HPLC-MS/MS法快速測(cè)定電子煙油中58種合成大麻素

焦臺(tái)風(fēng)，李亞慶，康 剛，陳深樹，鐘超群，程良紅

（廣東南天司法鑒定所，廣東 深圳 518003）

近年來(lái)，新精神活性物質(zhì)問(wèn)題呈高速發(fā)展蔓延態(tài)勢(shì)，新品種層出不窮，濫用形勢(shì)日趨嚴(yán)峻。合成大麻素作為新精神活性物質(zhì)中最大的家族，具有與四氫大麻酚類似的結(jié)構(gòu)和激動(dòng)大麻素受體的能力，并且能產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的興奮、致幻等效果，是當(dāng)前世界上使用最廣泛的毒品之一[1-3]。濫用人群在攝入合成大麻素后會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，出現(xiàn)幻視、焦慮、抑郁、情緒突變、妄想狂躁、意識(shí)不清等反應(yīng)，長(zhǎng)期吸食會(huì)導(dǎo)致免疫力低下，誘發(fā)精神錯(cuò)亂和自殺傾向[4]，全國(guó)范圍內(nèi)已引發(fā)數(shù)起毒駕、故意傷害、性侵[5]等危害公共安全事件。為了有效遏制合成大麻素類新精神活性物質(zhì)的蔓延，我國(guó)已于2021年7月1日起正式將合成大麻素類新精神活性物質(zhì)整類列管。

關(guān)于合成大麻素類新精神活性物質(zhì)檢測(cè)的報(bào)道，以毒品違法犯罪案件物證鑒定方法居多，主要集中于植物[6]、毛發(fā)[7]、血液[8]、尿液[9]等檢材中，單一品種的合成大麻素的檢測(cè)方法主要有紅外光譜法[10]、氣相色譜質(zhì)譜法[11]、液相色譜質(zhì)譜法[12]、高效液質(zhì)聯(lián)用 法[13]和高分辨液質(zhì)聯(lián)用法[14]等。電子煙油檢材中該類毒品檢測(cè)的分析方法報(bào)道較少，李園園等[15]建立了電子煙油中兩種合成大麻素的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析方法，錢振華等[16]利用超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜和GC-MS定性檢驗(yàn)了電子煙油中的一種合成大麻素。

在涉毒案件的毒品檢測(cè)中，與毛發(fā)、尿液和血液等生物檢材相比，電子煙油檢材具有采樣方式簡(jiǎn)單、易操作、檢材穩(wěn)定和結(jié)果可信性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)作為現(xiàn)代分析科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域最為廣泛使用的分離與檢測(cè)手段，具有檢測(cè)靈敏度高、專屬性強(qiáng)、高通量和高效率等優(yōu)勢(shì)，已在生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)和法庭科學(xué)等領(lǐng)域廣泛使用，尤其是LC-MS/MS技術(shù)，已經(jīng)被應(yīng)用于傳統(tǒng)毒品、動(dòng)植物毒素和精神麻醉類藥物等分析，得到滿意效果。

本文利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS）方法，對(duì)電子煙油中4F-MDMB- BUTICA等58種合成大麻素進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，建立的HPLC-MS/MS定性、定量檢測(cè)電子煙油中合成大麻素類的方法快速、靈敏、高通量，結(jié)果可靠，實(shí)用性強(qiáng)，適用于大批量電子煙油中合成大麻素的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LCMS-8045三重四級(jí)桿高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司），Millipore Milli-Q純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司），AUW220D分析天平（日本島津公司），KQ-250DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司），Nylon-66 0.22 μm微孔濾膜（美國(guó)Millipore公司）。

4F-MDMB-BUTICA等58種合成大麻素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自刑事科學(xué)技術(shù)研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

實(shí)際樣品來(lái)源于深圳市辦案機(jī)關(guān)提供的電子煙油。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取4F-MDMB-BUTICA等58種合成大麻素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.1 mg），置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，配制成1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液；分別移取1 mg/mL的4F-MDMB-BUTICA等58種合成大麻素單標(biāo)儲(chǔ)備液，用甲醇配制成100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封，冷藏保存。

1.3 樣品處理

稱取電子煙油約10 mg，置于15 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋混勻15 s，超聲萃取20 min，冷卻至室溫，高速離心后上清液通過(guò)0.22 μm濾膜，用甲醇稀釋后，轉(zhuǎn)移1 mL至樣品瓶，供HPLC-MS/MS分析。

1.4 基質(zhì)混標(biāo)溶液配制

取空白電子煙油，按1.3所述方法制備空白基質(zhì)溶液，上機(jī)前使用空白基質(zhì)溶液稀釋58種合成大麻素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 HPLC-MS/MS條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱：Restek-Ultra Ⅱ PFPP（100 mm × 2.1 mm × 5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：A為20 mmol/L乙酸銨和0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸緩沖水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0~4.5 min，40%~50% B；4.5~10 min，50%~100% B；10~11 min，100% B；11~14 min，40% B。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI，正離子模式；監(jiān)測(cè)模式：d-MRM模式；霧化器流速：3 L/min；干燥器流速：10 L/min；加熱氣流速：10 L/min；接口電壓：4 000 V；接口溫度：300 ℃。對(duì)碰撞能量（CE）、Q1 Prerod偏差電壓和Q3 Prerod偏差電壓等質(zhì)譜條件優(yōu)化，4FMDMB- BUTICA 等58種合成大麻素的MRM參數(shù)見表1。

表1 58種合成大麻素的多反應(yīng)模式監(jiān)測(cè)參數(shù)Table 1 Optimized MRM parameters of 58 synthetic cannabinoids

續(xù)表1

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了填充料為十八烷基鍵合硅膠的Agilent Poroshell 120 EC-C18液相色譜柱和填充料為五氟苯基丙基鍵合物的Restek-Ultra Ⅱ PFPP液相色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)后者不論在分離效果和峰形上均優(yōu)于前者。由于極性化合物或者疏水作用類似的物質(zhì)的分離在C18柱上保留較弱，而PFPP柱分子中含有5個(gè)氟原子，具有較強(qiáng)的氫鍵作用力和陽(yáng)離子交換作用力，因此本研究選用Restek-Ultra ⅡPFPP液相色譜柱。為提高各待測(cè)物的分離效果，保證檢測(cè)靈敏度，按上述的梯度洗脫方法，得到的4F-MDMB-BUTICA 等58種合成大麻素的總離子流色譜見圖1a。

圖1 58種合成大麻素的總離子流圖（a）和在空白煙油中的基質(zhì)效應(yīng)（b）Fig.1 Total ion chromatograms (a) of 58 synthetic cannabinoids and their matrix effects (b) in blank tobacco oil

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要是確定各化學(xué)物質(zhì)的母離子、子離子以及選擇合適碰撞能量等。本實(shí)驗(yàn)中，取100 ng/mL的合成大麻素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣進(jìn)行母離子掃描，獲取各化學(xué)物質(zhì)母離子，將母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離分析得到二級(jí)全掃描質(zhì)譜特征子離子，選取豐度最大的子離子做MRM參數(shù)優(yōu)化以確定Q1 Prerod偏差電壓、Q3 Prerod偏差電壓和碰撞能量，結(jié)果見表1。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)效應(yīng)是液相色譜-質(zhì)譜法分析時(shí)存在的一個(gè)非常明顯的現(xiàn)象，是由于樣品基質(zhì)、樣品前處理過(guò)程、色譜分離效果、流動(dòng)相和離子化等因素造成的離子增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，從而影響對(duì)目標(biāo)物的定量檢測(cè)。根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)（ME）的公式表述，ME是空白基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之差，與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比。當(dāng)|ME|小于20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)|ME|為20%～50%時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)|ME|大于50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，78%的合成大麻素的ME值為正值，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，22%的合成大麻素為基質(zhì)抑制效應(yīng)，見圖1b。86%的合成大麻素表現(xiàn)出較弱的基質(zhì)效應(yīng)，9%的合成大麻素表現(xiàn)出中等基質(zhì)效應(yīng)，僅5%的合成大麻素為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，因此采用空白基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線法進(jìn)行電子煙油中合成大麻素的定量檢測(cè)。

2.4 線性方程、檢出限、回收率和精密度

以空白煙油為基底，按1.4所述方法配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各合成大麻素的色譜峰峰面積（y）對(duì)進(jìn)樣濃度（x, ng/mL）進(jìn)行回歸計(jì)算，建立基質(zhì)匹配工作曲線，減少基質(zhì)對(duì)定量結(jié)果的影響?？疾旆椒ǖ木€性關(guān)系，線性回歸方程及R2、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）結(jié)果見表2。

表2 58種合成大麻素的線性方程、R2、檢出限及加標(biāo)回收率（n=3）Table 2 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection and spiked recoveries of 58 synthetic cannabinoids (n=3)

續(xù)表2

結(jié)果表明，4F-MDMB-BUTICA 等58種合成大麻素在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)與色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，R2均大于0.99；以3倍信噪比（S/N＝3）對(duì)應(yīng)的含量作為方法的檢出限，為0.5～1 μg/g，以10倍信噪比（S/N＝10）對(duì)應(yīng)的含量作為方法的定量限，均為2.0 μg/g。

取18份空白電子煙油分為3組，按1.3描述進(jìn)行前處理，每組分別以低、中 、高（2.0、10.0、50.0 μg/g）3個(gè)添加水平的加標(biāo)濃度按照優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平做6次平行實(shí)驗(yàn)，使用優(yōu)化后的條件測(cè)定。

結(jié)果顯示，4F-MDMB- BUTICA 等58種合成大麻素的平均加標(biāo)回收率為89.9%～144.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于15%，能夠滿足電子煙油中合成大麻素的測(cè)定要求。

取加標(biāo)濃度為1 μg/g的合成大麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一實(shí)驗(yàn)條件下連續(xù)10次平行實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)方法穩(wěn)定性，分別計(jì)算保留時(shí)間和出峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，4F-MDMB-BUTICA 等58種合成大麻素保留時(shí)間RSD為0.029%～0.252%，峰面積RSD為0.698%～ 1.953%，方法穩(wěn)定性理想。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

按照上述方法，對(duì)深圳市辦案機(jī)關(guān)提供的多份電子煙油進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，主要檢出的合成大麻素有6種，分別為5F-CUMYL-PINACA、5F-MDMBPICA、4F-MDMB-BICA、MDMB-4en-PINACA、4CN-CUMYL- BUTINACA和ADB-BUTINACA，其中MDMB-4en- PINACA檢出的比例高達(dá)70%以上，其在電子煙油中的添加量為1.5~3.0 mg/g；其次為ADB-BUTINACA，添加量為0.5~2.1 mg/g?？瞻谆|(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（50.0 ng/mL）與實(shí)際電子煙油樣品的MRM色譜圖和質(zhì)譜圖見圖2?？梢姡陔娮訜熜袠I(yè)，非法添加合成大麻素的情況仍存在，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管和打擊力度，嚴(yán)厲杜絕毒品危害。

圖2 空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（左）和陽(yáng)性樣品（右）的MRM色譜圖和質(zhì)譜圖Fig.2 MRM chromatograms and mass spectrums of the specimen spiked (50ng/mL) (left) and the actual sample (Right) of certain synthetic cannabinoid

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC-MS/MS快速篩選和測(cè)定電子煙油中58種合成大麻素的分析方法。該方法樣品前處理簡(jiǎn)便，分析覆蓋范圍廣、耗時(shí)少、準(zhǔn)確度高，能滿足對(duì)電子煙油中合成大麻素的測(cè)定要求。在實(shí)際樣品的檢測(cè)中，按照本方法檢測(cè)深圳市辦案機(jī)關(guān)提供的電子煙油，合成大麻素均被準(zhǔn)確篩查和定量檢測(cè)。本方法為電子煙油中多種合成大麻素的定性篩查和定量分析提供了高效、可靠的檢測(cè)方法。