獼猴桃Aux/IAA基因家族的鑒定與表達(dá)

蘇麗艷

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西省航天育種工程中心，西安 710065)

生長(zhǎng)素作為重要的植物激素之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育，如細(xì)胞分裂與伸長(zhǎng)、器官形成、果實(shí)的發(fā)育等過(guò)程有重要的調(diào)控作用[1-2]。Aux/IAA是生長(zhǎng)素信號(hào)早期響應(yīng)因子之一，在生長(zhǎng)素濃度較低時(shí)，Aux/IAA通過(guò)與生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(auxin response factor,ARF)形成異源二聚體抑制生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程；當(dāng)生長(zhǎng)素濃度較高時(shí)，Aux/IAA發(fā)生降解，釋放ARF，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[3-4]。典型的Aux/IAA基因含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 四個(gè)保守的結(jié)構(gòu)功能域，結(jié)構(gòu)域 Ⅰ 包含保守的亮氨酸重復(fù)基序LxLxLx，抑制生長(zhǎng)素下游調(diào)控基因。結(jié)構(gòu)域 Ⅱ 保守的GWPPV 基序與 F-box 蛋白 TIR1 相互作用，導(dǎo)致 Aux/IAA 的不穩(wěn)定性和快速降解。位于 C 端的結(jié)構(gòu)域 Ⅲ和 Ⅳ 能與其他 Aux/IAA 或 ARF 相互作用，形成同源二聚體和異源二聚體，從而調(diào)控下游基因表達(dá)[5-6]。

隨著植物基因組測(cè)序的完成，Aux/IAA家族基因在多種植物中均已分離與鑒定。如擬南芥中分離鑒定Aux/IAA家族基因29個(gè)，水稻31個(gè)，番茄26個(gè)，黃瓜27個(gè)，玉米34個(gè)，草莓21個(gè)，且在小麥、葡萄、毛白楊和苜蓿等物種中均已被分離和鑒定[7-15]。Aux/IAA家族基因在植物發(fā)育過(guò)程中的功能也被廣泛研究。在擬南芥中研究表明，iaa3/shy2、iaa7/axr2、iaa14/slr、iaa17/axr3、iaa28等 Aux/IAA 家族基因均參與擬南芥?zhèn)雀男纬蛇^(guò)程[16-18]；水稻OsIAA1、OsIAA11及OsIAA23亦在根的發(fā)育過(guò)程中有重要調(diào)控作用[19-20]；在番茄中，Sl-IAA9、Sl-IAA15、Sl-IAA17、Sl-IAA27等Aux/IAA 家族基因均參與調(diào)控番茄的根、葉及果實(shí)的發(fā)育過(guò)程[21-24]。

獼猴桃，又稱奇異果，因其品質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富而受到廣泛歡迎。紅陽(yáng)獼猴桃屬中華獼猴桃(Actinidiachinensis)中的紅肉獼猴桃變種，栽培過(guò)程中經(jīng)常受到各種的非生物脅迫，如干旱、寒冷、鹽分和激素脅迫。紅陽(yáng)獼猴桃全基因組測(cè)序的完成為鑒定基因家族成員的數(shù)量及預(yù)測(cè)其功能提供了重要的數(shù)據(jù)資源。本研究借助生物信息學(xué)手段分離鑒定獼猴桃Aux/IAA(AcIAA)家族成員，并對(duì)其序列特征、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件，不同組織及激素脅迫的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為進(jìn)一步通過(guò)基因工程手段分析該家族基因在獼猴桃發(fā)育過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及取樣

紅陽(yáng)獼猴桃由陜西省周至縣佰瑞獼猴桃研究院提供。植物組織取樣自3株5年生(2016-2021)紅陽(yáng)獼猴桃嫁接樹(嫁接砧木為佰瑞研究院自主培育品種YZ31012)，包括根、莖、葉(春季幼葉第4片)、花、小果 (約花后30 d)、熟果 (約花后120 d)，每種組織取3次重復(fù)。激素處理植株選取苗長(zhǎng)約25 cm，含有6～8片葉的2年生嫁接苗。植物激素噴施于葉片上，處理濃度為100 μmol·L-1，對(duì)照組用超純水處理。處理及對(duì)照組分別在處理0、1、6和12 h 取材，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取長(zhǎng)勢(shì)較好的6株嫁接幼苗，每個(gè)樣品含有6片不同植株的葉片。所有植物材料液氮冷藏于-80 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 Aux/IAA家族基因的鑒定紅陽(yáng)獼猴桃基因組數(shù)據(jù)下載于Ensembl Plants (http://plants.ensembl.org/index.html)，包括gff文件、蛋白序列和核酸序列文件[25]。IAA 基因家族的 HMM 模型(PF02309)下載于Pfam 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)，利用 HMMER 軟件包的 hmmsearch 程序在獼猴桃基因組氨基酸序列中進(jìn)行搜索(E<1 × 10-5)，用 Perl 腳本提取候選蛋白的序列信息，比對(duì)到 Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)候選序列所含的結(jié)構(gòu)域，保留含有IAA家族基因結(jié)構(gòu)域的序列即為獼猴桃IAA家族成員初篩結(jié)果，再利用在線網(wǎng)站SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) 及NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/ cdd/wrpsb.cgi)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)檢驗(yàn)，確定Aux/IAA成員組成。

1.2.2 生物信息學(xué)分析利用在線工具 ExPASy(https：//web.expasy.org/protparam/)分析 Aux/IAA家族蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)信息；使用 CELLO(http：//cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用MapChart V2.1進(jìn)行染色體定位分析，通過(guò) MEGA X 軟件采用鄰接法(neighbour-joining，NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹，利用meme軟件做motif分析；利用 GSDS 2.0(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；利用Clustalw 軟件進(jìn)行蛋白序列比對(duì)；通過(guò) MCScanX 程序分析基因復(fù)制事件，DSP software展示獼猴桃和擬南芥Aux/IAA 基因共線性關(guān)系，運(yùn)用擬南芥和獼猴桃之間PMEI 共線線性基因?qū)τ?jì)算 Ka 和 Ks 值，計(jì)算分化時(shí)間 T= Ks/2R；利用 PlantCARE 對(duì)獼猴桃Aux/IAA基因起始密碼上游 1.5 kb 啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行查找和統(tǒng)計(jì)分析；基因定位利用WoLF PSORT在線網(wǎng)站完成。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析獼猴桃葉片總RNA采用去多糖多酚試劑盒(天根，北京)提取，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA(天根，北京)。以cDNA 為模板，利用ABI Quant Studio tm 6 Flex熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行qPCR 檢測(cè)。采用SYBR Green Master Mix (ROX，瑞士)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)總體系為20 μL，包含SYBR Green Master Mix 10 μL，1 μL cDNA (30 ng · μL-1) 模板，上、下游引物 (10 μmol·L-1) 各1 μL，1 μL cDNA (30 ng · μL-1)模板，無(wú)菌水7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。選取ACT2 基因 (GenBank:EF063571)為內(nèi)參，用在線工具 Primer 3.0(http：//primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)AcIAA家族基因特異性引物(表1)，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物Table 1 All the primers for quantitative real-time PCR

續(xù)表1 Continued Table 1

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃AcIAA家族成員的鑒定及染色體定位

經(jīng)過(guò)分析與鑒定，確定獼猴桃AcIAA家族包含50個(gè)成員(表2)。根據(jù)其在染色體上的定位信息進(jìn)行命名，若X號(hào)染色體上包含多個(gè)成員，則命名為AcIAA Xa、AcIAA Xb 以此類推。AcIAA家族成員氨基酸大小介于125～391 aa,分子量介于14.06～42.48 kD，等電點(diǎn)介于 4.33～9.51。內(nèi)含子在1～5個(gè)不等。染色體定位分析表明，50個(gè)基因不均等地分布于21條染色體上，其中23號(hào)染色體上分布最多，共11個(gè)。

表2 獼猴桃AcIAA家族成員基本信息Table 2 Basic information of AcIAA family in A. chinensis

2.2 獼猴桃AcIAA家族成員進(jìn)化關(guān)系分析

通過(guò)NJ方法構(gòu)建獼猴桃AcIAA家族成員進(jìn)化樹，對(duì)50個(gè)基因的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近可將其分為9組，進(jìn)化樹聚集在同一分支的成員間通常具有相似的基因結(jié)構(gòu)和保守元件，可能在進(jìn)化過(guò)程中具有相似的功能，不同的分支在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中可能出現(xiàn)了功能的分化(圖1)。

圖1 獼猴桃與擬南芥中Aux/IAA家族進(jìn)化關(guān)系分析Fig.1 Phylogenetic relationships of Aux/IAA family between A. thaliana and A. chinensis

2.3 獼猴桃AcIAA家族成員基因結(jié)構(gòu)及保守元件分析

基因結(jié)構(gòu)分析表明，獼猴桃AcIAA家族成員所含內(nèi)含子數(shù)1～5個(gè)不等，外顯子數(shù)2～7個(gè)不等。其中，結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的AcIAA18a和AcIAA24a含有1個(gè)內(nèi)含子，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的AcIAA4、AcIAA11a和AcIAA21a含有5個(gè)內(nèi)含子(圖2)。15個(gè)保守元件分析結(jié)果表明，50個(gè)AcIAA包含元件的種類和數(shù)量不等，Motif 2在50個(gè)基因中均含有，而Motif1、Motif3和Motif4存在于大部分家族成員中。

圖2 AcIAA家族進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)及保守元件分析Fig.2 Phylogeny,motifs,and exon-intronic structures of AcIAAs

續(xù)表2 Continued Table 2

2.4 Aux/IAA家族基因共線性分析

由于基因重復(fù)能顯著促進(jìn)基因家族的擴(kuò)展和蛋白質(zhì)功能的多樣化，本研究分析了AcIAA家族基因在獼猴桃基因組內(nèi)(圖3)及與擬南芥基因組間的基因復(fù)制事件(圖4)。結(jié)果表明，組內(nèi)篩選到23組重復(fù)事件AcIAA基因?qū)?，包?0對(duì)片段重復(fù)和3對(duì)串聯(lián)重復(fù)(AcIAA23k/AcIAA23h、AcIAA23j/AcIAA23g、AcIAA23b/AcIAA23a)。組間篩選到24個(gè)AcIAA基因與擬南芥IAA家族基因形成了36組共線性關(guān)系(圖4)，基因組共線性分析可以預(yù)測(cè)AcIAA基因在種內(nèi)和種間的序列同源性，同源基因可能具有相似的功能，因此全基因組共線性分析對(duì)于關(guān)鍵基因功能預(yù)測(cè)提供了線索。

圖3 獼猴桃AcIAA家族基因共線性分析Fig.3 Collinear prediction of AcIAA family genes in A. chinensis

圖4 獼猴桃與擬南芥基因組間Aux/IAA家族基因共線性分析Fig.4 Collinear prediction of Aux/IAA family genes between A. thaliana and A. chinensis

2.5 Aux/IAA家族基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析

對(duì)AcIAA家族成員啟動(dòng)子區(qū)1 500 bp序列進(jìn)行了順式作用元件分析。結(jié)果表明(表3)，50個(gè)AcIAA基因含有多種植物激素應(yīng)答及脅迫響應(yīng)元件，包括生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、厭氧誘導(dǎo)、脅迫反應(yīng)、干旱及低溫等，預(yù)測(cè)該基因家族在獼猴桃形態(tài)建成及激素互作調(diào)控果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用。此外，AcIAA基因均含光響應(yīng)元件，且部分基因含有組織特異性(胚乳、分生組織等)。

表3 獼猴桃AcIAA基因家族基本信息Table 3 Basic information of AcIAA gene family in A. chinensis

2.6 Aux/IAA家族基因組織表達(dá)特異性分析

qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AcIAA基因在6種不同組織中均有表達(dá)，表達(dá)模式差異明顯(圖5)。AcIAA23k、AcIAA9b、AcIAA11c、AcIAA28a分別在根、莖、葉片和花中的表達(dá)量最高，其中AcIAA28a在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中始終維持相對(duì)較高表達(dá)水平，說(shuō)明該基因可能在果實(shí)整個(gè)發(fā)育過(guò)程中有重要的調(diào)控作用；AcIAA12c和AcIAA28b分別在小果和成熟果實(shí)中表達(dá)量最高。

圖5 獼猴桃AcIAA基因在不同組織中表達(dá)熱圖Fig.5 The heatmap of AcIAA gene in different tissues of A. chinensis

2.7 AcIAA對(duì)外源激素IAA的響應(yīng)模式分析

研究表明，Aux/IAA家族的基因作為生長(zhǎng)素原初反應(yīng)基因在激素互作調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程有重要的功能。本研究篩選15個(gè)AcIAA基因?yàn)槟繕?biāo)基因，利用qRT-PCR對(duì)其在植物激素IAA處理后的響應(yīng)模式進(jìn)行分析。結(jié)果(圖6，A)顯示，AcIAA3a、AcIAA5、AcIAA9b、AcIAA11b、AcIAA12c、AcIAA21a、AcIAA23j、AcIAA23k共8個(gè)基因在IAA處理后迅速響應(yīng)，1 h后呈現(xiàn)顯著性下調(diào)表達(dá)且持續(xù)到12 h后，特別是AcIAA9b持續(xù)保持顯著下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，其他基因后期表達(dá)量較處理初期有上升趨勢(shì)，但仍然低于同期對(duì)照組；同時(shí)，AcIAA12b、AcIAA16d、AcIAA23e、AcIAA24b4個(gè)基因在IAA處理1和6 h后表達(dá)量顯著下調(diào)，12 h后恢復(fù)正常水平；AcIAA25在IAA處理12 h呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，應(yīng)答速度較其他基因遲緩；AcIAA1a和AcIAA18a在IAA處理1 和6 h后表達(dá)量呈現(xiàn)一定的上調(diào)趨勢(shì)，處理后期恢復(fù)正常表達(dá)水平(圖6，B)。不同的基因?qū)ν庠醇に鼐幸欢ǖ捻憫?yīng)，表明其參與了植物激素生長(zhǎng)素對(duì)獼猴桃果實(shí)發(fā)育的調(diào)控過(guò)程。本研究檢測(cè)的15個(gè)基因中，有13個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量在IAA處理不同時(shí)期呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明植物激素生長(zhǎng)素對(duì)其有負(fù)調(diào)控作用；同時(shí)，有2個(gè)基因受到生長(zhǎng)素的正向調(diào)控，因此，響應(yīng)模式的差異也說(shuō)明了Aux/IAA家族各個(gè)基因在調(diào)控獼猴桃發(fā)育過(guò)程中功能上的差異性。

3 討 論

Aux/IAA家族基因作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育各階段及逆境響應(yīng)過(guò)程[26-27]。本研究在獼猴桃基因組中鑒定出50個(gè)Aux/IAA基因，多數(shù)成員均含有Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ結(jié)構(gòu)域，部分基因缺失Ⅰ結(jié)構(gòu)域，基因進(jìn)化樹同一分枝基因結(jié)構(gòu)具有相似性，少量基因結(jié)構(gòu)存在特異性，推測(cè)可能在獼猴桃進(jìn)化過(guò)程中基因受到環(huán)境脅迫導(dǎo)致序列的缺失。

目前，Aux/IAA家族基因在很多物種中已被鑒定分離，前期研究表明，Aux/IAA家族基因在進(jìn)化過(guò)程中存在較多的基因復(fù)制事件，本研究鑒定的50個(gè)基因中存在基因復(fù)制對(duì)共23組，包括20對(duì)片段重復(fù)和3對(duì)串聯(lián)重復(fù)，基因擴(kuò)張可能是在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了全基因組復(fù)制使連鎖群加倍導(dǎo)致的[28]，而Aux/IAA 基因擴(kuò)張產(chǎn)生的功能冗余或多樣性可為獼猴桃適應(yīng)環(huán)境提供動(dòng)力。獼猴桃與擬南芥基因組間形成36組共線性關(guān)系，根據(jù)獼猴桃與擬南芥Aux/IAA 基因間同源關(guān)系將Aux/IAA家族基因分為9組，同源基因功能可能存在相似性。從啟動(dòng)子順式作用元件分析可知Aux/IAA家族基因含有大量激素響應(yīng)、脅迫應(yīng)答及生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控相關(guān)的元件。以上結(jié)果可為進(jìn)一步了解獼猴桃AcIAA基因的功能提供線索。

Aux/IAA家族基因在獼猴桃不同植物組織中的表達(dá)模式不同，表示該家族基因具有功能多樣性，存在基因復(fù)制現(xiàn)象的基因部分表現(xiàn)出組織表達(dá)模式相似性，推測(cè)在功能上可能有冗余，如AcIAA1b和AcIAA9b，AcIAA15a和AcIAA16a，AcIAA11a和AcIAA21a；AcIAA11c和AcIAA16d，AcIAA12b和AcIAA20b。選取15個(gè)AcIAA基因分析其在植物激素IAA處理后的響應(yīng)模式，15個(gè)基因均對(duì)外源激素處理作出應(yīng)答，但其響應(yīng)的時(shí)間和強(qiáng)度各有不同。其中，絕大多數(shù)基因均在激素處理的早期反應(yīng)強(qiáng)烈，而后漸恢復(fù)，說(shuō)明Aux/IAA家族基因中多數(shù)成員在響應(yīng)生長(zhǎng)素信號(hào)的早期發(fā)揮作用，且外源激素IAA對(duì)其有負(fù)向調(diào)控作用；被檢測(cè)基因中僅有兩個(gè)基因呈現(xiàn)一定上調(diào)表達(dá)，表明IAA對(duì)其有一定的正向調(diào)控作用，說(shuō)明Aux/IAA家族基因直接或間接地參與了生長(zhǎng)素調(diào)控獼猴桃生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程。

續(xù)表3 Continued Table 3

0h-C、1h-C、6h-C、12h-C與0h-I、1h-I、6h-I、12h-I分別為對(duì)照組與IAA處理組在0、1、6和12 h樣品；不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)圖6 外源激素IAA處理后AcIAA基因表達(dá)模式0h-C,1h-C,6h-C,12h-C and 0h-I,1h-I,6h-I,12h-I are control and IAA treatment samples at 0,1,6 and 12 hours;The different normal letters indicate significant differences at the 0.05 level (P<0.05)Fig.6 Expression patterns of AcIAA genes under exogenous hormones IAA treatment

近期有大量研究表明Aux/IAA家族基因在植物果實(shí)的發(fā)育，特別是果實(shí)早期發(fā)育過(guò)程中有重要調(diào)控作用。如在番茄中，SlIAA3抑制表達(dá)后引起包括頂端優(yōu)勢(shì)在內(nèi)的生長(zhǎng)素及乙烯相關(guān)表型的改變[29]，SlIAA9使番茄座果過(guò)程提前發(fā)生[21]，Sl-IAA27下調(diào)后影響果實(shí)大小[23]，Sl-IAA17則通過(guò)影響細(xì)胞的膨大過(guò)程使番茄果實(shí)增大[24]。獼猴桃Aux/IAA家族基因如何參與調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，是否存在功能冗余現(xiàn)象，在生長(zhǎng)素信號(hào)通路中的主要調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如何，如何對(duì)激素的調(diào)控作出響應(yīng)，均有待進(jìn)一步分析研究。