植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中SR-like蛋白的研究進(jìn)展

張?jiān)瓷?，陳冠群，郭祥鑫，唐倩雯，李清韻，申曉輝

(上海交通大學(xué) 設(shè)計(jì)學(xué)院，上海 200240)

可變剪接又稱選擇性剪接(alternative splicing，AS)，是指基因的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物前體mRNA(pre-mRNA)通過連接不同的剪接位點(diǎn)產(chǎn)生兩種或多種成熟mRNA的過程，普遍存在于生命活動中，參與生物的生長發(fā)育過程。

植物中有42%～83%的斷裂基因通過可變剪接產(chǎn)生多種剪接變異體[1-3]。根據(jù)可變剪接引起的變化結(jié)果可將剪接類型分為8種：1)外顯子跳躍(exon skipping，ES)；2)內(nèi)含子保留(retained intron，RI)；3)5′ 位點(diǎn)可變剪接(alternative 5′ splice sites，A5SS)；4)3′ 位點(diǎn)可變剪接(alternative 3′ splice sites，A3SS)；5)外顯子互斥(mutually exclusive exons，WXE)；6)第一個外顯子可變(alternative first exon，AFE)；7)最后一個外顯子可變(alternative last exon，ALE)；8)串聯(lián)3′-端非編碼區(qū)(tandem 3′-UTRs)[4]。在植物中，內(nèi)含子保留是較為常見的可變剪接方式。

Pre-mRNA的剪接是剪接體以一種循序漸進(jìn)的方式進(jìn)行組裝并作用到pre-mRNA上。剪接體的主要類型包括5個富含尿苷的小核核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins，U1、U2、U4、U5和U6 snRNPs)和多種非小核核糖核蛋白(non-small nuclear ribonucleoprotein，non-snSNPs)[5-6]，其中，富含絲氨酸-精氨酸蛋白(serine/arginine-rich proteins，SR proteins)是決定可變剪接效率和準(zhǔn)確性的一個重要剪接因子(splicing factors，SFs)家族，可控制剪接位點(diǎn)的選擇、引導(dǎo)拼接體組裝，在剪接的執(zhí)行和調(diào)控中都是必需的[7]。

1 SR-like蛋白亞家族特點(diǎn)與定位

1.1 SR-like蛋白亞家族成員的鑒定

SR蛋白是一類富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子，屬于non-snRNP剪接體蛋白家族[8-10]，在高等生物中高度保守[11]。SR蛋白氨基末端(N端)具有1或2個RNA識別基序(RNA recognition motif，RRM)，羧基末端(C端)含有高度磷酸化的絲氨酸/精氨酸結(jié)構(gòu)域(serine/arginine-rich domain，SR domain)或精氨酸/絲氨酸結(jié)構(gòu)域(arginine/serine-rich domain，RS domain)或絲氨酸/脯氨酸重復(fù)序列(serine/proline repeat，SP)；此外，有一些SR蛋白還包含一些特殊的結(jié)構(gòu)如鋅指節(jié)/結(jié)構(gòu)域(Zinc Knuckle，ZnK/ Zinc binding domain)。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的類型和數(shù)量，植物SR蛋白可分為7個亞家族：SC、SCL、RSZ、RS2Z、SR、RS和SR-like，其中SR、SC和RSZ亞家族分別是人類SRSF1、SRSF2和SRSF7的直接同源基因，而RS、SCL、RS2Z和SR-like亞家族的成員由于獲得了新的特征而被認(rèn)為是植物特有的。

SR-like亞家族的結(jié)構(gòu)特殊(單個RRM兩側(cè)各有一個RS結(jié)構(gòu)域)，之前由于SR-like亞家族成員SR45這種非典型的結(jié)構(gòu)域被排除在SR家族外[12]。但近年有研究基于RRM的高度保守性和廣泛性，從古生物、細(xì)菌、真核生物和病毒中挖掘了約700個完整的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)所有的典型SR蛋白都有一個古老的起源，擬南芥(Arabidopsisthaliana)SR45和SR45a分別是人類RNPS1和Tra2的同源物[13]，SR45及哺乳動物同源RNPS1在功能和進(jìn)化方面與SR蛋白密切相關(guān)；Tra2蛋白控制著雙性生殖的可變剪接，在果蠅性別決定中起著關(guān)鍵作用[14]。現(xiàn)已將它們定義為SR蛋白的亞家族成員[10,15-19](圖1，表1)。目前，在十字花科、豆科、禾本科、大戟科、山茶科和菊科等124種植物中均挖掘到了SR-like蛋白家族(表2，數(shù)據(jù)來自NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。有花植物中的SR45蛋白普遍存在同源物，但藻類中不存在[20]；另外，SR45和SR45a基因自身經(jīng)過選擇性剪接能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄副本，如擬南芥AtSR45AtSR45a、水稻(Oryzasativa)OsSR45OsSR45a等。

表1 擬南芥中7個SR蛋白亞家族成員Table 1 Seven subfamily members of SR protein in Arabidopsis thaliana

圖1 擬南芥7個SR蛋白亞家族成員的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of seven SR protein subfamilies in Arabidopsis thaliana

1.2 SR-like蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

SR-like亞家族作為一類植物特異的SR蛋白，已被證明在體外異源互補(bǔ)分析中作為一個重要的剪接因子發(fā)揮作用[36]。SR-like亞家族包括SR45和SR45a成員。在擬南芥中，Sr45由3 379 個堿基組成，SR45蛋白由425個氨基酸組成；Sr45a由2 804個堿基組成，SR45a蛋白由382個氨基酸組成。第一個植物SR45蛋白是Golovkin等[9]使用酵母雙雜技術(shù)釣取擬南芥U1-70K蛋白的互作蛋白時發(fā)現(xiàn)的。

如前文所述，SR-like的C端較其他SR蛋白多一個RS結(jié)構(gòu)域，即單個RRM兩側(cè)有2個RS結(jié)構(gòu)域(圖1)。RRM結(jié)構(gòu)域可以特異地識別并結(jié)合pre-mRNA來確定剪接位點(diǎn)，且偏向于結(jié)合外顯子剪接增強(qiáng)子(exon splicing enhancers，ESE)序列，從而參與可變剪接[42-43]；而RS結(jié)構(gòu)域主要通過蛋白-蛋白之間的相互作用，募集其他剪接因子到RNA上完成剪接體的組裝并進(jìn)行剪接[44-46]。此外，RS域的磷酸化/脫磷酸化對蛋白的定位和移動起決定性作用，使得SR-like蛋白成為近10年SR蛋白研究中的熱點(diǎn)。

1.3 SR-like蛋白的亞細(xì)胞定位

近幾年，對SR-like蛋白的研究如火如荼，但對SR-like蛋白亞細(xì)胞定位研究涉獵的植物種類還不夠廣泛，有限的研究結(jié)果表明，SR-like蛋白一般定位在細(xì)胞核中。在煙草BY-2細(xì)胞中瞬時表達(dá)了綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和擬南芥SR45a蛋白融合載體[47]，發(fā)現(xiàn)在DAPI染色的細(xì)胞核中檢測到atSR45a-1a和atSR45a-2蛋白，表明擬南芥SR45a蛋白定位于細(xì)胞核。Zheng等[48]在分析低溫脅迫下鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)的可變剪接事件轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時，通過構(gòu)建GFP載體進(jìn)行瞬時表達(dá)檢測帽結(jié)合復(fù)合物亞基帽結(jié)合蛋白 20(cap-binding protein 20，CBP20)和SR45a蛋白亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，GFP熒光僅在細(xì)胞核中檢測到，與在擬南芥中的亞細(xì)胞定位是一致的。用CELLO v2.5進(jìn)行甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)SR蛋白家族的亞細(xì)胞定位預(yù)測，6個SR45蛋白(BnaA06g11140D、BnaA08g23570D、BnaA09g56240D、BnaC05g12680D、BnaC08g16960D和BnaC08g38300D)均定位在細(xì)胞核內(nèi)[17]。

SR蛋白是一種動態(tài)蛋白質(zhì)，其定位與其分子功能直接相關(guān)。大多數(shù)SR蛋白在細(xì)胞核中都顯示出類似的斑點(diǎn)定位[22,49]，但SR-like蛋白的亞細(xì)胞定位與RS結(jié)構(gòu)域有關(guān)。對擬南芥缺失突變體中的AtSR45a蛋白研究發(fā)現(xiàn)，RS1和 RS2域是核定位必需的信號區(qū)[50]。將煙草NtSR45蛋白的RS1域、RS2域及RRM域分別與GFP標(biāo)簽連接，發(fā)現(xiàn)含RS域(RS1或RS2域)的融合蛋白定位于細(xì)胞核，而RRM編碼的蛋白則分散在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，表明RRM域與SR45蛋白的定位無關(guān)，而RSl和RS2域都包含核定位信號，推測兩個RS域可能存在功能冗余現(xiàn)象。RS1缺失蛋白定位于細(xì)胞核，而RS2缺失蛋白則分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步證明了RS2域?qū)R45定位于細(xì)胞核起決定性作用[51]。

SR45的核斑點(diǎn)分布受磷酸化和轉(zhuǎn)錄調(diào)控[20,37]，并與5′剪接位點(diǎn)識別的關(guān)鍵蛋白U1-70K相互作用。為了研究SR45的定位和動態(tài)分布，在培養(yǎng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因擬南芥的間期核中發(fā)現(xiàn)，GFP-SR45存在于斑點(diǎn)狀核和核質(zhì)中，散斑表現(xiàn)為核內(nèi)移動和形態(tài)變化；抑制轉(zhuǎn)錄和蛋白磷酸化導(dǎo)致SR45向更大的斑點(diǎn)移動，由轉(zhuǎn)錄抑制引起的斑點(diǎn)數(shù)目和形態(tài)的變化可被磷酸酶抑制劑阻斷，表明細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白(去磷酸化)可以調(diào)節(jié)SR45的核內(nèi)分布[20]。目前SR45a蛋白C端RS結(jié)構(gòu)域中的磷酸化位點(diǎn)已被鑒定出來，并通過促分裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MPK3)磷酸化[52]。

2 SR-like蛋白亞家族的調(diào)控方式和作用機(jī)制

早期的研究認(rèn)為，可變剪接是介于轉(zhuǎn)錄和翻譯之間的獨(dú)立步驟，而后續(xù)的一系列研究則表明它與基因轉(zhuǎn)錄過程是偶聯(lián)進(jìn)行的，轉(zhuǎn)錄速率通過影響可變外顯子剪接位點(diǎn)的選擇調(diào)控可變剪接[53]。SR蛋白在剪接調(diào)控過程中的每一步都發(fā)揮著重要的作用，包括從剪切位點(diǎn)識別到最后階段的剪接體組裝[54]。然而，關(guān)于SR-like蛋白如何在這些過程中發(fā)揮作用的信息知之甚少。

目前研究表明SR-like蛋白參與了植物生長發(fā)育及逆境誘導(dǎo)反應(yīng)的調(diào)控。在擬南芥、水稻、鐵皮石斛、蔓菁(Brassicarapa)、木薯(Manihotesculenta)、煙草(Nicotianatabacum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、海棗(Phoenixdactylifera)、歐洲李(Prunusdulcis)、葡萄(Vitisvinifera)和玉米(Zeamays)等中發(fā)現(xiàn)，SR-like蛋白可通過自身或上、下游靶基因可變剪接轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制應(yīng)答生長、發(fā)育和環(huán)境脅迫信號，進(jìn)而影響植株大小、開花時間、器官形態(tài)學(xué)建成和生物/非生物脅迫[8,55-56](表2)。

表2 從124種植物中鑒定出的SR-like蛋白亞家族成員及數(shù)量Table 2 Members and numbers of SR-like protein subfamily identified from 124 species of plants

續(xù)表2 Continued Table 2

續(xù)表2 Continued Table 2

2.1 通過自身可變剪接調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄

到目前為止，有關(guān)SR-like 蛋白可變剪接功能研究僅局限于模式植物擬南芥上。AtSR45可變剪接產(chǎn)生SR45.1(長亞型)和SR45.2(短亞型)2個轉(zhuǎn)錄本，在不同發(fā)育階段(種子、幼苗和成苗)對熱脅迫和鹽脅迫有很高的敏感性。只有SR45.1是耐熱性和耐鹽性的正調(diào)節(jié)因子[57]，并在花瓣發(fā)育中起主要作用；而SR45.2主要調(diào)控根的生長[56]。擬南芥SR45a自身也存在可變剪接，SR45a-1a編碼的全長蛋白RRM結(jié)構(gòu)域兩側(cè)為2個RS基序，SR45a-1b則編碼了C端缺少RS結(jié)構(gòu)域的截短蛋白；過表達(dá)SR45a-1a和SR45a-1b的擬南芥株系表現(xiàn)出鹽敏感的表型[10]。由此可見，SR-like通過自身可變剪接調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄。

2.2 通過蛋白互作及后修飾的調(diào)控

SR-like蛋白不僅可以和SR蛋白的其他亞家族成員相互作用(圖2，A)，還可以和剪接體蛋白或蛋白激酶之間互作，但目前已有研究僅局限于SR45(圖2，B)。Stankovic等[30]通過酵母雙雜分析表明，SR45的兩個RS結(jié)構(gòu)域和SR亞家族成員SR30、SR34和SR34a之間存在強(qiáng)烈的相互作用。Yan等[21]在分析擬南芥SR蛋白亞家族的突變體表型時發(fā)現(xiàn)，SR45與SCL33通過相互作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和剪接以維持基因的正確表達(dá)和發(fā)育功能。U1-70K是U1 snRNP特異的3種蛋白質(zhì)之一，與pre-mRNAs的組成性剪接(constitutive splicing，CS)和可變剪接有關(guān)[58]。Golovkin等[9]發(fā)現(xiàn)了第一個SR45蛋白，并通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)U1-70K和SCL33、SR45蛋白以及SR45和SCL33蛋白間發(fā)生相互作用。U2AF35是U2AF復(fù)合物的小亞基，參與識別3′剪接位點(diǎn)[59]。Day等[60]篩選了帶有SR45的酵母雙雜文庫，通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SR45可以與pre-mRNA、U1-70K和U2AF35相互作用，將U1 snRNP和U2AF分別招募到5′和3′剪接位點(diǎn)調(diào)節(jié)可變剪接。另外還發(fā)現(xiàn)SR45的RS1和RS2結(jié)構(gòu)域可以獨(dú)立與U2AF35蛋白結(jié)合。

甲基化、磷酸化、糖基化及乙?；鹊鞍仔揎椩诳勺兗艚又邪l(fā)揮重要作用，但目前僅有關(guān)于SR-like甲基化和磷酸化修飾的研究報道。DNA胞嘧啶甲基化是一種表觀遺傳標(biāo)記，常與基因和轉(zhuǎn)座子的沉默有關(guān)。Ausin等[61]在研究預(yù)測的RNA相互作用域基因篩選DNA甲基化的突變時發(fā)現(xiàn)，SR45和Dicer-like3(DCL3)在RNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation，RdDM)途徑中存在協(xié)同作用，表明SR45能夠與DCL3相互作用，進(jìn)而影響由RNA介導(dǎo)的DNA甲基化。AFC2是一種類似CDC2-2-like(LAMMOL/LER)的clk/Sty蛋白激酶，能夠調(diào)控特定的SR蛋白的磷酸化狀態(tài)，從而參與mRNA的可變剪切調(diào)控。Reddy[62]總結(jié)出SR45和AFC2、SCL33可以兩兩相互作用，在植物剪接位點(diǎn)的選擇和剪接體組裝的早期階段發(fā)揮重要功能。

A.SR蛋白家族之間的相互作用；B.SR蛋白家族與剪接體蛋白或蛋白激酶之間的相互作用。橢圓形表示SR蛋白，同一亞家族的成員用相同的顏色標(biāo)記。圓角矩形表示剪接體蛋白和激酶。紅線和黑線表示蛋白之間的相互作用，帶有“×”的黑線表示沒有相互作用。黑色和紅色箭頭表示相應(yīng)的激酶使SR蛋白磷酸化圖2 擬南芥SR蛋白家族成員與剪接體蛋白/蛋白激酶間相互作用的分子網(wǎng)絡(luò)[9,21- 22,30,58,60,63-68]A.Interactions between SR proteins;B.Interactions between SR proteins and spliceosomal proteins or protein kinases.SR proteins are shown in ovals,and the members of the same subfamily are marked with the same color.Spliceosomal proteins and kinases are shown in rounded rectangles.Red and black lines indicate protein interactions.Black lines with “×”indicate no interaction.Red and black arrows indicate phosphorylation of the SR proteins by corresponding kinasesFig.2 Protein interaction network of Arabidopsis SR proteins[9,21- 22,30,58,60,63-68]

2.3 參與調(diào)控植物生長發(fā)育和環(huán)境脅迫信號應(yīng)答

植物的調(diào)控應(yīng)答反應(yīng)是一個涉及多基因、多信號途徑及多基因產(chǎn)物參與的復(fù)雜過程，其中pre-mRNA可變剪接能夠產(chǎn)生更多的轉(zhuǎn)錄本，并參與到植物生長發(fā)育、生物/非生物脅迫應(yīng)答的調(diào)控過程中，這也是真核生物基因表達(dá)調(diào)控中的重要環(huán)節(jié)之一。SR-like蛋白不僅可以直接參與調(diào)控其他基因的剪接方式，還作為功能基因參與調(diào)控植株的生長發(fā)育。

在擬南芥種子萌發(fā)過程中，SR45負(fù)調(diào)控葡萄糖和脫落酸(abscisic acid，ABA)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。SR45通過影響ABA的積累和生物合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(ABI3和ABI5)的表達(dá)，負(fù)調(diào)控葡萄糖響應(yīng)應(yīng)答；sr45-1突變體證明在幼苗發(fā)育早期對葡萄糖和ABA具有較高的敏感性[8]。SR45介導(dǎo)的葡萄糖負(fù)調(diào)控機(jī)制也存在于水稻種子萌發(fā)中，且ABA的代謝較ABA的生物合成更顯著地抑制種子的萌發(fā)[69]。AtSR45在擬南芥根和花中的表達(dá)量很高[26]，sr45-1突變株的生命周期縮短，但營養(yǎng)生長至生殖生長的過渡期延遲，晚花；葉片細(xì)長卷曲，根生長緩慢，花瓣與雄蕊數(shù)量不同，但控制花器官相關(guān)的基因表達(dá)卻沒有明顯變化[36]。

在應(yīng)答環(huán)境脅迫及植物激素信號時，植物SR-like蛋白顯著地影響著一些基因的選擇性剪接，包括形成一些新的剪接產(chǎn)物以響應(yīng)脅迫[56,70-72]。如從表3可知，目前已從11種經(jīng)生物/非生物脅迫的植物中鑒定到SR-like。

表3 生物/非生物脅迫下植物SR-like的功能和參與可變剪接的作用方式Table 3 Regulation types of AS and function about SR-like proteins in response to environmental stresses

關(guān)于SR45a生物脅迫的研究僅有1篇論文發(fā)表。Ling等[73]對煙草天蛾 (Manducasexta)攝食的野生煙草(Nicotianaattenuata)葉片和根進(jìn)行了全基因組分析，發(fā)現(xiàn)煙草天蛾攝食野生煙草5 h后，葉片中總的可變剪接事件減少了7.3%，但根中增加了8.0%，這種生物脅迫顯著改變了葉片和根中的可變剪接模式，并導(dǎo)致參與可變剪接的SR45a轉(zhuǎn)錄水平增加(在根中)和降低(在葉中)；葉片中SR45a基因的表達(dá)不依賴茉莉酸(jasmonic acid，JA)途徑，但在根中卻依賴茉莉酸JA途徑，表明生物脅迫引起的可變剪接和SR45a基因的差異表達(dá)在兩種組織中都是獨(dú)立調(diào)節(jié)的。為應(yīng)對食草動物產(chǎn)卵和啃食等行為對植物造成的生物脅迫，激活防御系統(tǒng)至關(guān)重要，了解這一生物脅迫防御系統(tǒng)有助于今后培育食草耐受品種。

在SR-like蛋白參與非生物脅迫的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，非生物脅迫誘導(dǎo)剪接因子SR-like基因自身轉(zhuǎn)錄和表達(dá)模式發(fā)生改變，進(jìn)而發(fā)揮功能。楊曉娜[51]發(fā)現(xiàn)NtSR45基因的表達(dá)受低溫、干旱、高鹽和高溫等脅迫因素調(diào)控，其中低溫、干旱和高鹽脅迫下NtSR45基因下調(diào)表達(dá)；而高溫誘導(dǎo)其表達(dá)量呈先下調(diào)、后上調(diào)的模式。高溫脅迫下，葡萄SR45、SR30和SR34與核糖核蛋白組分U1 snRNP豐度顯著上調(diào)[74]。在柳枝稷耐鹽性相關(guān)的上游和下游的候選基因中發(fā)現(xiàn)，染色體6B上的QTL和SR45a具有85%的相似性[75]。李智博等[76]利用生物信息學(xué)重新構(gòu)建了木薯SR45基因家族進(jìn)化樹，其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明MeSR45亞家族均響應(yīng)低溫脅迫，且MeSR45-2顯著上調(diào)表達(dá)。另外，SR-like蛋白還可以通過蛋白修飾改變剪接因子的亞細(xì)胞定位和移動性，從而改變其調(diào)控功能。Zhang等[77]對葡萄葉片進(jìn)行磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)的比較分析發(fā)現(xiàn)，參與RNA剪接的SR45、RS2Z33、SCL33和SCL30的磷酸化水平顯著上調(diào)，表明干旱會誘導(dǎo)剪接因子的磷酸化，從而增強(qiáng)耐熱性。通過qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)干旱脅迫伴隨著‘Sefied’歐洲李葉片中AFC2 蛋白激酶的顯著上調(diào)和隨后RNA 剪接體蛋白(包括 SR45、SR33、SRZ22 和 RSZP21)的下調(diào)，驗(yàn)證了干旱脅迫對歐洲李A(yù)FC2蛋白激酶、SR45、SR33、SRZ22 和 RSZP21 控制的子網(wǎng)絡(luò)激活的影響[78]。

依據(jù)目前已報道的5種植物SR-like在環(huán)境脅迫下行使可變剪接調(diào)控方式的不同，本文將SR-like應(yīng)對非生物脅迫的調(diào)控機(jī)制總結(jié)歸納為以下3類(圖3，表3)：

(1)SR-like作為剪接因子通過自身可變剪接調(diào)節(jié)可變剪接的模式 在非生物脅迫下，SR-like可以發(fā)揮剪接因子功能進(jìn)行可變剪接。Albaqami[57]利用atsr45突變體和轉(zhuǎn)化全長或截短可變剪接異構(gòu)體基因AtSR45的株系，研究了SR45及其剪接變異體在高溫和鹽脅迫中的作用。與野生型相比，SR45在不同發(fā)育階段對高溫和鹽脅迫均表現(xiàn)出較高的敏感性，并且只有SR45-L長異構(gòu)體在這些脅迫中起作用，因?yàn)殚L異構(gòu)體可以緩解SR45株系對高溫和鹽脅迫的敏感性。通過進(jìn)一步體外結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，SR45和熱休克轉(zhuǎn)錄因子A2(heat shock transcription factorA2，HsfA2)的選擇性剪接內(nèi)含子結(jié)合，調(diào)控高溫脅迫下HsfA2的可變剪接和表達(dá)；SR45在鹽脅迫下會產(chǎn)生新的剪接異構(gòu)體微調(diào)基因表達(dá)，表明SR45通過調(diào)節(jié)幾個脅迫反應(yīng)基因的表達(dá)和剪接，對這兩種非生物脅迫的耐受性起到積極的調(diào)節(jié)作用。Muthusamy等[79]研究了正常條件和干旱條件下蔓菁野生型、過表達(dá)和突變體中與BrSR45a互作的關(guān)鍵耐旱性基因的可變剪接模式，表明BrSR45a通過濃度依賴性方式調(diào)節(jié)靶基因的選擇性剪接應(yīng)對干旱脅迫反應(yīng)。干旱脅迫不僅使正常條件下的DCP5、RD29A、GOLS1、AKR、U2AF和SDR的剪接模式與過表達(dá)和突變體之間存在差異，還改變了 OCED2、SQE、UPF1、U4/U6-U5 tri-snRNP 相關(guān)蛋白和 UPF1 在過表達(dá)和突變體之間的剪接模式，表明過表達(dá)和突變體的功能喪失對靶基因的剪接模式有不同的影響。Li等[10]模擬了夏季日常溫度變化，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，玉米SR45a發(fā)生可變剪接事件的頻率升高，并使得SR45a的RNA異構(gòu)體增加，表明SR45a的RNA異構(gòu)體在應(yīng)對高溫時能夠產(chǎn)生更有效的剪接調(diào)節(jié)。在每日的較低溫度下，SR45a的mRNA會跳過保守結(jié)構(gòu)域的外顯子產(chǎn)生RNA異構(gòu)體，翻譯成SR45a蛋白質(zhì)后與snRNPs組成剪接體后行使剪接功能；在每日的較高溫度時，SR45a會保留保守結(jié)構(gòu)域的外顯子，編碼功能有效的剪接調(diào)節(jié)因子，有可能增強(qiáng)其他基因的可變剪接(圖3，A)。

(2)環(huán)境誘導(dǎo)逆境脅迫相關(guān)基因可變剪接產(chǎn)生異構(gòu)體，再與下游靶標(biāo)結(jié)合 環(huán)境誘導(dǎo)的逆境脅迫經(jīng)常引入終止密碼子，使得相關(guān)基因產(chǎn)生截短的異構(gòu)體后再與下游靶標(biāo)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上對環(huán)境脅迫作出快速反應(yīng)(圖3，B)。這些截短的異構(gòu)體通常保留了與全長蛋白質(zhì)相同的互作靶點(diǎn)，但也有一些能力因?yàn)槿鄙訇P(guān)鍵結(jié)構(gòu)域而喪失。例如，在鹽脅迫下擬南芥SR45a發(fā)生可變剪接事件，產(chǎn)生兩種剪接異構(gòu)體——全長SR45a-1a和截短的SR45a-1b；全長 SR45a-1a 可用作剪接因子，而截短的 SR45a-1b 則不能。CBP20可與 SR45a-1a和 SR45a1b 發(fā)生物理相互作用；SR45a-1b 通過促進(jìn) SR45a-1a與CBP20 的結(jié)合介導(dǎo)鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]。

A.逆境脅迫通過剪接因子誘導(dǎo)可變剪接事件。SFs在多個水平上受到逆境脅迫調(diào)控：①環(huán)境脅迫促進(jìn)或抑制剪接因子的轉(zhuǎn)錄；②許多剪接因子自身發(fā)生可變剪接事件，進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游基因的剪接；③逆境脅迫下SR-like蛋白發(fā)生磷酸化(標(biāo)記為P)；B.環(huán)境脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的剪接異構(gòu)體；C.可變剪接產(chǎn)生豐度可變的轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體。環(huán)境脅迫導(dǎo)致剪接變異體的比例發(fā)生變化。圖中外顯子基因顯示為框，內(nèi)含子顯示為線條圖3 環(huán)境脅迫下剪接因子SR-like參與調(diào)控植物可變剪接的作用類型A.Stresses can induce alternative splicing through splicing factors (SF).SFs are regulated at multiple levels:① Environmental stress promotes or inhibits transcription of splicing factors;② Many splicing factors themselves generate alternative splicing events which further regulate splicing of downstream genes;③ SR-like proteins can be phosphorylated (labeled P) under stress;B.Environmental stress induces different splicing isoforms;C.Alternative splicing generates transcript isoforms with variable abundance.Environmental stresses lead to the altered ratios of splice variants.Exons are displayed as boxes and introns as lines in gene diagramsFig.3 Regulation types of alternative splicing about SR-like splicing factors in response to environmental stresses

(3)環(huán)境脅迫引起脅迫響應(yīng)基因剪接異構(gòu)體的比例發(fā)生變化 環(huán)境脅迫誘導(dǎo)逆境響應(yīng)基因發(fā)生可變剪接，導(dǎo)致剪接異構(gòu)體的比例發(fā)生變化，即通過可變剪接產(chǎn)生豐度可變的轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體(圖3，C)。例如，在非生物脅迫條件下，水稻免疫親素FK506結(jié)合蛋白(Immunophilins FK506-binding proteins，OsFKBP20-1b)正向影響脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和pre-mRNA 剪接。在osfkbp20-1b功能喪失的突變體中，應(yīng)激反應(yīng)基因表達(dá)下調(diào)，而其剪接異構(gòu)體的表達(dá)量增加；過表達(dá)OsFKBP20-1b的植物中，相同的脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，OsFKBP20-1b 與處于核斑點(diǎn)和細(xì)胞質(zhì)中的剪接因子 OsSR45 相互作用，維持剪接因子OsSR45蛋白的穩(wěn)定性，并在非生物應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中通過介導(dǎo)RNA加工發(fā)揮重要作用[80]。

綜上所述，環(huán)境信號能夠調(diào)節(jié)植物自身SR-like基因pre-mRNA的剪接，產(chǎn)生不同亞型的SR-like蛋白及其他脅迫相關(guān)的蛋白，以適應(yīng)生長發(fā)育和生物/非生物脅迫。

3 展 望

SR-like蛋白在轉(zhuǎn)錄和可變剪接兩方面都具有重要的調(diào)控功能，并且與植物的生長發(fā)育、環(huán)境信號應(yīng)答密切相關(guān)。由于SR-like獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域使其成為SR蛋白研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)且取得了一系列突破性進(jìn)展。但是關(guān)于SR-like仍然存在許多有待探索的內(nèi)容，主要集中于以下幾個方面。

一是關(guān)于研究的物種范圍。目前多集中在模式植物(尤其是局限于單一的擬南芥)上，需進(jìn)一步挖掘SR-like在非模式植物(如重要的經(jīng)濟(jì)作物、園林園藝植物)可變剪接及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控上的功能。

二是關(guān)于SR-like精細(xì)的調(diào)控作用機(jī)制。隨著高通量測序技術(shù)的普及，在植物的不同發(fā)育階段、組織器官和生理生化過程中，越來越多的受SR-like調(diào)控的可變剪接事件被發(fā)掘出來，但大部分的研究僅從序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平對調(diào)控機(jī)制進(jìn)行分析，與SR-like相關(guān)的可變剪接機(jī)制如何誘發(fā)、調(diào)節(jié)，是否可控和是否參與所有植物的生長發(fā)育過程仍是一片空白，其具體的調(diào)控機(jī)制也尚未形成共識。

三是關(guān)于SR-like響應(yīng)生物與非生物脅迫的研究。目前僅有11種植物SR-like經(jīng)過生物/非生物脅迫處理后的研究報道，對SR-like進(jìn)行功能分析與可變剪接方式研究的只有5種植物，其中響應(yīng)生物脅迫的研究僅有1篇文獻(xiàn)，因此，需擴(kuò)大物種且深入研究SR-like響應(yīng)生物與非生物脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制。

SR-like參與的可變剪接是調(diào)控真核生物基因表達(dá)以及蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制，貫穿植物的整個且重要生命過程，目前還有很多未解之謎。利用關(guān)鍵SR-like基因的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)才有可能實(shí)現(xiàn)SR-like蛋白時空表達(dá)水平，闡明植物可變剪接的分子機(jī)理，為提高植物抗逆能力和未來定向改良植物提供新線索。