固定化培養(yǎng)中氮磷濃度對(duì)鈍頂螺旋藻生長(zhǎng)及其代謝產(chǎn)物和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

崔 巖，劉海燕，李武陽(yáng),2，王麗娟，羅光宏*

(1 河西學(xué)院，甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅張掖 734000；2 蘭州交通大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,蘭州 730070)

螺旋藻作為國(guó)內(nèi)外研究與開(kāi)發(fā)規(guī)模最大的經(jīng)濟(jì)微藻，生長(zhǎng)速度快且可以在堿性環(huán)境中高效利用CO2或碳酸鹽。螺旋藻還含有豐富的β-胡蘿卜素、葉綠素、蛋白質(zhì)和多糖等活性物質(zhì)，是集營(yíng)養(yǎng)和藥用于一身的最佳天然綠色保健食品，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)譽(yù)為“21世紀(jì)人類(lèi)最理想的天然保健食品”[1-2]。中國(guó)螺旋藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，自20世紀(jì)80年代初開(kāi)展螺旋藻養(yǎng)殖技術(shù)研究，90年代初期進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化推廣階段，至90年代中期，中國(guó)螺旋藻養(yǎng)殖面積達(dá)到200萬(wàn)m2，年產(chǎn)能達(dá)2 000 t。目前，中國(guó)螺旋藻生物質(zhì)年生產(chǎn)能力約1萬(wàn)t[3-4]，主要采用傳統(tǒng)的液體懸浮式培養(yǎng)，包括開(kāi)放式跑道池和密閉光生物反應(yīng)器[5]。開(kāi)放式跑道池的建造和運(yùn)行成本較低，但細(xì)胞生長(zhǎng)速度與培養(yǎng)密度均較低，且占地面積大，系統(tǒng)還存在著易受污染、培養(yǎng)條件不穩(wěn)定等難以克服的弱點(diǎn)。密閉光生物反應(yīng)器可以有效控制培養(yǎng)條件，顯著提高藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度與培養(yǎng)密度，但造價(jià)昂貴、運(yùn)行成本高、難以放大用于規(guī)模培養(yǎng)[6]。近年來(lái)，固定化生物膜的培養(yǎng)方式獲得了越來(lái)越多的關(guān)注。區(qū)別于懸浮式培養(yǎng)，該培養(yǎng)方式通過(guò)將細(xì)胞固定在材料表面并形成連續(xù)生長(zhǎng)的生物膜，可以極大地降低耗水量和采收能耗。同時(shí)，研究表明生物膜中細(xì)胞對(duì)光和CO2的利用率遠(yuǎn)高于懸浮式培養(yǎng)[7]。因此，研究影響固定化生物膜培養(yǎng)方式的因素，開(kāi)發(fā)低成本、可規(guī)?；呐囵B(yǎng)系統(tǒng)，已成為微藻養(yǎng)殖領(lǐng)域的一個(gè)重要方向[8]。

氮、磷是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的必需營(yíng)養(yǎng)因子，在細(xì)胞生命過(guò)程中起著不可或缺的作用。研究表明，氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)微藻生物膜的形成和生長(zhǎng)至關(guān)重要[9]。目前，關(guān)于螺旋藻生物膜的研究主要集中在固定材料的篩選和反應(yīng)器的構(gòu)建方面[7-10]，有關(guān)氮、磷對(duì)螺旋藻生物膜的影響研究還未見(jiàn)報(bào)道，因此，本研究開(kāi)展了不同氮、磷濃度下固定化鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)生物膜的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，分析氮和磷濃度對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響規(guī)律，從而為制定低耗、高效的規(guī)模化培養(yǎng)策略，調(diào)控代謝產(chǎn)物和提高螺旋藻利用效率提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藻種培養(yǎng)及處理

鈍頂螺旋藻 (Spirulinaplatensis)由甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心提供。采用Zarrouk培養(yǎng)基[11]進(jìn)行培養(yǎng)，1 L溶液中含NaHCO316.8 g,NaCl 1.0 g,K2SO41.0 g,NaNO32.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g,CaCl20.08 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,Na2EDTA 0.08 g,A5微量元素1 mL。其中，A5微量元素配方如下：H3BO32.86 g·L-1,MnCl2·4H2O 1.8 g·L-1,ZnSO4·7H2O 0.22 g·L-1,(NH4)6Mo7O24·2H2O 0.02 g·L-1,CuSO4·5H2O 0.08 g·L-1,CoCl2·6H2O 0.04 g·L-1。

采用單層傾斜平板系統(tǒng)，支撐板表面是有利于螺旋藻吸附固定的材料，將待培養(yǎng)的藻種接種至固定材料無(wú)紡布表面，初始接種密度為7～9 g·m-2。培養(yǎng)液通過(guò)噴灑系統(tǒng)分布于材料表面并保持濕潤(rùn)，藻細(xì)胞在吸附層生長(zhǎng)并形成一定厚度的生物膜，收獲時(shí)用刮板將細(xì)胞從吸附層上刮下即可。培養(yǎng)光照強(qiáng)度為100 μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)溫度為25 ℃。

1.2 觀測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1 螺旋藻生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)定細(xì)胞密度時(shí)，將吸附膜上的藻細(xì)胞(接種面積為S，m2)用水沖洗下來(lái)，通過(guò)抽濾裝置過(guò)濾到預(yù)先稱(chēng)重的濾膜(W1，g)上，烘箱105 ℃ 烘干至恒重(W2，g)，最后依據(jù)公式(1)和(2)分別計(jì)算吸附膜上的生物量密度(Wt，g·m-2)和相應(yīng)的生物量產(chǎn)率(P，g·m-2·d-1)。

Wt=(W2-W1)/S

(1)

P=(Wt-W0)/t

(2)

其中，W0為接種時(shí)的細(xì)胞濃度(g·m-2)，t為培養(yǎng)時(shí)間(d)。

1.2.2 螺旋藻葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量取冷凍干燥后的藻粉20 mg，加入20 mL 80%丙酮溶液，低溫超聲20 min，于4 ℃放置24 h，離心后測(cè)定上清液在波長(zhǎng)663、646和470 nm 處的吸光值OD663、OD646和OD470。按式(3)和(4)計(jì)算葉綠素a (Chla)和類(lèi)胡蘿卜素(Cart.)含量[11]：

Chla(mg·L-1)=12.21OD663-2.81OD646

(3)

Cart.(mg·L-1)=(1000OD470-1.63Chla)/221

(4)

1.2.3 螺旋藻藻膽素含量取冷凍干燥后的藻粉20 mg，加入50 mL 磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.0)，混勻后低溫超聲20 min,于-80 ℃凍融循環(huán)3次，離心后測(cè)定上清液在562、620和652 nm處的吸光度OD562、OD620、OD652。藻藍(lán)素(PC)、別藻藍(lán)素(APC)和藻紅素(PE)的含量計(jì)算如下[15]：

PC(g·L-1)=0.187OD620- 0.089OD652

(5)

APC(g·L-1)=0.196A652-0.041A620

(6)

PE(g·L-1)=0.104A562-0.251PC-0.088APC

(7)

1.2.4 螺旋藻可溶性蛋白及多糖含量將待測(cè)細(xì)胞用一定量的水沖洗并離心，上清液用于測(cè)定胞外多糖含量，藻渣冷凍干燥后稱(chēng)取總重。取20 mg藻粉，加入5 mL PBS 緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.8)，混勻后低溫超聲20 min，并于-80 ℃反復(fù)凍融3次，離心后上清液用于測(cè)定胞內(nèi)多糖和可溶性蛋白含量[16]。

可溶性糖含量的測(cè)定采用硫酸蒽酮法[17]。稱(chēng)取0.1蒽酮，溶于100 mL 80%濃硫酸中。取2 mL上清液，置于15 mL比色管中，隨后加入5 mL配制的硫酸蒽酮溶液，充分振蕩后立即放入沸水浴中，保溫15 min，取出后用自來(lái)水冷卻，在620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度OD620，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的可溶性多糖含量。

可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[11]。取上清液1 mL，置于10 mL比色管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，混合放置5 min后，在595 nm下比色，記錄吸光度OD595，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)觀察采用光學(xué)顯微鏡(BX51,Olympus)觀察螺旋藻的細(xì)胞形態(tài)。采用S-3700N(Hitachi) 掃描電子顯微鏡對(duì)真空冷凍干燥并鍍金處理后的藻膜樣品進(jìn)行觀察，拍攝其表面結(jié)構(gòu)。

1.2.6 葉綠素?zé)晒鈪?shù)通過(guò)葉綠素?zé)晒鈨x(PAM-100，Waltz)每天定時(shí)測(cè)定各濃度氮、磷營(yíng)養(yǎng)條件下的螺旋藻葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線和快速光響應(yīng)曲線，測(cè)定前將樣品置于暗處適應(yīng)15 min。測(cè)定葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線時(shí)，先用弱光(小于1 μmol·m-2·s-1)照射樣品測(cè)定初始熒光(Fo)，然后打開(kāi)飽和脈沖光 (2 800 μmol·m-2·s-1)，一個(gè)脈沖后關(guān)閉，得到黑暗中的最大熒光(Fm)，隨后開(kāi)啟光化光(85 μmol·m-2·s-1)，讓樣品進(jìn)行正常的光合作用，當(dāng)熒光基本穩(wěn)定時(shí)測(cè)定穩(wěn)態(tài)熒光(Fs)，之后再進(jìn)行飽和脈沖光處理，一個(gè)脈沖關(guān)閉后，得到光下的最大熒光(Fm′)。充分暗適應(yīng)PSⅡ的最大光轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)等參數(shù)值均是在選定模式下系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算生成。測(cè)定快速光響應(yīng)曲線時(shí)，將樣品暴露在連續(xù)光強(qiáng)梯度(PAR分別為 13、22、35、85、156、210、364、576、901和1 393 μmol·m-2·s-1)下，測(cè)定光合電子傳遞速率ETR[18-19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，利用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析(ANOVA)和 Duncan檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水平α=0.05，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮、磷濃度對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響

各氮、磷濃度條件下螺旋藻生物量均隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加(圖1)。其中，螺旋藻生物量密度在30 mmol·L-1氮濃度處理時(shí)達(dá)到最大值，并且在培養(yǎng)周期內(nèi)(1～10 d)顯著高于其余氮濃度處理(P<0.05)，而在15 和45 mmol·L-1氮濃度處理中培養(yǎng)8 d之后顯著高于5 mmol·L-1氮濃度處理(P<0.05)，表明氮濃度過(guò)低會(huì)降低螺旋藻的產(chǎn)量。同時(shí)，在培養(yǎng)周期內(nèi)，螺旋藻生物量密度在3.0 和4.5 mmol·L-1磷濃度處理時(shí)顯著高于0.5 和1.5 mmol·L-1磷濃度處理(P<0.05)，但前兩者間在培養(yǎng)7 d之后并無(wú)顯著性差異，總體上螺旋藻生物量密度隨著磷濃度增加先升高后趨于平穩(wěn)。

另外，培養(yǎng)10 d后收獲藻體，并計(jì)算相應(yīng)的生物量產(chǎn)率(表1)。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)基中氮濃度的增加，螺旋藻的生物量產(chǎn)率呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，并在氮濃度為30 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大(8.31 g·m-2·d-1)；當(dāng)?shù)獫舛壤^續(xù)增加時(shí)(45 mmol·L-1)，螺旋藻的生物量產(chǎn)率顯著降低。與此同時(shí)，隨著培養(yǎng)基中磷濃度的增加，螺旋藻藻生物量產(chǎn)率的變化趨勢(shì)與氮濃度處理的表現(xiàn)一致，即先升高后降低，當(dāng)磷濃度為3.0 mmol·L-1達(dá)到最大(8.06 g·m-2·d-1)；但當(dāng)磷濃度繼續(xù)增加時(shí)(4.5 mmol·L-1)，生物量產(chǎn)率稍有降低并保持在較高水平。

表1 不同氮、磷濃度培養(yǎng)基中螺旋藻的生物量產(chǎn)率Table 1 The biomass productivity of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

同期不同小寫(xiě)字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異圖1 不同氮、磷濃度培養(yǎng)基中螺旋藻生物量密度的變化The different normal letters within same time point indicate significant difference among treatments at 0.05 levelFig.1 The biomass density of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

2.2 不同氮、磷濃度對(duì)螺旋藻細(xì)胞形態(tài)的影響

在不同氮、磷濃度條件下培養(yǎng)10 d后，將氮濃度為5 mmol·L-1和30 mmol·L-1、磷濃度為0.5 mmol·L-1和3.0 mmol·L-1的處理在光學(xué)顯微鏡(BX51,Olympus)和掃描電子顯微鏡(日立S-3700N)下進(jìn)行觀察。結(jié)果(圖2)顯示：在光學(xué)顯微鏡下，30 mmol·L-1氮濃度處理和3 mmol·L-1磷濃度處理的螺旋藻藻絲都較長(zhǎng)，具有10個(gè)或更多螺旋(圖2，A、C)；而5 mmol·L-1氮濃度和0.5 mmol·L-1磷濃度的處理中，螺旋藻的藻絲較短，螺旋變少(圖2，B、D)。在掃描電子顯微鏡下，相較于氮濃度為30 mmol·L-1和磷濃度為3.0 mmol·L-1的處理(圖2，E、G)，氮濃度為5 mmol·L-1和磷濃度為0.5 mmol·L-1的處理(圖2，F(xiàn)、H)藻絲體螺旋度減小，部分藻絲體變成直線形，而長(zhǎng)的藻絲和高的螺旋度有助于螺旋藻形成更為穩(wěn)定的生物膜，進(jìn)而增加單位面積的產(chǎn)量。

2.3 不同氮、磷濃度對(duì)螺旋藻光合色素含量的影響

螺旋藻光合色素含量在氮濃度處理間或者磷濃度處理間均存在顯著性差異，并隨著培養(yǎng)基中氮、磷濃度的增加均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，且均在30 mmol·L-1氮濃度或者3.0 mmol·L-1磷濃度條件下達(dá)到最大值(圖3)。

首先，螺旋藻葉綠素a含量在30 mmol·L-1氮濃度處理時(shí)達(dá)到最大值(14.89 mg·g-1)并顯著高于其余氮濃度處理，而15 和45 mmol·L-1氮濃度處理又顯著高于5 mmol·L-1氮濃度處理(P<0.05)，總體上與螺旋藻生物量的變化趨勢(shì)一致。同時(shí)，螺旋藻類(lèi)胡蘿素和藻膽素(藻藍(lán)素、異藻藍(lán)素和藻紅素)均在30 和45 mmol·L-1氮濃度處理時(shí)顯著高于5和15 mmol·L-1氮濃度處理(P<0.05)，但前兩者間和后兩者間均無(wú)顯著性差異，總體上隨著氮、磷濃度增加先緩慢升高后趨于平穩(wěn)。

A～D為光學(xué)顯微鏡觀察，E～H為掃描電子顯微鏡觀察：A、E.30 mmol·L-1氮濃度處理；B、F.5 mmol·L-1氮濃度處理；C、G.3.0 mmol·L-1磷濃度處理；D、H.0.5 mmol·L-1磷濃度處理圖2 不同氮、磷濃度培養(yǎng)條件下螺旋藻細(xì)胞的形態(tài)變化A-D are optical microscope observation,while E-H are scanning electron microscope observation:A,E.30 mmol·L-1 nitrogen treatment;B,F.5 mmol·L-1 nitrogen treatment;C,G.3.0 mmol·L-1 phosphorus treatment;D,H.0.5 mmol·L-1 phosphorus treatment Fig.2 Morphological changes of S. platensis cells under different nitrogen and phosphorus concentrations

其次，螺旋藻葉綠素a含量在3.0 mmol·L-1磷濃度處理時(shí)達(dá)到最大值14.37 mg·g-1，并顯著高于其余磷濃度處理，1.5 和4.5 mmol·L-1磷濃度處理又顯著高于0.5 mmol·L-1磷濃度處理(P<0.05)，總體上與螺旋藻生物量的變化趨勢(shì)一致。而螺旋藻類(lèi)胡蘿素含量在3.0 和4.5 mmol·L-1磷濃度處理時(shí)顯著高于0.5 和1.5 mmol·L-1磷濃度處理(P<0.05)，但前兩者間和后兩者間并無(wú)顯著性差異，總體上隨著磷濃度增加先升高后趨于平穩(wěn)。同時(shí)，螺旋藻藻藍(lán)素、異藻藍(lán)素和藻紅素含量在各磷濃度處理間均存在顯著性差異(P<0.05)，并均在磷濃度為3.0 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最高值，分別為15.93%、8.87%和1.40%，在4.5 mmol·L-1磷濃度處理時(shí)次之，而在1.5 mmol·L-1磷濃度處理時(shí)最低。

2.4 不同氮、磷濃度對(duì)螺旋藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

首先，最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)反映了PSⅡ反應(yīng)中心處于開(kāi)放時(shí)的最大量子產(chǎn)率，即能量捕獲效率。在培養(yǎng)基中氮濃度一定時(shí)，不同磷濃度處理螺旋藻的Fv/Fm隨著培養(yǎng)時(shí)間均呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖4)。其中，4.5 mmol·L-1磷濃度處理螺旋藻的Fv/Fm在培養(yǎng)的第1天就達(dá)到峰值，而3.0 和1.5 mmol·L-1磷濃度處理則在培養(yǎng)第2天達(dá)到峰值，0.5 mmol·L-1磷濃度處理則一直處于波動(dòng)下降之中；在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，各濃度磷處理螺旋藻的Fv/Fm表現(xiàn)為3.0 mmol·L-1>4.5 mmol·L-1>1.5 mmol·L-1>0.5 mmol·L-1,這與螺旋藻葉綠素含量的變化趨勢(shì)一致。在基質(zhì)中磷濃度一定時(shí)，各氮濃度處理螺旋藻的Fv/Fm隨著培養(yǎng)時(shí)間均呈波動(dòng)下降趨勢(shì)(圖4)。其中，在培養(yǎng)的第1天，5 mmol·L-1氮濃度處理螺旋藻的Fv/Fm的下降幅度最大，而30 mmol·L-1氮濃度處理的下降幅度最小；在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，螺旋藻的Fv/Fm值以45 mmol·L-1氮濃度處理最大，5 mmol·L-1氮濃度處理最小。

相同色素內(nèi)不同小寫(xiě)字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異圖3 不同氮、磷濃度培養(yǎng)條件下螺旋藻光合色素含量的變化The different normal letters within same pigment indicate significant difference among treatments at 0.05 levelFig.3 The photosynthetic pigment contents of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

圖4 不同氮、磷濃度處理下螺旋藻最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)的變化Fig.4 The Fv/Fm of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

其次，隨著光合有效輻射(PAR)強(qiáng)度的增加，各氮、磷濃度處理組螺旋藻PSⅡ光合電子傳遞效率[ETR(Ⅱ)]光響應(yīng)曲線均呈現(xiàn)先上升后降低的變化趨勢(shì)，說(shuō)明螺旋藻PSⅡ的光化學(xué)速率在低光照條件下得到提高，而在高光照條件下會(huì)受到抑制。螺旋藻ETR(Ⅱ)在培養(yǎng)基中磷濃度固定時(shí)表現(xiàn)為45 mmol·L-1>30 mmol·L-1>15 mmol·L-1>5 mmol·L-1，在培養(yǎng)基中氮濃度固定時(shí)表現(xiàn)為3.0 mmol·L-1>4.5 mmol·L-1>1.5 mmol·L-1>0.5 mmol·L-1(圖5)。在培養(yǎng)基中磷元素充足的情況下，螺旋藻ETR明顯受氮濃度影響，且氮濃度越低，ETR值越低，下降越快；在培養(yǎng)基中氮濃度一定時(shí)，螺旋藻ETR始終以3.0 mmol·L-1磷濃度處理最高，這與螺旋藻Fv/Fm和葉綠素a含量的變化規(guī)律一致。

圖5 不同氮、磷濃度處理下螺旋藻電子傳遞速率ETR的變化Fig.5 The ETR of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

另外，實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(ΦPSⅡ)反映PSⅡ反應(yīng)中心部分關(guān)閉時(shí)所吸收的量子產(chǎn)額；光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)也是捕獲的光子能量用于光化學(xué)反應(yīng)的能力指標(biāo)，表示PSⅡ開(kāi)放的反應(yīng)中心所占比例；初始熒光(Fo)來(lái)自天線色素，是已經(jīng)暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)全部PSⅡ都開(kāi)放時(shí)的熒光強(qiáng)度。圖6顯示，螺旋藻Fo、ΦPSⅡ、qP在各濃度氮、磷處理間差異不顯著，說(shuō)明本研究設(shè)置的氮、磷鹽濃度處理在整體上對(duì)這幾個(gè)熒光參數(shù)影響較小。

2.5 不同氮、磷濃度對(duì)螺旋藻代謝產(chǎn)物的影響

圖7顯示，螺旋藻可溶性蛋白含量隨著培養(yǎng)基中氮濃度的增加而逐漸顯著增加，且在各個(gè)氮濃度處理間均存在顯著差異(P<0.05)；而可溶性蛋白含量又隨著培養(yǎng)基中磷濃度的增加而先升高后降低，并在3.0 mmol·L-1磷濃度時(shí)達(dá)到最高值，且顯著高于其余處理，但在4.5 mmol·L-1磷濃度處理與0.5 和1.5 mmol·L-1磷濃度處理間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。同時(shí)，螺旋藻可溶性蛋白產(chǎn)率均隨著培養(yǎng)基中氮、磷濃度的增加而先升后降，且分別在30 mmol·L-1氮和3.0 mmol·L-1磷時(shí)達(dá)到最高值，分別為3.54和3.33 g·m-2·d-1?？梢?jiàn)，培養(yǎng)基中氮、磷濃度偏高或者偏低均會(huì)降低螺旋藻可溶性蛋白產(chǎn)率。

圖7 不同氮、磷濃度處理下螺旋藻可溶性蛋白含量及產(chǎn)率的變化Fig.7 The soluble protein content and productivity of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

同時(shí)，培養(yǎng)基中氮濃度也對(duì)螺旋藻多糖積累有顯著影響(圖8)。各氮濃度處理的多糖含量存在顯著差異(P<0.05)，并在氮濃度為15 mmol·L-1時(shí)螺旋藻胞外和胞內(nèi)多糖含量均達(dá)到最大值，分別為89.42和116.26 mg·g-1，比30 mmol·L-1氮濃度處理分別顯著增加118.79% 和40.44%。同時(shí)，隨著培養(yǎng)基中磷濃度的增加，螺旋藻胞外多糖含量顯著降低，在0.5 mmol·L-1磷濃度處理時(shí)達(dá)到最高值(99.87±6.18) mg·g-1，但胞內(nèi)多糖含量并沒(méi)有隨磷濃度發(fā)生明顯增加。另外，不同氮、磷濃度處理下多糖產(chǎn)率與多糖含量的變化趨勢(shì)一致，即在15 mmol·L-1氮和0.5 mmol·L-1磷時(shí)獲得最高值，分別為1.34和1.03 g·m-2·d-1。螺旋藻在氮、磷等營(yíng)養(yǎng)限制條件下雖不利于藻生物量的增加，但是卻會(huì)刺激藻積累大量糖類(lèi)。

圖8 不同氮、磷濃度處理下螺旋藻可溶性糖含量及產(chǎn)率的變化Fig.8 The polysaccharide content and productivity of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

3 討 論

在微藻培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)鹽中，氮源是研究較多的營(yíng)養(yǎng)因素之一，它是合成藻體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸和葉綠素的基本元素。磷雖然需要的不多，但它是細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)和磷脂的主要成分，也是調(diào)節(jié)微藻細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的必需營(yíng)養(yǎng)因子之一[6]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中氮、磷營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)，螺旋藻細(xì)胞合成較多的蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)，單細(xì)胞藻絲較長(zhǎng)；當(dāng)基質(zhì)中氮、磷營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，會(huì)影響藻細(xì)胞葉綠素合成和光合作用的進(jìn)行，單細(xì)胞藻絲變短，螺旋變少；隨著培養(yǎng)基質(zhì)中氮、磷含量降低，螺旋藻生長(zhǎng)速率下降，細(xì)胞多糖含量增加。營(yíng)養(yǎng)鹽的匱乏致使藻細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，蛋白質(zhì)合成受阻，碳水化合物多數(shù)轉(zhuǎn)化為多糖，從而引起細(xì)胞多糖含量升高[20]，并且磷源限制程度越嚴(yán)重，螺旋藻蛋白質(zhì)含量越低，多糖含量越高。鄭怡等[13]發(fā)現(xiàn)氮源濃度(試驗(yàn)范圍為1.0～2.5 g·L-1)對(duì)極大螺旋藻多糖的含量有顯著影響，且隨著培養(yǎng)液中氮源濃度的降低螺旋藻胞外多糖含量增加，當(dāng)NaNO3濃度降至1.0 g·L-1時(shí)，胞外多糖含量達(dá)到最高。陳浩等[12]研究了磷濃度對(duì)鈍頂螺旋藻生長(zhǎng)代謝的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)螺旋藻總糖含量隨著磷源濃度的增加顯著下降，并在磷源濃度為0.005 g·L-1時(shí)達(dá)到最高。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，在培養(yǎng)基中氮濃度為15 mmol·L-1(相當(dāng)于NaNO3濃度為1.275 g·L-1)時(shí)，鈍頂螺旋藻胞外和胞內(nèi)多糖的含量均達(dá)到最大值；同時(shí)，螺旋藻胞外多糖含量隨著基質(zhì)中磷濃度的增加而降低，在0.5 mmol·L-1磷濃度處理中胞外多糖含量達(dá)到最高。目前關(guān)于螺旋藻代謝產(chǎn)物如多糖和藻藍(lán)蛋白的研究大多側(cè)重于其分離純化及結(jié)構(gòu)與功能方面，而有關(guān)培養(yǎng)條件對(duì)代謝產(chǎn)物的影響則很少涉及。因此，通過(guò)對(duì)螺旋藻代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)條件及機(jī)理研究建立高產(chǎn)的生產(chǎn)模式，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

螺旋藻的光合色素包括葉綠素a、類(lèi)胡蘿卜素和藻膽素三大類(lèi)，光合作用是在他們的共同作用下完成的。光能吸收傳輸路線是光照→藻紅素(PE)→藻藍(lán)素(PC)→別藻藍(lán)素(APC)→葉綠素a。前三者傳遞光能，而葉綠素a作為光合作用反應(yīng)中心將光能轉(zhuǎn)化為電能[15,32]。本研究結(jié)果表明，在氮源缺乏的條件下，鈍頂螺旋藻合成的光合色素減少，且降解的細(xì)胞內(nèi)氮主要用于合成核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物等細(xì)胞主要組成物質(zhì)。Pancha等的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果，即在氮限制條件下微藻細(xì)胞中并沒(méi)有新的光合色素合成[33]。氮素的缺乏影響光合色素的合成，進(jìn)而削弱微藻的光合作用。另外，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，鈍頂螺旋藻生物膜對(duì)氮濃度的耐受程度更強(qiáng)，在高氮濃度(45 mmol·L-1)培養(yǎng)下，其熒光參數(shù)Fv/Fm、ETR、ΦPSⅡ都處在較高水平，同時(shí)生物質(zhì)產(chǎn)量和產(chǎn)率也較高。

已有研究表明開(kāi)放池和密閉式光生物反應(yīng)器兩種培養(yǎng)模式單位面積需水量分別為300和100 L·m-2[34]，而固定化生物膜培養(yǎng)模式可將用水量控制在60 L·m-2[35-36]。開(kāi)放池系統(tǒng)的培養(yǎng)液深度通常在15～30 cm之間，以水平跑道式環(huán)形池居多，采用葉輪轉(zhuǎn)動(dòng)的方式使培養(yǎng)液在池內(nèi)混合循環(huán)，從而防止藻體沉底并提高藻體的光能利用率，流動(dòng)所產(chǎn)生的剪切強(qiáng)度難以精準(zhǔn)測(cè)量和控制。此外，由于培養(yǎng)液層淺，CO2作為碳源的利用率不會(huì)超過(guò)20%，直接導(dǎo)致開(kāi)放池培養(yǎng)成本升高[6]。目前采用開(kāi)放池進(jìn)行戶(hù)外大規(guī)模培養(yǎng)的藻種只有螺旋藻(Spirulina)、小球藻(Chlorella)、杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)和雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)等少數(shù)幾種，但都存在著生物量低(0.5～1.0 g·L-1左右)，采收成本較高的問(wèn)題[5-6]。光封閉反應(yīng)器可以有效控制培養(yǎng)條件，控制污染，實(shí)現(xiàn)純種培養(yǎng)，且CO2及營(yíng)養(yǎng)鹽損失小，但缺點(diǎn)在于設(shè)備投資成本高，難于放大用于規(guī)模培養(yǎng)。特別是有些微藻嗜好附著于反應(yīng)器內(nèi)表面生長(zhǎng)，不僅阻礙了光能的滲透，還給生物量的采收和反應(yīng)器的清洗造成困難。本研究表明固定化生物膜培養(yǎng)模式中，在不降低生物量、減少系統(tǒng)用水量的前提下，可以快速地實(shí)現(xiàn)生物量的積累，而且采收便捷，同時(shí)可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的要求制定相應(yīng)的氮、磷營(yíng)養(yǎng)元素調(diào)控機(jī)制，為設(shè)計(jì)和建造更高效的、適合規(guī)模化生產(chǎn)螺旋藻的系統(tǒng)提供了理論基礎(chǔ)依據(jù)。

4 結(jié) 論

氮、磷水平對(duì)固定化鈍頂螺旋藻生物膜的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物有重要影響。生物膜上附著的細(xì)胞干重隨著氮、磷濃度的增加而增大，并在氮濃度30 mmol·L-1或磷濃度3 mmol·L-1的條件下達(dá)到最高值。隨著氮、磷濃度的降低，螺旋藻多糖含量增加，蛋白質(zhì)含量下降，且磷源限制程度越嚴(yán)重，螺旋藻蛋白質(zhì)含量越低，多糖含量越高。因此在生產(chǎn)應(yīng)用中可通過(guò)調(diào)控氮、磷濃度來(lái)促進(jìn)相應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物的合成積累。

隨著基質(zhì)中氮、磷濃度的降低，螺旋藻中的葉綠素a、類(lèi)胡蘿卜素和藻膽素的等光合色素含量減少。光合色素的減少削弱了螺旋藻生物膜的光合作用效率，葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm)和 電子傳遞速率(ETR)降低。與磷濃度相比，螺旋藻生物膜對(duì)氮濃度的耐受程度更強(qiáng)，在高氮濃度(45 mmol·L-1)培養(yǎng)下，螺旋藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)都處在較高水平，同時(shí)生物質(zhì)產(chǎn)量也較高。利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)可對(duì)螺旋藻生物膜的光合生理狀況和營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行快速的測(cè)定和診斷。