日糧物理有效中性洗滌纖維對奶牛瘤胃細菌組成的影響

趙聰聰,王碭碭,王 菁,李 永,姚軍虎,曹陽春

(西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

隨著奶牛養(yǎng)殖集約化程度的提高，全混合日糧(TMR)的使用越來越普遍[1]，同時，由于奶牛品種的選種選育，奶牛的產(chǎn)奶量迅速提升。我國優(yōu)質(zhì)粗飼料缺乏，為了滿足奶牛能量的需要，往往采用高精料日糧[2]。但是高精料日糧的使用會引起反芻動物急性或亞急性瘤胃酸中毒(SARA)，影響機體健康[3-5]，同時持續(xù)性的瘤胃酸中毒會引發(fā)反芻動物肢蹄病，減少動物使用年限[2]。在美國，大約有19%的泌乳早期奶牛和26%的泌乳中期奶?；加蠸ARA[6]。在德國和荷蘭，約11%的泌乳早期奶牛和18%的泌乳中期奶?；即瞬7]。因此，動物的生產(chǎn)性能和健康似乎成為了不可調(diào)和的矛盾。

奶牛日糧中NDF水平在很大程度上影響瘤胃健康，同時，飼料的物理特性在很大程度上影響動物的咀嚼與反芻時間，進而影響瘤胃pH[8-9]。因此，為了避免SARA在高產(chǎn)奶牛中的發(fā)生，NRC指出，如果以玉米青貯和苜蓿青貯為粗飼料的主要來源，則奶牛日糧中中性洗滌纖維(NDF)含量不應低于25%[10]。但是有研究發(fā)現(xiàn)，即使NDF含量滿足要求，牛也可能出現(xiàn)跛行現(xiàn)象[2]，這說明僅NDF不足以評估反芻動物的日糧品質(zhì)以及動物健康。

Mertens[11]提出了物理有效中性洗滌纖維(peNDF)的概念，即因飼料長度、粒徑、韌性等物理特性引起動物反芻、咀嚼等生理活動及影響瘤胃內(nèi)容物兩相性質(zhì)的那部分NDF，其在數(shù)值上等于NDF含量與物理有效因子(pef)的乘積(pef是用來衡量不同種類粗飼料及不同長度的相對物理有效性)[12]。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，隨著日糧中peNDF與瘤胃可降解淀粉比例的降低，瘤胃pH低于5.8和5.6的時間呈線性增加，乙酸摩爾比下降，而丙酸摩爾比增加。Li等[4]的另一項試驗研究發(fā)現(xiàn)，降低日糧中peNDF8.0含量(從20.5降低到8.4)可以提高山羊瘤胃總VFA的量，增加琥珀酸纖維桿菌和黃色瘤胃球菌的相對豐度。表明改變?nèi)占ZpeNDF水平可能會影響瘤胃發(fā)酵，同時影響瘤胃細菌的組成。

因此本試驗在高精料日糧的背景下，通過改變TMR的攪拌時間，獲得不同peNDF水平的日糧，利用高通量測序技術(shù)探究不同peNDF水平日糧對奶牛瘤胃細菌組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗日糧 本試驗日糧組成和營養(yǎng)水平見表1。通過調(diào)整TMR的攪拌時間(10、18和60 min)制成3種不同peNDF8.0日糧：高(11.25%)、中(10.56%)和低(9.02%)peNDF8.0(表2)。

表1 日糧組成與營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

表2 不同攪拌時間TMR日糧粒度分布

1.1.2 試驗動物及試驗設(shè)計 選取12頭、2胎次的荷斯坦奶牛(產(chǎn)奶量為33.0±1.7 kg/d、泌乳天數(shù)131±8 d)隨機分為3組，分別飼喂高(11.25%)、中(10.56%)和低(9.02%)水平的peNDF8.0日糧。試驗期為25 d，其中預試期21 d，正試期4 d。每天于8:00和15:00飼喂兩次，自由飲水。

1.1.3 樣品采集 在試驗第22-24天連續(xù)3 d采集TMR樣品，使用賓夕法尼亞篩(PSPS)進行pef測定[14-15]。將3天的樣品等比例混樣后進行化學成分分析。試驗期最后一天晨飼前通過瘤胃穿刺法采集瘤胃液進行細菌多樣性測序。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 使用QIAamp DNA Stool試劑盒進行DNA提取，并用NanoDrop2000進行DNA濃度和純度檢測。

1.2.2 細菌16S rRNA的高通量測序 使用正向引物：5'-AYTGGGYDTAAAGNG-3'和反向引物：5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'對細菌V4區(qū)進行PCR擴增。擴增體系為25 μL，包括2 μL的DNA模板，每種引物1 μL(10uM)，2 μL的dNTP(2.5 mM)，5 μL 5×Q5緩沖液，5 μL 5×Q5 GC增強劑以及0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶(5 U/μL)。擴增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用QIAGEN凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。擴增構(gòu)建Miseq文庫并采用Illumina Miseq(Illumina，USA)上機測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 運用Qimme進行序列過濾[16]，運用Mothur去除嵌合體[17]。將獲得的優(yōu)質(zhì)序列以97%的相似度進行聚類，最長的被指定為操作分類學單位(OTU)，調(diào)用BLAST[18]的方法對序列與Greengene數(shù)據(jù)庫比對[19]，獲得每個OTU的分類學信息。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 用Excel進行數(shù)據(jù)的簡單整理，采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，LSD法多重比較。P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 基本信息統(tǒng)計及稀釋曲線

12份瘤胃液樣品共獲得868 623條高質(zhì)量序列，平均每個樣品有72 385條序列，共計15 631個OTU。從稀釋曲線來看，隨著樣本測序深度增加，曲線越趨于平穩(wěn)，說明測序量足夠(圖1)。

圖1 樣本稀釋曲線

2.2 Alpha多樣性指數(shù)分析

Alpha多樣性用于反映微生物群落的多樣性和豐富度，本試驗采用Chao1和ACE指數(shù)反映群落豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)反映群落多樣性。由表3可知，低peNDF8.0日糧組的菌群豐富度指數(shù)ACE有低于其它兩組的趨勢(P<0.10)，其余多樣性指數(shù)在3組間無顯著差異。

表3 不同peNDF8.0 水平日糧對奶牛瘤胃細菌α多樣性的影響

2.3 不同分類水平的群落組成分析

在門水平上，共鑒定出了22個門 (圖2)。其中擬桿菌門(Bacteroidetes，80.79%～87.37%)、厚壁菌門(Firmicutes，8.40%～10.27%)、變形菌門(Proteobacteria，2.24%～6.63%)為3組間共有優(yōu)勢菌門，其余菌門的相對豐度均小于1%。隨著日糧peNDF8.0水平的降低，擬桿菌門相對豐度減少，而厚壁菌門和變形菌門相對豐度增加。

圖2 門水平組成柱狀圖

由表4可知，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、S24-7在3組中相對豐度都大于1%，為共有優(yōu)勢菌科。此外，BS11在高peNDF8.0組和中peNDF8.0組中相對豐度高于1%，為優(yōu)勢菌科，且顯著高于低peNDF8.0組(P<0.05)。

表4 不同peNDF8.0 水平日糧對奶牛瘤胃細菌科、屬水平的影響(TOP 15)

3組間唯一共有優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬(Prevotella)，其相對豐度高達62.9%以上，遠高于其它屬。中peNDF8.0組丁酸弧菌屬豐度高于1%，其余各屬豐度均小于1%，且各組間差異不顯著。與纖維消化相關(guān)的2個屬的(瘤胃球菌屬Ruminococcus，纖維桿菌屬Fibrobacter)相對豐度也低于1%。

3 討 論

哺乳動物腸道中微生物組成受多種因素的影響，其中日糧的影響最為直接。Sonnenburg[20]研究發(fā)現(xiàn)高纖維日糧能夠增加微生物菌群多樣性。張紅濤[21]發(fā)現(xiàn)，隨著日糧NDF水平的升高，瘤胃細菌豐富度和多樣性都顯著上升。這些結(jié)果都表明日糧纖維的含量能夠顯著影響腸道微生物菌群，且菌群多樣性隨纖維含量的升高而升高。本試驗日糧NDF的含量是一致的，由于攪拌時間的不同，使得日糧纖維的物理有效性發(fā)生改變。隨著日糧peNDF8.0水平的降低，瘤胃細菌豐富度有下降的趨勢。因此推測日糧纖維的長度對微生物組成也有調(diào)控作用，但其機制有待進一步研究。

擬桿菌門和厚壁菌門為瘤胃中絕對優(yōu)勢菌門，但其比例隨日糧精粗比的改變而適當變化[22]。當日糧纖維含量從88.0%下降到57.5%時，厚壁菌門相對豐度大幅下降，而擬桿菌門相對豐度大幅上升[22]。楊碩[23]的試驗結(jié)果表明，補飼精料的青年絨山羊瘤胃中擬桿菌門的豐度升高，厚壁菌門降低。這可能是因為厚壁菌門包含很多具有纖維降解功能的微生物[24-25]。本試驗使用高精料日糧，擬桿菌門相對豐度遠高于厚壁菌門，與前人研究結(jié)果一致。普雷沃氏菌屬為本試驗中優(yōu)勢菌屬，這與奶牛[26-27]，綿羊[28]和肉牛[29]的研究結(jié)果一致。普雷沃菌屬在泌乳奶牛瘤胃中相對豐度可高達50%[23]，可能與普雷沃氏菌在瘤胃中參與廣泛的物質(zhì)代謝有關(guān)。有研究表明，普雷沃氏菌屬可參與淀粉的消化和利用、半纖維素和果膠的消化以及蛋白質(zhì)或肽的代謝[30]。

隨著日糧peNDF8.0降低，BS11科的相對豐度顯著下降。有研究發(fā)現(xiàn)，幼齡湖羊補飼開食料后瘤胃中BS11相對豐度顯著升高[31]。同時，Solden等[32]發(fā)現(xiàn)提高日糧半纖維素和木質(zhì)素含量，可使BS11的含量大大增加。說明BS11科很可能具有纖維降解功能，且對日糧纖維含量和有效性敏感。

Zhao等[33]的研究表明，隨著日糧peNDF增加，動物反芻和總咀嚼的時間呈線性增加，且瘤胃pH低于5.8的時間呈線性減少。Cao等[34]的研究也表明，增加黑麥草顆粒長度可以提高瘤胃的平均pH，降低瘤胃pH低于6.0的時間。說明日糧的物理有效性能夠顯著影響動物的反芻行為，進而影響唾液分泌量，從而影響瘤胃pH。而瘤胃微生物有其最適的酸堿度，pH過低時往往對纖維降解菌不利。本試驗基于現(xiàn)代化牧場高精料日糧的背景，通過減少TMR攪拌時間，適度增加纖維的物理有效性來探究對瘤胃微生物的影響。發(fā)現(xiàn)3種peNDF8.0日糧處理下，僅觀測到BS11科差異顯著。這表明日糧纖維的物理有效性也通過某種機制會對瘤胃微生物產(chǎn)生影響。但由于本試驗3種日糧peNDF8.0差異較小，僅對物理有效性最為敏感BS11產(chǎn)生影響。

4 結(jié) 論

在高精料日糧下，peNDF8.0水平從9.02%上升至11.25%使得奶牛瘤胃細菌豐富度有上升的趨勢，且BS11菌科隨peNDF8.0水平的上升顯著提高，說明日糧的物理有效性能夠?qū)α鑫肝⑸锝M成和豐度產(chǎn)生影響。造成本試驗結(jié)果差異不顯著的原因可能是日糧精料含量過高，且3種日糧peNDF8.0水平差異不是很大。由此推測適當下調(diào)精料比例或者增加日糧纖維的物理有效性能夠改變瘤胃微生物組成，進而可能實現(xiàn)反芻動物的健康高產(chǎn)。