蛋白質(zhì)組學(xué)在結(jié)腸癌研究中的進(jìn)展

吳傲 綜述，張麗軍 審校

上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

結(jié)腸癌是在全球男性和女性中占據(jù)高發(fā)病率和死亡率地位的癌癥。在發(fā)達(dá)國(guó)家，由于早期檢測(cè)和更加有效的治療方式，結(jié)腸癌的死亡率顯著降低，但在全世界癌癥死亡率原因中，結(jié)腸癌仍排在第四位［1-4］。早期的診斷治療對(duì)結(jié)腸癌患者十分重要，有研究表明，2009— 2011 年，超過(guò)19 100 人因結(jié)腸癌死亡，其中大部分是由晚期遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的［5-6］。因此，尋找快速有效的診斷和治療方法十分必要。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)癌癥組織中的差異蛋白質(zhì)，研究其在癌癥中的功能及作用，從而用于癌癥的診斷和治療，已成為一種新的趨勢(shì)［7］。本課題組前期構(gòu)建了小鼠結(jié)腸癌模型，并通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）技術(shù)分析了小鼠結(jié)腸癌組織中的差異蛋白質(zhì)，本文對(duì)其中乳腺癌相關(guān)耐藥蛋白（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）和蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶A2（protein disulfide-isomerase A2，PDIA2）兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)及功能作一綜述。

1 差異蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)過(guò)程及方法

基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)的方法為目前使用較多的方法之一。對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞、結(jié)腸癌組織、臨床患者樣本（血漿、糞便）等相關(guān)樣本提取蛋白，通過(guò)高分辨率的質(zhì)譜串聯(lián)液相色譜儀，能夠識(shí)別出較多差異蛋白質(zhì)，從中挑選出與結(jié)腸癌相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，并進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證，是目前尋找分子標(biāo)志物的主要流程（圖1，以結(jié)腸癌細(xì)胞為例［8］）。

圖1 結(jié)腸癌樣本篩選差異蛋白質(zhì)分析流程圖Fig.1 Flow chart of analyzing and screening of differential proteins in colon cancer samples

提取結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移株SW620 細(xì)胞全細(xì)胞蛋白，對(duì)轉(zhuǎn)移株和原始細(xì)胞株之間的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行比較。在GHOSH 等［8］的研究中，共發(fā)現(xiàn)1 140 種特殊蛋白，其中轉(zhuǎn)移株中有147種蛋白質(zhì)相對(duì)原始株出現(xiàn)明顯變化，有6 個(gè)差異蛋白質(zhì)通過(guò)免疫印跡方法確證。對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能學(xué)分析，以作為結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志。同時(shí)，也對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的分泌蛋白進(jìn)行了分析，從而達(dá)到區(qū)分不同細(xì)胞株差異蛋白質(zhì)的目的。XUE等［9］對(duì)SW480和SW620細(xì)胞培養(yǎng)物上清進(jìn)行酶解分析后，采用LC-MS 技術(shù)，共測(cè)出910 種蛋白質(zhì)，其中145 種為差異蛋白質(zhì)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)三葉因子和生長(zhǎng)分化因子15 在SW620 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，對(duì)臨床樣本進(jìn)行免疫組化分析顯示，三葉因子與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

在 APCmin／+鼠結(jié)腸癌模型中，ZHU 等［10］發(fā)現(xiàn)有27 種蛋白表達(dá)上調(diào)，但有25 種蛋白表達(dá)下調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn)1個(gè)包含45種結(jié)腸癌中上調(diào)基因的共表達(dá)網(wǎng)，該共表達(dá)網(wǎng)與自身免疫和炎癥有關(guān)，為結(jié)腸癌的進(jìn)展提供了新的視角。RANGIAH 等［11］運(yùn)用同位素標(biāo)記的方法對(duì)鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞系分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行比較研究，分別發(fā)現(xiàn)了614 和929 種蛋白，其中418種蛋白是兩個(gè)細(xì)胞系共有的。同時(shí)用APCmin／+鼠結(jié)腸癌模型和正常老鼠血漿進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，僅有抑制蛋白1 和熱休克蛋白8 在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)是升高的，而在血漿中則是降低的，可以作為結(jié)腸癌在體內(nèi)作用機(jī)理的一個(gè)新方向。

同樣在臨床患者組織樣本中，通過(guò)兩種不同的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，KIM 等［12］發(fā)現(xiàn)了 175 個(gè)2 倍差異以上的蛋白質(zhì)，基因分析發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞聚集及活動(dòng)有關(guān)的蛋白質(zhì)在預(yù)后差的患者中大幅增加，并且后續(xù)也通過(guò)免疫印跡試驗(yàn)及免疫組化對(duì)其中22 種蛋白質(zhì)進(jìn)行了確證，該發(fā)現(xiàn)為臨床個(gè)體化治療提供了準(zhǔn)確可靠的信息以及潛在的幫助；BESSON 等［13］通過(guò)同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)標(biāo)記結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption／ionization time off-lightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS）的方法，分析 28 例結(jié)腸癌患者組織以及鄰近正常組織，分別對(duì)不同分期的患者組織中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)555 種在結(jié)腸癌中有明顯上調(diào)或者下調(diào)的蛋白。在分泌蛋白中，嗅質(zhì)蛋白4（olfactomedin 4，OLFM4）在結(jié)腸癌病理Ⅰ期中明顯上調(diào)，在結(jié)腸癌病理Ⅱ期中幾乎達(dá)到最高含量（與正常組織相比），表明OLFM4 可能與參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化初始步驟的致癌基因相關(guān)。并且有文獻(xiàn)指出，OLFM4在與富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5（leucinerich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5，Lgr5）關(guān)聯(lián)的結(jié)腸癌干細(xì)胞中有表達(dá)［14-15］，而Lgr5與腫瘤的惡性程度直接相關(guān)，這也進(jìn)一步證明了OLFM4與結(jié)腸癌腫瘤的分期相關(guān)，或許可將OLFM4 作為結(jié)腸癌腫瘤分期的早期標(biāo)志物。

有關(guān)結(jié)腸癌患者腹水中分泌的微泡（外泌體）目前研究較少。CHOI等［16］進(jìn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)研究鑒定出846種外泌體蛋白，其中384種至少在兩個(gè)患者腹水中鑒定出來(lái)，這些蛋白可能通過(guò)遷移、侵襲、免疫調(diào)節(jié)等影響腫瘤的進(jìn)展，為研究微泡在腫瘤進(jìn)展中的作用提供了幫助，也為結(jié)腸癌診斷提供了新的思路。

血漿是比較常用的用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的樣本。ZHANG 等［17］應(yīng)用 iTRAQ 標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)了10個(gè)結(jié)腸癌患者和正常人血漿中的蛋白，在結(jié)腸癌患者組發(fā)現(xiàn)9個(gè)上調(diào)蛋白和4個(gè)下調(diào)蛋白，為結(jié)腸癌診斷提供了潛在的生物標(biāo)志物。

雖然糞便隱血試驗(yàn)是結(jié)腸癌篩查的首選方法，但其靈敏度和特異性均較低。近年來(lái)，有研究者運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜儀-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（liquid chromatographmass spectrometer-multiple reaction monitoring，LC-MSMRM）技術(shù)分析糞便中的蛋白質(zhì)，取得了很好的成果。ANG等［18］從結(jié)腸癌患者糞便中發(fā)現(xiàn)了19 種蛋白，在結(jié)腸癌患者和健康人中進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，血紅蛋白、過(guò)氧化物酶、絲束蛋白、細(xì)絲蛋白以及S100A9 僅在結(jié)腸癌患者中表達(dá)，可以作為診斷的參考。

2 ABCG2在結(jié)腸癌中的表達(dá)及功能

2.1 ABCG2 在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況 ABCG2 是三磷酸腺苷結(jié)合蛋白中的一個(gè)亞族成員。對(duì)正常人各種組織的冰凍切片進(jìn)行免疫組化分析以及對(duì)ABCG2的蛋白質(zhì)和RNA 含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ABCG2在正常組織如胰腺、肝臟、結(jié)腸、乳腺等中均有一定表達(dá)［19-20］；在骨髓瘤患者的漿細(xì)胞中，ABCG2 的表達(dá)與正常漿細(xì)胞中的表達(dá)基本一致［21］；對(duì)72 例非小細(xì)胞肺癌患者用福爾馬林固定的組織樣本進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，有46%的患者組織樣本中有ABCG2 表達(dá)［22］；同樣在淋巴癌［23］及結(jié)腸癌［24］中均有ABCG2 表達(dá)。ABCG2 在十二指腸、小腸、結(jié)腸、直腸、精囊、子宮內(nèi)膜、闌尾中高度表達(dá)，在腎臟、睪丸、胎盤中中度表達(dá)，而在甲狀腺、腎上腺、肺、等組織中低表達(dá)（https：／／www.proteinatlas.org）。ABCG2 在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況始終不明確［25］，在所有關(guān)于ABCG2 的研究中，約1／2 認(rèn)為ABCG2 在結(jié)腸癌中表達(dá)是上調(diào)的，約1／2認(rèn)為表達(dá)是下調(diào)的。

GUPTA等［26］對(duì)154個(gè)癌癥患者的組織樣本RNA進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)ABCG2 在結(jié)腸癌組織中的含量與正常組織中的含量相比，低了6 倍，推測(cè)這種降低可能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。同樣在DIETRICH等［27］的研究中，通過(guò)分析21 位結(jié)腸癌腫瘤患者組織標(biāo)本及4 只ApcMin 鼠腫瘤樣本中的蛋白質(zhì)含量及RNA含量，也發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，ABCG2含量明顯低于健康組織［患者樣本：（28 ± 35）%，鼠樣本：（58 ±34）%］。

然而，在 CANDEIL 等［28］的研究中，ABCG2 在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中高表達(dá)，同樣，在Caco-2細(xì)胞中，ABCG2 的表達(dá)增加了 5.2 倍［29］。SILVESTRIS 等［30］通過(guò)免疫組化方法發(fā)現(xiàn)在58 位結(jié)腸癌患者中，56%患者高表達(dá)ABCG2，且在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)均有較強(qiáng)染色，與臨床病理特性密切相關(guān)，但ABCG2 并不影響這些患者的治療效果。

2.2 ABCG2的主要功能及定位分析 通過(guò)uniprotkb網(wǎng)站查詢，ABCG2 與腫瘤細(xì)胞耐藥密切相關(guān)，同樣與細(xì)胞中藥物及外源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。NAKAYAMA 等［31］的研究表明，ABCG2 在許多器官的頂膜上均有一定表達(dá)，如腎臟、腸道、肝臟等；ABCG2是尿酸鹽的高容量轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在人體尿酸鹽生理平衡中起重要作用，且基因損傷會(huì)增加人血清中尿酸水平，引起痛風(fēng)等癥狀。ZHANG 等［32］通過(guò)表達(dá)序列標(biāo)簽發(fā)現(xiàn)，在人類腦cDNA 庫(kù)中，ABCG 家族有大量表達(dá)，尤其ABCG2 表達(dá)更多，這一現(xiàn)象在人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)和RNA 水平，得到進(jìn)一步驗(yàn)證；并且在4 例人大腦細(xì)胞中，通過(guò)免疫組化方法，也同樣得到驗(yàn)證。同時(shí)，通過(guò)構(gòu)建小鼠細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)ABCG2 參與了將藥物導(dǎo)出血腦屏障的過(guò)程。DESUZINGES-MANDON 等［33］的研究顯示，一種經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的熒光素亞鐵血紅素類似物鋅卟啉是由ABCG2 轉(zhuǎn)運(yùn)的，同樣 ABCG2 的細(xì)胞外基質(zhì) 3（extracellular loop3，ECL3）包含了1 個(gè)卟啉域，與亞鐵血紅素、氯高鐵血紅素均有相互作用，能夠?qū)⑦@些物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)給血清白蛋白。

關(guān)于ABCG2 定位的研究較多，有研究指出，野生型ABCG2在細(xì)胞表面，即細(xì)胞質(zhì)膜中有表達(dá)［34-35］，同樣的結(jié)果在DIOP 等［36］的研究中也有報(bào)道。但在KOBUCHI等［37］的報(bào)道中指出，ABCG2不僅在質(zhì)膜上有表達(dá)，在細(xì)胞器上也有表達(dá)，如在線粒體上，作為一種功能轉(zhuǎn)運(yùn)體，通過(guò)將原卟啉Ⅸ從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞液中來(lái)調(diào)節(jié)原卟啉Ⅸ的水平

3 ABCG2 在結(jié)腸癌中的表達(dá)與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及其治療

SILVESTRIS 等［30］分析了 58 例患者結(jié)腸癌組織樣本中ABCG2 的含量，與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性；SPEIGL 等［38］的研究表明，ABCG2 含量與腫瘤分期呈正相關(guān)，即腫瘤分期第Ⅳ期的ABCG2 含量明顯高于第Ⅲ期；且ABCG2 與轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的生存有一定關(guān)聯(lián)。

PALSHOF 等［39］的研究表明，ABCG2可將抗腫瘤藥物的生物活性成分從結(jié)腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)出來(lái)，從而使癌細(xì)胞對(duì)腫瘤藥物不敏感。雖然研究并未驗(yàn)證低表達(dá)ABCG2 的患者對(duì)腫瘤藥物治療效果更好，但發(fā)現(xiàn)低表達(dá)ABCG2的腫瘤患者的總生存率增加。

4 PDIA2蛋白在結(jié)腸癌中功能的研究

4.1 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide-isomerase，PDI）家族介紹 PDI家族是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的酶［40］，能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中催化新合成蛋白質(zhì)二硫鍵的產(chǎn)生、斷裂和異構(gòu)化，可作為分子伴侶，也可作為同一亞細(xì)胞單位正確折疊蛋白的質(zhì)量控制系統(tǒng)。有關(guān)哺乳動(dòng)物的PDI家族成員見(jiàn)表1。

表1 哺乳動(dòng)物PDI家族成員Tab.1 Family members of mammalian PDI

有關(guān)PDI 的結(jié)構(gòu)，在不少文獻(xiàn)中均有報(bào)道［41-42］。FREEDMAN等［43］的研究中有詳細(xì)介紹。其中，圖2A為從同源序列中推導(dǎo)出的人PDI 家族的總框架。S 形狀代表信號(hào)序列在生物合成中是斷開(kāi)的且并構(gòu)成成熟蛋白；每個(gè)有顏色標(biāo)記的板塊（a、b、b′、a′）均代表成熟蛋白的1個(gè)區(qū)域，a和a′代表催化區(qū)域，b和b′代表非催化區(qū)域。圖2B為成倍的硫氧還蛋白的PDI的三級(jí)結(jié)構(gòu)。人PDIa由核磁共振測(cè)定，人PDIb由核磁共振和原型測(cè)定，大腸埃希菌硫氧還蛋白由X射線測(cè)定。

圖2 PDI的基本結(jié)構(gòu)Fig.2 Basic structure of PDI

PDI 主要有以下兩部分功能［44］：①催化功能。PDI的氧化還原性能取決于CXXC 活性位點(diǎn)，當(dāng)處于氧化狀態(tài)時(shí)，二硫化物能夠通過(guò)自身活性位點(diǎn)的減少來(lái)催化氧化；當(dāng)處于還原狀態(tài)時(shí)，基質(zhì)二硫化物會(huì)減少，并且活性位點(diǎn)會(huì)處于氧化狀態(tài)。②氧化還原調(diào)節(jié)。三肽的谷胱甘肽構(gòu)成了主要的細(xì)胞氧化還原緩沖體系，中間有1 個(gè)半胱氨酸，使其能夠以還原和氧化的形式存在。

4.2 PDIA2 的介紹及組織中的表達(dá)情況 PDIA2 是蛋白質(zhì)PDI 家族的一員，主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中起作用［45］。PDIA2 是唯一能夠催化異構(gòu)酶反應(yīng)的伴侶家族，與含半胱氨酸的蛋白質(zhì)相互作用，并涉及哺乳動(dòng)物線粒體蛋白質(zhì)翻譯后移位［46］。沉默PDIA2 后，會(huì)降低血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力［47］。

PDIA2在人正常胰腺（腺泡細(xì)胞）中表達(dá)最高［48］，同時(shí)，在鼠其他器官中，也有一定的表達(dá)，包括胃（胃主細(xì)胞）、盲腸、回腸（潘氏細(xì)胞）、附睪以及前列腺等［49］。盡管在人正常胰腺中有大量PDIA2表達(dá)，但在胰腺癌和胰腺癌細(xì)胞系中，PDIA2幾乎不表達(dá)。PDIA2在人正常組織中幾乎僅胰腺中有表達(dá)（https：／／www.proteinatlas.org）。

4.3 PDIA2 的功能及定位 PDIA2 主要定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上（uniprotkb 網(wǎng)站）。作為細(xì)胞內(nèi)雌激素結(jié)合蛋白質(zhì)，可能涉及在胰腺中調(diào)節(jié)雌激素的細(xì)胞水平和生物學(xué)功能，在FU 等［50］的研究中很好地證明了這一點(diǎn)，即PDIA2 可作為一種高容量細(xì)胞內(nèi)雌二醇結(jié)合蛋白，并且能夠調(diào)控培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及人類胰腺組織中雌二醇的濃度水平；可作為一種伴侶蛋白，抑制錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的聚集，同時(shí)具有異構(gòu)酶和伴侶功能，并且在體外能夠與新合成的多肽進(jìn)行作用，是一種受氧化還原劑調(diào)控的分子伴侶。XU 等［51］指出，PDI 對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的生存、增殖具有重要作用。WALKER 等［52］在有關(guān) PDIA2 的研究中提出，PDIA2在抗原呈遞方面也具有重要作用，參與自身免疫疾病的呈遞。

5 差異蛋白質(zhì)在結(jié)腸癌中的應(yīng)用與展望

差異蛋白質(zhì)不僅作為一種輔助診斷結(jié)腸癌的手段，在作為結(jié)腸癌治療靶點(diǎn)上同樣具有很好的前景。HOUDT 等［53］的研究表明，桿狀病毒凋亡抑制重復(fù)含體6（baculoviral inhibitors of apoptosis repeat-containing 6，BIRC6）是一種凋亡蛋白，其會(huì)干擾奧沙利鉑（抗腫瘤藥物）對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抵抗力，從而使腫瘤干細(xì)胞不被藥物殺死。反向推測(cè)，如果抑制BIRC6 的表達(dá)，有可能從根本上抑制結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到治療結(jié)腸癌的目的。但臨床樣本具有復(fù)雜性多樣性，對(duì)于結(jié)腸癌中差異蛋白質(zhì)的功能研究，未來(lái)尚需加大力度，使其更廣泛地應(yīng)用于臨床，以期能達(dá)到治療和診斷的目的。