青稞HD-Zip基因家族鑒定及其在非生物脅迫下的表達特性

祁存英，李 媛，楊成蘭，馬銀花，段瑞君

(青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧 810016)

同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白(homedomain-leucine zipper，HD-Zip)是一類高等植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長發(fā)育抗脅迫過程中發(fā)揮重要的作用[1]。該轉(zhuǎn)錄因子主要包括兩個保守結(jié)構(gòu)域，分別是負責(zé)序列特異性DNA結(jié)合的同源結(jié)構(gòu)域(homeodomain，HD)和促進蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(leucine zipper，LZ)[2]。根據(jù)氨基酸序列、保守基序和蛋白功能的不同，植物HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子分為4大亞類(HD-Zip Ⅰ-Ⅳ)[3]：Ⅰ亞家族僅含HD和LZ 結(jié)構(gòu)域，Ⅱ亞族額外有一個N 端保守區(qū)域(N-term)[4]；Ⅲ亞族較復(fù)雜，除HD 和LZ 結(jié)構(gòu)域之外，還包含保守的START結(jié)構(gòu)域及與之相鄰的SAD結(jié)構(gòu)域和 MEKHLA 結(jié)構(gòu)域；亞族Ⅳ蛋白除缺少MEKHLA結(jié)構(gòu)域外，與亞族Ⅲ結(jié)構(gòu)上類似，但識別的蛋白序列有較大差異[5]。

最近研究表明，HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物的生長發(fā)育、新陳代謝、激素調(diào)節(jié)以及生物和非生物脅迫響應(yīng)的各個階段[6]，其中HD-Zip亞族Ⅰ成員主要參與植物對各種非生物脅迫因子的應(yīng)答反應(yīng)、激素、器官發(fā)育調(diào)控和光信號應(yīng)答過程[7]；亞家族Ⅱ成員除受干旱、高鹽、冷害等非生物脅迫因素誘導(dǎo)外[8]，在植物光響應(yīng)、生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及避蔭反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用[6]；亞族Ⅲ成員在擬南芥發(fā)育過程中調(diào)控胚胎形態(tài)發(fā)生、頂端分生組織形成、葉片極性建立和維管組織細胞分化[9]，同時在植物不同組織不同發(fā)育時期發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用[10]；Ⅳ亞家族成員主要調(diào)控花青素積累、表皮細胞分化、根的生長和毛狀體的形成[11]，同時也參與植物表皮細胞層的發(fā)育和維持、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和非生物脅迫響應(yīng)[12]。

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)又稱裸大麥，是中國藏區(qū)同胞不可替代的主糧，主要分布在海拔3 000～5 000 m的高寒地帶[13]，用途廣泛且具有多種優(yōu)異栽培種性[14]。干旱等非生物脅迫是制約青稞生產(chǎn)的主要限制因子，發(fā)掘改良其抗逆性的關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)η囡牧季哂兄匾饬x。棉花[5]、擬南芥[15]、水稻[16]、小麥[17]、玉米[18]、蒺藜苜蓿[19]和大麥[20]等許多植物中，對HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子的基因家族分析及基因功能研究表明其在植物抗逆中發(fā)揮著重要作用，但在青稞中尚未有相關(guān)分析及研究。因此，本研究利用已公布的青稞基因組信息[21-22]，通過生物信息學(xué)方法鑒定青稞HD-Zip基因家族成員，分析其基因結(jié)構(gòu)、啟動子順式元件分布特征以及在非生物脅迫下不同組織中的表達特點，為進一步開展高原作物青稞HD-Zip基因家族的基因功能研究及其在青稞抗逆改良中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

實驗材料為青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)品種‘肚里黃’，由青海省青稞遺傳育種重點實驗室提供。

將14日齡青稞水培(改良霍格蘭營養(yǎng)液)幼苗用含有200 mmol/L NaCl(鹽)、18%終濃度PEG-6000(模擬干旱)的改良霍格蘭營養(yǎng)液及4 ℃低溫(冷)處理48 h，之后解除脅迫恢復(fù)正常培養(yǎng)48 h。采集各時間節(jié)點根和葉組織樣品，試劑盒法提取RNA(TaKaRa，Code No.9769)。

1.2 實驗方法

1.2.1HvvHD-Zip基因家族成員鑒定及其理化性質(zhì)分析青稞基因組數(shù)據(jù)從http://www.ibgs.zju.edu.cn/ZJU_barleygenome.Htm網(wǎng)站和NCBI數(shù)據(jù)庫(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genbank/plant/Hordeum_vulgare/all_assembly_versions/GCA_004114815.1_Hulless_Barley_ass.V2/)下載獲得；通過植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫Plant TFDB V5.0和Tair數(shù)據(jù)庫下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)HD-Zip蛋白序列；通過Pfam 35.0數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)分別下載HD和LZ結(jié)構(gòu)域的隱馬爾科夫模型(HMM)PF00046和PF02183，使用HMMER搜索工具對青稞基因組數(shù)據(jù)進行初步搜索鑒定；同時以擬南芥HD-Zip蛋白序列作為查詢序列，采用本地Blast的Blastp程序檢索(設(shè)置參數(shù)e<1×e-10，相似性>40%)，獲得與擬南芥相似性較高的青稞HD-Zip序列，整合以上兩步所得候選序列；利用Pfam 35.0數(shù)據(jù)庫、InterPro數(shù)據(jù)庫(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)和NCBI-CDD在線工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進行家族成員驗證分析，去除結(jié)構(gòu)域不符或者殘缺的候選序列，剩余基因鑒定為青稞HD-Zip基因家族成員(HvvHD-Zip)。

利用Expasy數(shù)據(jù)庫(https://www.expasy.org/)分析青稞HD-Zip蛋白分子量等理化性質(zhì)參數(shù)；亞細胞定位信息利用Plant-mPLoc數(shù)據(jù)庫(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)預(yù)測。

1.2.2HvvHD-Zip基因染色體定位分析在青稞基因組數(shù)據(jù)庫中搜索HD-Zip基因的染色體定位信息，利用MapChart 2.32軟件(https://www.wur.nl/en/show/Mapchart.htm)生成染色體分布圖。

1.2.3HvvHD-Zip基因多序列比對、系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析使用MEGA11.0軟件(https://www.megasoftware.net/)的Clustal W程序?qū)η囡鼿D-Zip蛋白進行多序列比對，將比對結(jié)果載入GeneDoc軟件(https://genedoc.software.informer.com/)進行同源序列比對作圖與分析。

使用MEGA11.0軟件的Clustal W程序進行青稞、大麥(HordeumvulgareL.)、擬南芥和水稻(Oryzasativa)(水稻RGAP數(shù)據(jù)庫，Rice Genome Annotation Project,http://rice.uga.edu/)HD-Zip蛋白序列的多重比對；采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)為1000，其余參數(shù)保持默認。最后生成的圖形使用Evolview v2(https://www.evolgenius.info/evolview-v2/)進行美化。

使用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線預(yù)測HvvHD-Zip基因結(jié)構(gòu)；利用MEME (http://memesuite.org/tools/meme)工具預(yù)測該基因家族的保守基序，最大基序數(shù)量為20，基序?qū)挾仍O(shè)在6～100之間，其余參數(shù)設(shè)置為默認，最后用TBtools V1.0983 軟件[23]進行可視化。

1.2.4HvvHD-Zip基因順式作用元件分析提取HvvHD-Zip基因5′端上游2.0 kb長序列作為啟動子序列，在Plant CARE在線網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/Html/)進行其順式作用元件分析；利用TBtools篩選保留常見功能元件并繪制可視化圖片。

1.2.5HvvHD-Zip基因非生物脅迫表達分析參考德國萊布尼茲植物遺傳與作物研究所(IPK)數(shù)據(jù)庫(https://www.ipk-gatersleben.de/)公布的大麥各組織表達量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合已發(fā)表的大麥HD-Zip基因家族成員組織表達及非生物脅迫特點研究[24]，本研究篩選出22個青稞HD-Zip基因家族成員進行后續(xù)qRT-PCR實驗。

以青稞HvqActin基因作為內(nèi)參基因，以不同脅迫處理條件下根和葉組織樣品的cDNA為模板，利用NCBI在線引物設(shè)計網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)對選取的22個HvvHD-Zip基因進行qRT-PCR實驗引物設(shè)計(表1)；qRT-PCR反應(yīng)體系參考熒光定量試劑盒(Tiangen，RealUniversal Color PreMix SYBR Green,FP201)進行；每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量，GraphPad prism 8.0軟件(https://www.graphpad.com/)進行數(shù)據(jù)分析、作圖及差異顯著性分析。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 HvvHD-Zip基因家族成員鑒定與理化性質(zhì)分析

從青稞基因組中共鑒定出41個HvvHD-Zip家族成員，根據(jù)其在染色體上的位置依次命名為HvvHD-ZipⅠ-1～Ⅳ-13。HvvHD-Zip家族基因編碼氨基酸長度范圍在197～885 aa；分子量范圍在19 914.36～94 014.87 Da；等電點介于4.62～9.97之間，其中有26個基因等電點<7.0，約占總數(shù)的63.4%，推測大部分蛋白為酸性蛋白；除HvvHD-ZipⅣ-7外(不穩(wěn)定指數(shù)為39.57<40)，其余均為不穩(wěn)定蛋白；且所有HvvHD-Zip蛋白均表現(xiàn)為親水性(GRAVY<0)；亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，HvvHD-Zip家族蛋白均定位在細胞核中，符合一般轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)特性(表2)。

2.2 HvvHD-Zip基因染色體定位分析

HvvHD-Zip基因的染色體物理定位結(jié)果(圖1)顯示，除因基因組差異導(dǎo)致的12個基因無染色體位置信息外(表2)，其余29個基因分布在7條染色體上，且分布不均勻，其中5號染色體上分布最多(10個)，2號和6號染色體分布較多(5個)，3和7號染色體各分布1個基因(HvvHD-ZipⅢ-5、HvvHD-ZipⅡ-3)。

圖1 HvvHD-Zip基因染色體定位Fig.1 Chromosome location of HvvHD-Zip genes

表2 HvvHD-Zip基因家族理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of HvvHD-Zip gene family

2.3 HvvHD-Zip蛋白的多序列比對、系統(tǒng)發(fā)育、保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

基于青稞41個HvvHD-Zip蛋白多序列比對結(jié)果顯示(圖2)，其氨基酸序列在HD和LZ結(jié)構(gòu)域上具有較高的相似性；但各亞家族成員在LZ結(jié)構(gòu)域內(nèi)部存在較高的差異，尤其5個Ⅲ亞家族成員(HvvHD-Zip Ⅲ-1～Ⅲ-5)在氨基酸序列上與其他家族成員存在較明顯的不同。

對選取的41個青稞、32個大麥、48個擬南芥和41個水稻HD-Zip蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明(圖3)162個HD-Zip蛋白可分為4亞家族(HD-Zip Ⅰ～Ⅳ)；青稞HD-Zip各個亞家族分別含有11、12、5和13個成員，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ亞族數(shù)目與水稻相似，表明HD-Zip基因這3個亞家族成員在青稞基因組中差異不大，而Ⅲ亞族成員數(shù)相比于水稻明顯減少，但與擬南芥一致；與大麥相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ亞家族成員數(shù)目相差較大(大麥Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ亞家族成員數(shù)目分別為16、4、8個)，但Ⅲ亞家族成員數(shù)僅差1個(大麥為4個)。

圖3 不同植物HD-Zip基因家族的系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the HD-Zip gene family of different plants

蛋白保守基序分析結(jié)果顯示(圖4，A)，所有HvvHD-Zip基因均發(fā)現(xiàn)了編碼HD和LZ結(jié)構(gòu)域的保守基序，其中HD-Zip Ⅰ和HD-Zip Ⅱ亞家族成員包含較少的基序，且分布較為簡單，而Ⅲ和Ⅳ亞家族具有多基序復(fù)雜結(jié)構(gòu)；進一步分析HvvHD-Zip家族成員基因結(jié)構(gòu)(圖4，B)發(fā)現(xiàn)，41個成員在外顯子-內(nèi)含子排列上存在較大差異，但仍與4個亞家族的分類相一致。Ⅰ、Ⅱ亞家族中，各成員具有1～4個外顯子，基因結(jié)構(gòu)相對簡單；Ⅲ、Ⅳ亞家族成員具4～18個外顯子數(shù)，尤其以Ⅲ亞家族成員含有更多的外顯子，基因結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜。

圖4 HvvHD-Zip基因的保守基序(A)和基因結(jié)構(gòu)(B)Fig.4 Conserved motif (A) and gene structure (B) of HvvHD-Zip genes

2.4 HvvHD-Zip基因順式作用元件分析

對HvvHD-Zip家族成員上游2 000 bp的啟動子進行順式作用元件分析，共鑒定到11種與植物激素和脅迫響應(yīng)有關(guān)的啟動子順式作用元件(圖5)。其中，與激素類有關(guān)的響應(yīng)元件有脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)、赤霉素響應(yīng)元件(P-box、TATC-box)、水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)和生長素反應(yīng)原件(TGA-element、AuxRR-core)等5種，其中，含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件的HvvHD-Zip基因占73.17%；與脅迫響應(yīng)相關(guān)元件有6種，分別為無氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件(ARE)、參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件(TC-rich repeat)、低溫響應(yīng)誘導(dǎo)元件(LTR)、光響應(yīng)元件(TCCC-motif、Sp1、GA-motif、G-Box、Box 4)、缺氧特異性誘導(dǎo)元件(GC-motif)和干旱響應(yīng)誘導(dǎo)元件(MBS)，其中，含低溫響應(yīng)和干旱響應(yīng)元件的HvvHD-Zip基因分別占41.46%和46.34%，含有光響應(yīng)元件的占100%。這表明HvvHD-Zip基因廣泛參與青稞的脅迫響應(yīng)和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖5 HvvHD-Zip基因順式作用元件分布Fig.5 cis-acting elements distribution map of HvvHD-Zip genes

2.5 HvvHD-Zip基因的非生物脅迫表達分析

通過對青稞幼苗進行短期冷、旱、鹽等非生物脅迫和解除脅迫處理，采集各時間節(jié)點幼苗根和葉組織樣品，對組織中的22個HvvHD-Zip基因表達進行相對定量分析。結(jié)果(圖6)得知：冷脅迫下，有4個基因(HvvHD-ZipⅡ-4、HvvHD-ZipⅣ-7、HvvHD-ZipⅣ-8和HvvHD-ZipⅣ-10)在根組織中上調(diào)表達，其中HvvHD-ZipⅣ-7基因在脅迫后顯著高表達；在葉組織中有5個基因(HvvHD-ZipⅣ-1、HvvHD-ZipⅣ-4、HvvHD-ZipⅣ-7、HvvHD-ZipⅣ-8和HvvHD-ZipⅣ-10)顯著高表達。旱脅迫后，在根組織中有10個基因上調(diào)表達(HvvHD-ZipⅠ-8、HvvHD-ZipⅡ-1、HvvHD-ZipⅡ-2、HvvHD-ZipⅡ-4、HvvHD-ZipⅡ-5、HvvHD-ZipⅡ-11、HvvHD-ZipⅢ-3、HvvHD-ZipⅢ-4、HvvHD-ZipⅢ-5和HvvHD-ZipⅣ-8)，其中HvvHD-ZipⅠ-8、HvvHD-ZipⅡ-1、HvvHD-ZipⅢ-3和HvvHD-ZipⅣ-8等4個基因顯著高表達；有13個基因在葉組織中上調(diào)表達，其中有12個基因顯著高表達。鹽脅迫后，根組織中有3個基因顯著高表達；HvvHD-ZipⅠ-1、HvvHD-ZipⅠ-8、HvvHD-ZipⅡ-1、HvvHD-ZipⅢ-4、HvvHD-ZipⅣ-7、HvvHD-ZipⅣ-8和HvvHD-ZipⅣ-10等7個基因在葉組織中上調(diào)表達，其中HvvHD-ZipⅣ-10基因在脅迫后顯著高表達。

冷脅迫后，在根或葉組織中，上調(diào)表達基因多為Ⅱ、Ⅳ亞家族成員(HvvHD-ZipⅡ-4、HvvHD-ZipⅣ-7、HvvHD-ZipⅣ-8和HvvHD-ZipⅣ-10)，Ⅰ亞家族成員下調(diào)表達(如HvvHD-ZipⅠ-8)或無表達；旱脅迫后，4個亞家族中的多數(shù)基因上調(diào)或下調(diào)表達；鹽脅迫后，除基本無表達基因外，上調(diào)或下調(diào)表達基因多為Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ亞家族基因。

冷脅迫解除后，根組織中各基因表達情況與冷脅迫時大致相似，表達上調(diào)基因有4個；葉組織中上調(diào)和下調(diào)表達基因各有7和3個，其余基因基本無表達。旱脅迫解除后，根組織中表達上調(diào)基因有11個，其余基因下調(diào)表達或基本無表達；在葉組織中有8個表達上調(diào)基因。解除鹽脅迫后，根組織和葉組織中表達上調(diào)較少，都為3個。

總的來說，脅迫處理后，不同亞家族成員響應(yīng)脅迫的水平不一致，尤其是Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ亞家族成員對脅迫響應(yīng)較明顯；在脅迫或者脅迫解除條件下，HvvHD-Zip家族基因在葉組織中響應(yīng)明顯(上調(diào)或下調(diào))；且在3種非生物脅迫下，HvvHD-Zip各基因?qū)得{迫下響應(yīng)較強。有趣的是，在旱脅迫下，Ⅲ亞家族基因3個基因在根中響應(yīng)脅迫，表達量都有所上調(diào)。

3 討 論

植物在生長發(fā)育過程中受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，同源異型域-亮氨酸拉鏈(HD-Zip)轉(zhuǎn)錄因子影響植物發(fā)育各個階段的生物學(xué)功能[25]；本研究共鑒定到41個青稞HD-Zip基因，與擬南芥(48個)、水稻(48個)在數(shù)目上有差距，但相差不大；但值得探討的是，已發(fā)表的大麥HD-Zip基因家族成員有32個[20]，與青稞稍有出入；且在青稞HD-Zip各亞家族中，Ⅲ亞家族成員數(shù)最少僅有5個，這與早先報道一致，即HD-Zip Ⅲ亞家族是各個物種中最為保守的亞家族，成員數(shù)少，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜[18,26]。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)單雙子葉植物在進化關(guān)系中仍存在一定差異：單子葉植物青稞和水稻很多旁系同源基因基本上是對應(yīng)的，但與雙子葉植物擬南芥在一定程度上有分歧，該結(jié)果與大麥HD-Zip基因家族分析基本一致[20]，此結(jié)果也驗證了單雙子葉植物在進化進程中的區(qū)別。

*和**分別代表不同處理間在0.05(P<0.05)和0.01水平(P<0.01)差異顯著圖6 HvvHD-Zip基因在不同非生物脅迫下的相對表達特征* and ** represent significant differences between different treatments at (P <0.05) and 0.01 (P <0.01) level,respectivelyFig.6 Relative expression characteristics of HvvHD-Zip genes under different abiotic stresses

對青稞HD-Zip家族基因進行順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)個別特定類型的順式作用元件只存在于某些亞家族中，例如，TGA-element、AuxRR-core(生長素反應(yīng)元件)只存在于青稞HD-Zip Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ亞家族基因中，這不僅與龍眼中發(fā)現(xiàn)的某些順式元件只存在于個別家族成員啟動子內(nèi)情況相似[27]，還與玉米中順式作用元件AuxRR-core(生長素反應(yīng)元件)僅分布在某些Ⅲ和Ⅳ類HD-Zip基因的啟動子中表現(xiàn)一致[28]；這一結(jié)果表明青稞HD-Zip各個亞家族成員可能在其生理生化調(diào)控過程發(fā)揮了不同的作用。結(jié)合HvvHD-Zip家族基因進行順式作用元件與非生物脅迫表達特性分析，發(fā)現(xiàn)許多基因啟動子中存在許多與脅迫反應(yīng)、激素反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，且多數(shù)基因均響應(yīng)冷、旱和鹽等非生物脅迫。研究表明，植物脅迫響應(yīng)機制的一個關(guān)鍵和重要組成部分是植物基因通過植物轉(zhuǎn)錄因子的作用對環(huán)境脅迫作出反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[29]，由于結(jié)構(gòu)上的相似性，HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子同一亞家族成員往往表現(xiàn)出功能保守性，他們通過與某些順式元件結(jié)合來調(diào)節(jié)基因?qū)に匦盘柣蛏锖头巧锩{迫的表達[30]。據(jù)報道，許多HD-Zip Ⅰ亞家族基因參與調(diào)控對干旱、鹽堿和寒冷脅迫等非生物脅迫條件的發(fā)育適應(yīng)[7，31]，比如擬南芥HD-Zip Ⅰ亞家族的ATHB7基因是由干旱或脫落酸誘導(dǎo)[32]，向日葵中的HAHB4基因由茉莉酸甲酯誘導(dǎo)[33]，富含各種脅迫響應(yīng)順式調(diào)控元件的水稻HD-Zip Ⅰ亞家族基因的干旱響應(yīng)啟動子，有利于特定脅迫響應(yīng)基因的過度表達[34]；過表達蘋果類MdHB7基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽脅迫能力[35]；對水稻進行干旱處理發(fā)現(xiàn)，HD-Zip Ⅰ亞家族Oshox4基因表達受到干旱抑制，而Oshox22表達則被誘導(dǎo)[36]；在PEG(旱)、熱、冷、NaCl(鹽)脅迫下黃瓜HD-Zip Ⅰ亞家族的CsHD-Zip基因被顯著誘導(dǎo)[37]。本研究中，在青稞HD-Zip Ⅰ、Ⅱ亞家族中發(fā)現(xiàn)了較多的脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)和參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件(TC-rich repeat)，同時在短期冷、旱、鹽脅迫處理后，HvvHD-Zip Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ亞家族基因?qū)得{迫響應(yīng)較強，這與Li等[17]所闡述的在小麥(TriticumaestivumL.)中Ⅰ亞家族和Ⅱ亞家族基因由干旱脅迫誘導(dǎo)所得結(jié)論一致，表明HD-Zip Ⅰ、Ⅱ亞家族成員在青稞非生物脅迫反應(yīng)中具有潛在重要性。此外，關(guān)于HD-Zip Ⅳ轉(zhuǎn)錄因子的現(xiàn)有研究表明，它們參與了植物器官外層細胞層的發(fā)育和維持調(diào)控，這可能在植物抵御病原體和保護非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[38]；在刺梨中，光響應(yīng)元件是影響Ⅳ亞家族基因參與植物生理生化活動最重要的因素[39]，超量表達擬南芥HD-Zip Ⅳ亞家族HDG11基因有助于提高植株(水稻、甘薯和煙草等)抗旱性[40]。在本研究中，HvvHD-Zip Ⅳ亞家族基因不僅含有較多的光響應(yīng)元件，對冷、旱和鹽等非生物脅迫均有響應(yīng)，與番茄中13個HD-ZipⅣ基因?qū)Χ喾N植物激素和非生物脅迫處理都有響應(yīng)的結(jié)果[41]基本一致。

此外，還有較為重要的一點是，據(jù)報道不同的啟動子順式元件及其表觀遺傳變化會影響基因調(diào)控[42]，從而導(dǎo)致不同的基因表達水平，并進一步影響對環(huán)境的適應(yīng)[43]，如Duo等[44]比較發(fā)現(xiàn)大麥和青稞的LTP基因序列基本相同，但啟動子和逆境表達模式不同，兩者LTP基因上游順式元件的不同改變了其調(diào)控模式，從而引起了不同的非生物脅迫反應(yīng)，導(dǎo)致青稞適應(yīng)極端高原氣候；本研究中青稞HD-Zip基因家族成員中含干旱和低溫啟動子-順式元件占總成員數(shù)接近一半，猜想這為青稞更好地適應(yīng)高原不良環(huán)境創(chuàng)造了條件。

綜上所述，本研究對青稞HD-Zip基因進行了比較全面的基因組分析，明確了不同非生物脅迫下HvvHD-Zip基因在不同組織中的表達特性，為后續(xù)研究青稞HD-Zip基因的非生物脅迫功能提供基礎(chǔ)資料，也為進一步青稞優(yōu)良抗性品種選育提供理論指導(dǎo)。