核糖體小亞基V4和V9區(qū)引物擴(kuò)增大亞灣真核浮游生物的比較研究

郭雨沛, 黃良民, 鐘瑜, 陳靖夫, 譚燁輝, 陳綿潤, 邱大俊,*

核糖體小亞基V4和V9區(qū)引物擴(kuò)增大亞灣真核浮游生物的比較研究

郭雨沛1,2, 黃良民1,2, 鐘瑜1, 陳靖夫1,2, 譚燁輝1,2, 陳綿潤3, 邱大俊1,2,*

1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 中科院熱帶生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510301 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 101408 3. 國家海洋局南海規(guī)劃與環(huán)境研究院，廣州 510300

對大亞灣水體的環(huán)境DNA分別進(jìn)行18S rDNA的V4和V9區(qū)的引物擴(kuò)增, 通過高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序, 并比較分析二者浮游真核生物基因多樣性和相對豐度。18S rDNA V4區(qū)引物擴(kuò)增共檢測出浮游動物56 綱, 101 目, 浮游植物52 綱, 69 目; 18S rDNA V9區(qū)引物擴(kuò)增共檢測出浮游動物47 綱, 81目, 浮游植物56 綱, 101 目。兩對引物對浮游真核生物擴(kuò)增都具有較高覆蓋度, 在綱級別上二者的結(jié)果相近: 顎足綱(Maxillopoda)是浮游動物優(yōu)勢類群; 甲藻綱(Dinophyceae)、圓篩藻綱(Coscinodiscophyceae)、小豆藻綱(Mamiellophyceae)是浮游植物優(yōu)勢類群, 其中甲藻綱多樣性與豐度的結(jié)果相近, 而18S rDNA V9區(qū)引物擴(kuò)增得到的圓篩藻綱豐度高于18S rDNA V4區(qū)引物。分析結(jié)果表明, 18S rDNA V4區(qū)引物擴(kuò)增的浮游動物多樣性比18S rDNA V9區(qū)引物高, 而18S rDNA V9區(qū)引物擴(kuò)增的浮游植物多樣性比18S rDNA V4區(qū)引物高。同時, 通過高通量測序技術(shù)首次確定大亞灣海區(qū)大量存在著寄生型甲藻(Syndiniales), 小豆藻目(Mamiellales)。

高通量測序; 真核浮游生物; 基因多樣性; 浮游植物; 浮游動物; 大亞灣

0 前言

真核浮游生物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 具有種類多樣性高, 分布廣等特征[1—2]。浮游植物和浮游動物是真核浮游生物的主要類群。浮游植物是海洋初級生產(chǎn)力的最主要的貢獻(xiàn)者, 為維持生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞提供了重要的基礎(chǔ)[1]。浮游動物大多為初級消費(fèi)者, 在物質(zhì)循環(huán)、能量傳遞過程中起著重要的作用[3—4]。

近年來, 高通量測量技術(shù)大量應(yīng)用到海洋真核浮游生物基因多樣性的研究, 通過擴(kuò)增環(huán)境樣品中核糖體小亞基基因進(jìn)行浮游生物多樣性分析[5—8]。基于Illumina測樣平臺測序長度的限制, 分別選取核糖體小亞基不同的區(qū)域擴(kuò)增測序[9], 其中堿基變異率較高的V4區(qū)和V9區(qū)應(yīng)用最廣, 這兩個區(qū)域分別有一對引物最常使用[8—10], 但目前已開展不同引物擴(kuò)增近海海域真核生物的比較研究甚少。目前已報道使用高通量測序研究真核浮游生物基因多樣性的海域主要包括太平洋、大西洋(地中海、紅海)、兩極等諸多海域[8,11,12], 研究大多選取18S rDNA V4區(qū)和V9區(qū)引物。各海域真核生物呈現(xiàn)多樣性高與高豐度等特征, 其中囊泡蟲類(Alveolata)占比最多, 一般其序列的豐度占真核生物總豐度的25—40%[12—14], 有些研究區(qū)域高達(dá)50%, 如R. Piredda在地中海海域使用18S rDNA V4區(qū)引物研究中發(fā)現(xiàn)囊泡蟲類占比高達(dá)56%, 其次為不等鞭毛藻類(Stramenopiles)為20%—25%[15]; 而Comeau等人使用18S rDNA V4區(qū)引物發(fā)現(xiàn)北冰洋附近海域的不等鞭毛藻占比較低, 在某些年份甚至低于5%[16]。常見的海洋囊泡蟲類有頂復(fù)門(Apicomplexa)、纖毛蟲(Ciliophora)以及甲藻門(Dinoflagellata)等。其中, 甲藻門占比最高, Wu等在太平洋西北沿岸海域研究顯示其在微微型真核浮游生物中占比可接近60%[17]。Vargas等在Tara全球海洋考察中研究多個海域使用18S rDNA V4區(qū)引物和V9區(qū)引物發(fā)現(xiàn), 大洋區(qū)域的甲藻門豐度占微微型真核浮游生物比例高于近岸海域。甲藻門的群落結(jié)構(gòu)在不同海域分布有所差異, 近岸海域寄生型甲藻約占甲藻綱的一半, 而開闊大洋區(qū)域中寄生型甲藻比例有所提高[18]。Lin等人使用18S rDNA V4區(qū)引物在研究近岸、大陸架和外海中發(fā)現(xiàn)硅藻占比穩(wěn)定, 約為40%[19]。韓郁燁等使用18S rDNA V4區(qū)引物在研究北歐海中發(fā)現(xiàn), 微微型真核浮游生物群落的主要類群為囊泡蟲類(54.61%),主要由甲藻綱(18.42%)和海洋囊泡蟲新類群I(23.01%)組成;后鞭毛類占21.55%,其中真菌在各站中都有較高的相對豐度,為18.86%[20]。李冉等人通過18S rDNA V9區(qū)引物研究南海海域發(fā)現(xiàn)微型浮游植物主要以硅藻為主, 微微型浮游植物主要以綠藻為主[21]。但兩對引物在近海與海灣中對于浮游動物與浮游植物的擴(kuò)增結(jié)果有何差異的認(rèn)識還不夠系統(tǒng)深入, 因此有必要對此開展進(jìn)一步研究。

大亞灣位于南海北部, 毗鄰珠江河口, 受河口低鹽水與外海高鹽水共同影響。水體交換能力較弱, 受自然環(huán)境和人類活動的影響, 生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多樣, 是我國海洋生物多樣性最高的區(qū)域之一[22—23]。大亞灣海域浮游生物使用傳統(tǒng)的分類方法共鑒定出浮游植物8 門156 種[24—25], 浮游動物8 門275 種[26], 物種組成和豐度分布有明顯的季節(jié)性和區(qū)域性差異: 夏季浮游生物多樣性略高, 灣內(nèi)多樣性高于灣外[27—28]。目前, 大亞灣基于分子測序技術(shù)進(jìn)行物種多樣性的研究較少。Jiang等人使用rbcL區(qū)引物發(fā)現(xiàn)大亞灣浮游植物優(yōu)勢種為硅藻[29]。然而, 大亞灣海區(qū)還未系統(tǒng)開展高通量測序技術(shù)分析真核浮游生物基因的多樣性及其群落結(jié)構(gòu)及其不同引物的比較研究。

本文進(jìn)行大亞灣水體環(huán)境DNA的18S rDNA V4和V9區(qū)引物擴(kuò)增, 通過高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序, 分析大亞灣浮游真核生物的基因多樣性及相對豐度, 并對兩種引物擴(kuò)增真核浮游生物的結(jié)果進(jìn)行比較分析, 明確大亞灣真核浮游生物群落的組成, 評估兩對引物在擴(kuò)增海灣區(qū)域真核浮游動物與浮游植物的差異性和適用性。本文可為我國海灣與近海浮游真核生物基因多樣性的研究提供方法參考與科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2013年4月, 選取大亞灣常規(guī)調(diào)查站位S1、S9以及S10進(jìn)行采集水樣(圖1)。使用5 L Niskin瓶采集表層水樣, 水樣通過3 μm濾膜過濾后, 再通過0.2 μm濾膜進(jìn)行過濾, 分別收集3 μm和0.2 μm濾膜放入不同的1.5 mL離心管, 加入DNA lysis保護(hù)液進(jìn)行常溫保存[29]。回到實(shí)驗(yàn)室后, 轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱中保存。

圖1 大亞灣調(diào)查站位分布

Figure 1 Distribution of survey stations in Daya Bay

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增和測序

裂解緩沖液保存的樣品加入蛋白酶K并置于55 ℃水浴24小時, 使用CTAB法提取DNA, DNA溶液保存在-20 ℃冰箱中[30]。

真核浮游生物的擴(kuò)增分別選取目前最為常用的18S rDNA V4區(qū)和V9區(qū)的兩對引物, 分別為V4F和V4R、V9F和V9R[8,16]。以1 μl提取的DNA作為模版, 采用25 μl反應(yīng)體系(SuperStar Plus PCR MIX, Genestar)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR退火溫度分別為46 ℃(V4)和48 ℃(V9)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化回收, 采用Illumina Novaseq技術(shù)測序平臺(PE250)進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)控、過濾獲得有效序列。通過降噪(Divisive Amplicon Denoising Algorithm)得到不含擴(kuò)增與測序錯誤、不含嵌合體的生物學(xué)序列, 序列去重(Dereplication, 相當(dāng)于以100%相似度聚類)獲得單堿基精度的代表序列, 利用ASVs (Amplicon Sequence Variants)的概念將代表序列構(gòu)建成的OTU(Operational Taxonomic Units)[27]。基于OTU數(shù)量通過 Vegan 包計算分析每個樣品的稀釋曲線[28]。分別篩選出每個樣品浮游植物的 OTU 數(shù)據(jù), 并與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋, 分析每個樣品不同分類水平的OTU豐度與真核生物的群落結(jié)構(gòu)組成(參數(shù)閾值: e value-5)。繪制不同分類水平真核生物群落結(jié)構(gòu)組成圖; 當(dāng)物種數(shù)較多時, 選取序列條數(shù)大于全部樣品測序總量0.01%的物種進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果和分析

大亞灣3 個站位水樣通過18S rDNA V4區(qū)引物擴(kuò)增得到486437 條序列, 單個樣品擴(kuò)增得到的序列條數(shù)為77719—84902 條序列, 共獲得1519 條 OTU(表1)。18S rDNA V9 區(qū)引物擴(kuò)增共得到446614 條序列, 單個樣品擴(kuò)增得到序列條數(shù)為63341—80664, 共獲得1821 條OTU(表1)。18S rDNA V4區(qū)和V9區(qū)得到的OTU的稀釋曲線均在測序sequence達(dá)到5 萬條后逐漸平緩, 覆蓋率達(dá)到99%, V4區(qū)和V9區(qū)引物擴(kuò)增得到的序列能夠覆蓋并呈現(xiàn)出樣品中真核浮游生物多樣性(圖2)。

2.1 兩種引物擴(kuò)增結(jié)果的比較

兩對引物擴(kuò)增得到的結(jié)果存在著明顯的差異(圖3)。18S rDNA V4區(qū)引物擴(kuò)增出浮游生物6 類, 隸屬于43 門, 94 綱, 184 目(表1)。18S rDNA V9區(qū)引物擴(kuò)增出7 類 , 隸屬于40 門, 85 綱, 171 目(表1)。在本研究中, V4區(qū)和V9區(qū)引物分別沒有擴(kuò)增得到古蟲類和變形蟲類(表2)。

18S rDNA V4區(qū)引物檢測出浮游動物34 門, 56 綱, 101 目, 其中顎足綱占絕對優(yōu)勢, 同時檢測到較高豐度的纖毛蟲(圖4e—h)。18S rDNA V9區(qū)鑒別出浮游動物31 門, 47 綱, 81 目, 其中顎足綱同樣豐度最高, 但未檢測到纖毛蟲(圖4e-h)。18S rDNA V4區(qū)引物擴(kuò)增檢測出浮游植物9 門, 52 綱, 69 目, V9區(qū)鑒別出9 門, 52 綱, 75 目(圖5e-h)。18S rDNA V4區(qū)引物擴(kuò)增結(jié)果檢測得到甲藻門主要由寄生型甲藻、溝膝藻目和裸甲藻目組成, 其中寄生型甲藻占比最高; 硅藻門主要由海鏈藻目組成。18S rDNA V9區(qū)引物擴(kuò)增結(jié)果檢測得到甲藻門中膝溝藻目豐度最高, 硅藻門主要圓篩藻目組成, 綠藻門中小豆藻目占比最高(圖5e-h)。兩對引物對豐度較小的物種檢測出的結(jié)果差距較大。

表1 大亞灣6個樣品的序列與OTUs數(shù)量

圖2 樣品稀釋曲線

Figure 2 Rarefaction curve of each sample

注: a. 三個站位小型和微型浮游生物V4區(qū)擴(kuò)增得到OTUs數(shù)量Veen圖; b. 三個站位微微型浮游生物V4區(qū)擴(kuò)增得到OTUs數(shù)量Venn圖; c. 三個站位小型和微型浮游生物V9區(qū)擴(kuò)增結(jié)果得到OTUs數(shù)量Veen圖; d. 三個站位微微型浮游生物V9區(qū)擴(kuò)增得到OTUs數(shù)量Veen圖。

Figure 3 Venn diagram of OTUs abundance using V4 and V9 primers amplification at three stations samples in Daya Bay

2.2 大亞灣真核浮游生物基因多樣性

6 個樣品共檢測到真核浮游生物49 門, 107 綱, 415 目; 包括后鞭毛生物(Opisthokonta, 包括動物和真菌)、囊泡蟲類、不等鞭毛藻、變形蟲(Amoebozoa)、有孔蟲(Rhizaria)、古蟲(原Excata, 現(xiàn)Discoba)、綠色植物(Viridiplantae)等(表1)。18S rDNA V4 區(qū)引物共檢測到小型和微型浮游生物(≥3 ) 有效序列611 條, 18S rDNA V9區(qū)引物共檢測到有效序列1156 條, 鑒定出大亞灣小型和微型浮游生物6 類(沒有檢測到變形蟲)(表2), 40 門, 81 綱, 168 目(表2); 其中占比最高的類群是后鞭毛生物, 其次為囊泡蟲類和不等鞭毛蟲; 優(yōu)勢門類為節(jié)肢動物門(Opisthokonta: Arthropoda), 甲藻門(Alveolata: Dinoflagellata), 硅藻門(Stramenopiles: Bacillariophyta) (表2)。18S rDNA V4區(qū)引物共檢測到微微型浮游生物(0.2-3 μm)的有效序列1277 條, 18S rDNA V9 區(qū)引物共檢測到有效序列1345 條, 檢測出7 類微微型浮游生物, 49 門, 106 綱, 227 目; 其中占比最高的類別為囊泡蟲類, 其次為不等鞭毛蟲、浮游植物和未定地位的種類。優(yōu)勢門類依次為甲藻門, 節(jié)肢動物門, 綠藻門(Viridiplantae: Chlorophyta)。微微型浮游生物樣品中未分類的OTU占比達(dá)到7%(圖4a—d, 圖5a—d)。

表2 大亞灣真核浮游生物大類豐度情況

2.2.1 大亞灣浮游動物基因多樣性

三個站位共檢測到小型和微型浮游動物24 門, 54 綱, 91 目。節(jié)肢動物門占絕對優(yōu)勢, 占比79.1%。其次為脊索動物門(Chordata), 占比6%。優(yōu)勢類群包括哲水蚤目(Calanoida)、劍水蚤目(Cyclopoida), 這兩目占到全部種類的73%, 簾蛤目(Veneroida)等緊隨其后(圖4)。浮游動物豐度的優(yōu)勢種占據(jù)絕對地位。微微型浮游動物32門, 62綱, 92目。在浮游動物中節(jié)肢動物門仍然占優(yōu)勢, 但相對3 μm樣品而言, 占比下降, 僅為28%。其次為環(huán)節(jié)動物門(Annelida)和纖毛門(Ciliophora)分別占14%和7%。優(yōu)勢類群包括葉須蟲目(Phyllodocida)、環(huán)節(jié)哲水蚤目(Calanoida)、劍水蚤目(Cyclopoida), 這三目占比均勻, 占全部種類的45%, 與浮游植物類似, 一些無法準(zhǔn)確鑒定的種類占到全部浮游動物的15%。

2.2.2 大亞灣浮游植物基因多樣性

大亞灣小型和微型浮游植物10門, 23綱, 67目。甲藻門、硅藻門在浮游植物中占絕對優(yōu)勢, 甲藻門占比63%, 硅藻門30%。優(yōu)勢類群包括溝膝藻目(Gonyaulacales)、裸甲藻目(Gymnodiniales)、海鏈藻目(Thalassiosirales), 這三目占到全部種類的50%, 多甲藻目(Peridiniales)和硅藻目(Bacillariales)緊隨其后, 相對豐度占比超過1%的均是甲藻門和硅藻門中的類別(圖5)。

大亞灣微微型浮游植物9門, 27綱, 91目。甲藻門、綠藻門在浮游植物中占絕對優(yōu)勢, 甲藻門占比60%, 硅藻門17%, 其次為隱藻門(Cryptophyta)和硅藻門。優(yōu)勢類群包括寄生性甲藻目(Syndiniales)與小豆藻目(Mamiellales)這兩目占到全部種類的43%, 另外, 未確定分類地位的類群中甲藻綱和綠藻綱占比也較高, 占浮游植物總序列的26%。

3 討論

3.1 高通量測序測定真核浮游生物多樣性的優(yōu)缺點(diǎn)分析

基于Illumima MiSeq二代高通量測序平臺的高通量測序技術(shù), 較低的費(fèi)用就能獲得幾十萬到幾百萬條DNA分子序列, 檢測出樣品中不同的物種類群以及基因豐度比值[33,34]。本研究采用兩組引物對大亞灣樣品進(jìn)行高通量測序分析, 鑒定樣品的物種多樣性。2013年4月大亞灣海域浮游植物中甲藻綱占比最高, 其次為圓篩藻綱或小豆藻綱, 浮游動物中則是顎足綱占比最高。高通量測序的結(jié)果與傳統(tǒng)鏡檢對大亞灣調(diào)查結(jié)果不同, 大亞灣海區(qū)傳統(tǒng)調(diào)查鏡檢發(fā)現(xiàn)在不同的季節(jié), 各物種豐度有所變化, 但浮游植物最高豐度的類群都是硅藻門的圓篩藻綱, 其中以骨條藻占絕對優(yōu)勢, 其次為甲藻綱, 其中原甲藻目占比最高[35—38]。而浮游動物則以軟體動物為主, 其次為節(jié)肢動物類。環(huán)境樣品高通量測序得到真核浮游生物的相對豐度和物種多樣性與常規(guī)鏡檢調(diào)查結(jié)果有所差異是正常現(xiàn)象[18]。基因多樣性與形態(tài)多樣性是兩個不同的比較層級。即使是單個細(xì)胞中, 核糖體基因也可能存在多個拷貝, 不同種群生物之間的基因拷貝數(shù)差異很大。在一些物種中這種基因拷貝數(shù)差異可以高達(dá)3 個數(shù)量級, 因此基因擴(kuò)增表達(dá)出的結(jié)果與不同物種的細(xì)胞豐度存在巨大差異[39,40]。同時這種多拷貝與生物體大小并無關(guān)系, 一些單細(xì)胞的甲藻和纖毛蟲生物也被證實(shí)包含多個核糖體基因拷貝[41—42]。綠藻綱在高通量測序結(jié)果中占比比鏡檢數(shù)據(jù)高, 而傳統(tǒng)鏡檢僅統(tǒng)計細(xì)胞較大綠藻的種類[35—38], 其原因是傳統(tǒng)鏡檢方法很難對小體積高豐度的綠藻進(jìn)行鑒定與計數(shù)。調(diào)查中微微型樣品中綠藻的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于微型樣品, 這些小體積的綠藻無法通過鏡檢鑒定。研究中發(fā)現(xiàn)高通量測序得到的基因多樣性高于常規(guī)鏡檢得到的物種數(shù)量, 常規(guī)鏡檢中很少觀測到Chromerida、Mediophyceae等種類。高通量測序需要的采樣體積需求量更少, 覆蓋面更廣, 獲取的研究結(jié)果更為全面。其次, 由于物種基因多拷貝以及基因突變的存在, 目標(biāo)基因片段存在多態(tài)性, 這也會造成基因多樣性高估。以硅藻為例, 單個細(xì)胞的多態(tài)性可以達(dá)到0.5%—2%, 這種多態(tài)性也會高估其多樣性[9,43]。V4區(qū)和V9區(qū)基因擴(kuò)增均檢測到樣品中有大量的未命名序列, 這說明大亞灣存在許多小粒徑的未鑒定藻類。浮游動物以及游泳動物遷移過程中, 停留在水體中的糞便與脫落的體表碎片同樣會被高通量測序的檢測到, 相對于傳統(tǒng)的鑒定方法, 其更加靈敏。

注: 小型和微型浮游動物分別在門(a)、綱(e)、目(i)級別群落OTUs豐度圖; 小型和微型浮游動物分別在門(b)、綱(f)、目(j)級別群落組成相對豐度圖; 微微型浮游動物分別在門(c)、綱(g)、目(k)級別群落OTUs組成圖; 微微型浮游動物分別在門(d)、綱(h)、目(i)級別群落組成相對豐度圖。

Figure 4 Compared V4 and V9 marker absolute abundance and relative abundance of zooplankton at different taxonomic levels of three stations in Daya bay

注: 兩種引物得到小型和微型浮游植物分別在門(a)、綱(e)、目(i)級別群落組成圖; 兩種引物得到小型和微型浮游植物分別在門(b)、綱(f)、目(j)級別群落組成相對豐度圖; 兩種引物得到微微型浮游植物分別在門(c)、綱(g)、目(k)級別群落組成圖; 兩種引物得到微微型浮游植物分別在門(d)、綱(h)、目(i)級別群落組成相對豐度圖。

Figure 5 Compared V4 and V9 marker absolute abundance and relative abundance of phytoplankton at different taxonomic levels of three stations in Daya bay

大亞灣樣品18S rDNA V4區(qū)與V9區(qū)引物擴(kuò)增結(jié)果顯示, 微型樣品中浮游植物以甲藻、硅藻為主, 微微型樣品以寄生性甲藻為主。北歐海區(qū)使用18S rDNA V4區(qū)引物研究微微型浮游植物中也發(fā)現(xiàn)寄生性甲藻為優(yōu)勢類群[20]。與rbcL引物主要針對自養(yǎng)藻類進(jìn)行擴(kuò)增[29], 而18S rDNA V4區(qū)和V9區(qū)引物能夠擴(kuò)增出異養(yǎng)的生物, 包括寄生性甲藻。

3.2 V4區(qū)引物與V9區(qū)引物擴(kuò)增結(jié)果的比較

18S 區(qū)域變異相對保守, 是常見的真核浮游生物的目標(biāo)區(qū)域[44], 目前使用較多的是18S rDNA V1—3, V4和V9區(qū)引物, V1—3(500bp左右)區(qū)域引物的目標(biāo)條帶相對保守, 只能鑒定到綱或門水平[43]。過去18S rDNA V4區(qū)和V9區(qū)引物的擴(kuò)增的結(jié)果較少進(jìn)行直接的對比分析。長片段序列在鑒定中結(jié)果更準(zhǔn)確, 短片段序列在目以下的級別分類中, 不同的種屬的序列特征常相同, 無法明確其在種屬水平上的分類地位[18]。實(shí)驗(yàn)中18S rDNA V4區(qū)目標(biāo)片段450bp, 用來比對的長度約為380bp, 而18S rDNA V9區(qū)引物目標(biāo)片段250bp, 用來比對的長度約為170bp, 18S rDNA V9區(qū)引物由于擴(kuò)增片段長度問題, 在較低級別上難以區(qū)分。本研究中使用的兩對引物在鑒定物種的結(jié)果顯示18S rDNA V9區(qū)比V4區(qū)引物分辨力更弱。

通過研究發(fā)現(xiàn), 兩對引物在浮游植物和浮游動物鑒定能力上有所區(qū)別, 18S rDNA V4引物擴(kuò)增結(jié)果對浮游動物的覆蓋度高于18S rDNA V9引物, 而18S rDNA V9區(qū)引物擴(kuò)增結(jié)果能夠更全面地覆蓋浮游植物, 兩對引物關(guān)于浮游植物鑒定的差距遠(yuǎn)低于浮游動物。張莉等在黃海區(qū)域中進(jìn)行比較研究也發(fā)現(xiàn)基于18S r DNA V9擴(kuò)增獲得的浮游植物的多樣性數(shù)目較于18S rDNA V4擴(kuò)增獲得的高[45]。以輪藻門為例, 兩對引物的檢測結(jié)果不僅在豐度上差異巨大, 多樣性也難以覆蓋。整體說來, 針對甲藻門和綠藻門浮游植物, 18S rDNA V9區(qū)的覆蓋度高于18S rDNA V4區(qū), 而兩對引物對硅藻門以及其他藻類的的鑒定可以相互補(bǔ)充。兩對引物都檢測出大量未命名的甲藻門和綠藻門藻類, 其中18S rDNA V4區(qū)引物檢測出的未命名藻類高于18S rDNA V9區(qū)引物的結(jié)果。18S rDNA V4與18S rDNA V9區(qū)變異程度不同, 兩對引物在物種多樣性以及豐度鑒定中存在著一定差異, 因此覆蓋度也所差別[18]。18S rDNA V9區(qū)的短片段在低級別鑒定中無法區(qū)別序列相似物種導(dǎo)致低級別18S rDNA V9區(qū)多樣性有所降低。除目標(biāo)片段序列變異度的差異外, 18S rDNA V4 區(qū)引物三維立體結(jié)構(gòu)更復(fù)雜[46], 在擴(kuò)增以及測序過程中帶來更多的少堿基變異產(chǎn)物, 因此在低分類水平上反而體現(xiàn)出物種多樣性。這種由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜導(dǎo)致的突變同樣可以解釋18S rDNA V4區(qū)引物擴(kuò)增產(chǎn)物在各物種中都存在比18S rDNA V9區(qū)引物更多的未命名物種藻類的現(xiàn)象。本次研究中發(fā)現(xiàn)18S rDNA V9區(qū)引物擴(kuò)增出的硅藻類整體豐度較高, 但無法擴(kuò)增纖毛蟲類的生物。Stock等人指出18S rDNA V4 區(qū)引物能夠擴(kuò)增出一些特定的物種序列, 可能是因?yàn)?8S rDNA V9 區(qū)引物更易擴(kuò)增出其他物種, 削弱了其對一些物種的擴(kuò)增[8], 凸顯出18S rDNA V4區(qū)引物對一些種類的擴(kuò)增能力。

4 結(jié)論

本次研究確定了18S rDNA V4區(qū)和18S rDNA V9區(qū)兩對引物都能擴(kuò)增出大亞灣浮游真核生物絕大多數(shù)類群, 但兩對引物存在一定的差異。18S rDNA V4引物擴(kuò)增結(jié)果中浮游動物的多樣性高于18S rDNA V9引物的結(jié)果, 而18S rDNA V9區(qū)引物的結(jié)果浮游植物多樣性高于18S rDNA V4區(qū)引物的結(jié)果, 同時明確18S rDNA V4區(qū)引物擴(kuò)增序列的分辨率高于18S rDNA V9區(qū)引物擴(kuò)增序列。明確了2013年4月大亞灣浮游真核生物具有很高的多樣性, 共8 門, 22 綱, 51 目。小型和微型浮游真核生物中哲水蚤目種類的豐度最高, 浮游植物以甲藻門為主, 包括裸甲藻目以及膝溝藻目; 微微型浮游生物中浮游動物主要以葉須蟲目為主, 浮游植物中甲藻為為優(yōu)勢類群, 確定了大量未定名種類的存在。首次確定了大亞灣海區(qū)存在著大量寄生性甲藻目與小豆藻目的藻類。

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Comparison of eukaryotic plankton compositions using 18S rRNA gene V4 and V9 primers amplification in Daya Bay

GUO Yupei1,2, HUANG Liangmin1,2, ZHONG Yu1, CHEN Jingfu1,2, TAN Yehui1,2, CHEN Mianrun3,Qiu Dajun1,2,*

1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of OceanologyChinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408, China 3. South China Sea Institute of Planning and Environmental Research, SOA, Guangzhou 510300, China

We compared the genetic diversity and relative abundance of eukaryotic plankton in Daya Bay using two genetic markers(18S rRNA V4 and V9 regions) to amplify the eDNA and high-throughput sequencing technology. 56 classes, 101 orders of zooplankton and 52 classes, 69 orders of phytoplankton were detected using 18S rDNA V4 markers. And 47 classes, 81 orders of zooplankton and 56 classes, 101 orders of phytoplankton were detected using 18S rDNA V9 markers. Both 18S rDNA V4 and V9 regions resultsperformed well to coverage communities and provided similar eukaryotic plankton distribution patterns at class taxonomic level. Maxillopoda is the dominant group of zooplankton, while Dinophyceae, Coscinodiscophyceae and Mamiellophyceae are the dominant groups of phytoplankton. Especially, two genetic markers amplification results present the similar diversity and relative abundance of Dinophyceae at order taxonomic level. The results of 18S rDNA V9region presented higher abundance of Coscinodiscophyceae than that of V4. The results showed that the diversity of zooplankton amplification by 18S rDNA V4 primers was higher than that of 18S rDNA V9 primers, while that of phytoplankton amplification by 18S rDNA V9 primers was higher than that of 18S rDNA V4 primers. In this study, we first report high abundance parasitic Syndiniales and Mamiellales in Daya Bay.

High-throughput sequencing; eukaryotic plankton; gene diversity; phytoplankton; zooplankton; Daya Bay

郭雨沛, 黃良民, 鐘瑜, 等. 核糖體小亞基V4和V9區(qū)引物擴(kuò)增大亞灣真核浮游生物的比較研究[J]. 生態(tài)科學(xué), 2023, 42(1): 242–251.

GUO Yupei, HUANG Liangmin, ZHONG Yu, et al. Comparison of eukaryotic plankton compositions using 18S rRNA gene V4 and V9 primers amplification in Daya Bay[J]. Ecological Science, 2023, 42(1): 242–251.

10.14108/j.cnki.1008-8873.2023.01.028

Q178.53;Q7

A

1008-8873(2023)01-242-10

2021-05-01;

2021-07-21

國家自然科學(xué)基金(42276165, 41776154); 廣州海洋實(shí)驗(yàn)室2019年度人才團(tuán)隊(duì)引進(jìn)項(xiàng)目(GML2019ZD0405)

郭雨沛(1995—), 女, 碩士, 從事浮游植物研究, E-mail: guoyp95@scsio.ac.cn

邱大俊, 男, 博士, 研究員, E-mail: djqiu@scsio.ac.cn