馴聚為一類， ZX4-16明顯與代用品渣馴聚為一類。 外部驗證的結(jié)果證明“2.3”中建立的PLS-DA模型鑒別方法對4個等級渣馴具有良好的鑒別能力。

圖8 外部驗證實驗的PLS-DAFig.8 3D scattered plot of PLS-DA

2.6 聚類分析

聚類分析(hierarchical cluster analysis, HCA)采用Ward聚類法， 距離為25時， 四個等級渣馴聚為2類， Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ等級渣馴為一類， 代用品渣馴單獨聚為一類， 與其他三個等級渣馴有明顯差異； 距離為4時， Ⅲ等級中12批樣品聚為一類， 其他少數(shù)Ⅲ等級渣馴與Ⅰ、 Ⅱ等級渣馴聚集， 聚類結(jié)果見圖9。 表明這幾批Ⅲ等級渣馴與Ⅰ、 Ⅱ等級渣馴親緣關(guān)系較近； Ⅰ、 Ⅱ等級渣馴聚類不明顯， 化學(xué)成分差異可能較小。

圖9 四個等級渣馴的HCA圖Fig.9 Diagram for HCA of Zhaxun

3 結(jié) 論

3.1 不同化學(xué)計量學(xué)方法對不同等級渣馴差異性的分辨能力

通過紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)， 完成對不同等級渣馴的的優(yōu)劣鑒定及真?zhèn)舞b別， 紅外光譜表明渣馴的指紋鑒別區(qū)域位于1 800～400 cm-1內(nèi)， 其中代用品與其他等級渣馴差異較大。 二階導(dǎo)數(shù)全波段數(shù)據(jù)分析， 渣馴樣品間差異較小， 1 660 cm-1附近僅代用品渣馴無吸收峰， 1 257 cm-1僅代用品具有吸收峰， 均可作為代用品渣馴的鑒別依據(jù)； ③號區(qū)域內(nèi)及⑦號區(qū)域吸收峰差異均與傳統(tǒng)分級相關(guān)， 品質(zhì)越好的峰強(qiáng)度越大， 可作為多批次渣馴驗證區(qū)域。

PCA方法在未知分組下， 能將代用品渣馴與正品渣馴區(qū)分， 無法區(qū)分其他三個等級渣馴； PLS-DA分析方法能夠?qū)⑺膫€等級渣馴較好地區(qū)分， 更好區(qū)分各組特征變量。 HCA結(jié)果顯示代用品渣馴單獨聚類， 與其他三個等級渣馴不同， Ⅲ等級渣馴中有12批樣品聚為1類， 其他7批樣品與Ⅰ、 Ⅱ等級渣馴混雜， 推測Ⅲ等級渣馴可能與Ⅰ、 Ⅱ等級渣馴有差異性， 同時化學(xué)成分具有一定相似性； Ⅰ、 Ⅱ等級渣馴化學(xué)相似度較高。

PCA為無監(jiān)督分類， 適用于樣品未知分類情況， 根據(jù)光譜信息直接進(jìn)行分類； 渣馴樣品未分組時， 使用PCA進(jìn)行判別， 由于各組光譜信息差異較小， 不能完全區(qū)分不同等級渣馴， 僅能區(qū)分光譜信息差異較大的代用品渣馴。 PLS-DA為監(jiān)督分類， 通過提前分組， 選擇特征參數(shù)進(jìn)行分類； 對渣馴樣品進(jìn)行分組， 根據(jù)每個樣品光譜信息對渣馴進(jìn)行劃分， 可以利用已知光譜信息驗證其他未知樣品。 對已知渣馴樣品進(jìn)行分組， 獲取不同組間光譜信息差異， 使用未知樣品時根據(jù)已有樣品光譜信息進(jìn)行等級判別， 可以有效鑒別不同等級渣馴。

3.2 傅里葉變換紅外光譜技術(shù)結(jié)合PLS-DA分析能夠快速判斷渣馴質(zhì)量等級

監(jiān)督分析方法中PLS-DA模型對四個等級渣馴區(qū)分良好， 外部驗證試驗結(jié)果顯示， ZX1-19， ZX2-20， ZX3-21和ZX4-16都正確地與相應(yīng)品種聚為一類， 證明PLS-DA方法對四個等級渣馴具有良好的鑒別能力。 本研究使用的渣馴樣品均需熬膏后使用， 不但有助于鑒定渣馴藥材， 同時也對渣馴膏的品質(zhì)評判提供了依據(jù)。