秋水仙素及切根處理對糯玉米單倍體加倍速率的影響

◎郭原菲 榮美琪 于海燕 李劍明 姜 龍

目前，我國是最大的鮮食玉米生產(chǎn)國，種植面積已超過134萬hm2，其中糯玉米的種植面積約萬80hm2。糯玉米具有綿軟適口、甜粘清香的獨特口感和風味，不僅可蒸煮，鮮果穗用于青食，還可用于速凍加工、制作糯玉米罐頭等，其鮮穗采摘后的秸稈也是優(yōu)良的青貯飼料，具有一定的附加經(jīng)濟效益[1]。糯玉米產(chǎn)業(yè)巨大的發(fā)展?jié)摿ぐl(fā)了優(yōu)質(zhì)糯玉米新品種的育種高潮，而在目前最熱點的品種選育方法中最受認可的無疑是單倍體育種[2-3]。但其加倍效率依然是工程化應(yīng)用的“瓶頸”，大多育種材料自然加倍率僅為0-10%[4-6]。

前人研究表明，玉米單倍體加倍的方法主要有浸種法、浸根法、切芽法等，不同方法加倍產(chǎn)出效率不同[7-9]。本研究針對切根法探討了不同時間和不同濃度的秋水仙素處理方式，以及切根與否對玉米單倍體加倍的效果影響，以期為糯玉米單倍體育種提供理論經(jīng)驗，提高糯玉米品種質(zhì)量。

一、材料與方法

（一）試驗材料

父本為誘導系吉科誘1200，母本為糯玉米雜交種吉科糯25，供試材料均由吉林農(nóng)業(yè)科技學院玉米育種課題組提供?；瘜W藥劑選用秋水仙素和二甲基亞砜（DMSO）。

（二）試驗方法

1.單倍體誘導及籽粒鑒定。以吉科誘1200為父本，對吉科糯25進行雜交誘導，在收獲的種子中選出單倍體。根據(jù)R1-nj花青素標記法，在后代中挑選籽粒紫頂無色胚籽粒的為單倍體籽粒[10]。

2.單倍體加倍實驗。在25℃左右的濕沙中將篩選后的單倍體籽粒進行無光培養(yǎng)。而后分別對3-7mm、8-18mm、19-28mm以及29mm以上的根進行幼苗的根尖分生區(qū)部位縱切，準備好2.5%二甲基亞砜溶液以及0.05%秋水仙素，把處理的切根幼苗切口向下浸入到準備好的溶液中浸泡38h，設(shè)置對照組，重復3次實驗。

浸泡時間不相同的處理步驟時需對篩選好的3-7mm單倍體籽粒的根尖分生區(qū)進行縱切，切口需向下浸入到藥劑中，浸泡12h、22h、32h、42h、52h及62h，設(shè)置對照組。將其放在22-25℃左右暗箱中進行無光培養(yǎng)。把單倍體幼芽經(jīng)過浸泡處理后用流水沖洗3.5h后需移栽到溫室進行培養(yǎng)，等幼苗長到2-3葉時移植到玉米育種基地，進行田間管理及試驗調(diào)查。

（三）數(shù)據(jù)記錄與整理

記錄溫室內(nèi)培養(yǎng)4天后的單倍體幼苗的生長情況，包括畸形苗；于大田生長10天左右調(diào)查死亡數(shù)；于散粉期調(diào)查散粉情況，記錄散粉株；人工授粉后統(tǒng)計單倍體植株。

（四）數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

畸形率、致死率、散粉率和結(jié)實率計算方法按陶蕊等[11]的方法計算。利用軟件Excel2017對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

二、結(jié)果與分析

（一）切根處理對糯玉米單倍體加倍的影響

由表1可知，切根處理后的平均散粉率、平均致死率和平均結(jié)實率均有上升，幅度在1.46-9.45%，而畸形率下降了0.87%。不切根的散粉率、結(jié)實率、畸形率和致死率與切根后對單倍體加倍的效率差異幅度是不能忽視的，進一步的方差分析將得出結(jié)論。

表1 切根處理對糯玉米單倍體加倍效率的影響

從表2的方差分析結(jié)果可以看出，切根處理對糯玉米單倍體加倍效果的影響很大，對結(jié)實率和散粉率間的差異呈極顯著水平，且對畸形率和致死率的影響極小，說明對糯玉米單倍體進行切根處理并輔以秋水仙素切根浸泡法能有效提高散粉率和結(jié)實率，保證單倍體加倍的效率。

表2 切根浸泡與不切根浸泡對糯玉米單倍體加倍的方差分析

（二）不同根長對單倍體加倍的處理效果

表3的多重比較分析顯示，3-7mm根長的單倍體其畸形率、致死率、散粉率以及結(jié)實率的均值都是最高的，隨著根長的增加而逐漸降低；對畸形率和致死率來說，根長大于29mm的處理存在最小值15.79%和18.93%，根長8-18mm和19-28mm的處理間差異并不顯著，而與根長大于29mm的存在顯著差異；散粉率和結(jié)實率在根長3-7mm的處理存在最大值59.31%、10.1%，并且與根長在8-18mm和19-28mm的處理間差異并不顯著，但與根長大于29mm的處理存在顯著差異。

表3 不同根長處理對單倍體加倍效率顯著性分析

（三）不同處理時間對單倍體加倍的影響

如圖1所示，藥劑浸泡對單倍體加倍速率有影響，且呈一定趨勢性變化。散粉率和結(jié)實率隨浸泡時間的增長呈先升后降趨勢，均在處理42h達到最高值，數(shù)值分別是58.14%和14.11%，后變化較為平緩；致死率隨浸泡時間的增長在逐漸上升，62h達到最高值30.17%；畸形率隨浸泡時間增長呈先下降后上升趨勢，在42h達到最低值10.62%。

圖1 不同處理時間對單倍體加倍效率的影響

三、討論與結(jié)論

本研究以誘導系吉科誘1200為父本，以糯玉米吉科糯25為母本進行雜交誘導，對單倍體籽粒進行加倍試驗，分別研究了切根處理及秋水仙素藥劑浸泡對單倍體畸形率、致死率、結(jié)實率和散粉率的影響。切根處理與否的條件下，切根處理的單倍體除畸形率下降外，其他均有上升，說明切根處理在更大程度上對植株的品性有積極的影響。鄧昆鵬[12]的研究中解釋到這是因為切根處理暴露出有絲分裂細胞，接觸秋水仙素從而抑制同源染色體的分離。而且，切根處理后的單倍體對結(jié)實率和散粉率間的差異呈極顯著水平，說明利用秋水仙素處理切根的單倍體在加倍效率上優(yōu)于普通浸種，這一結(jié)論與祁志云和劉俊的實驗結(jié)論一致[13-14]。

在探究不同根長的處理中，設(shè)置了根長在3-7mm、8-18mm、19-28mm以及大于29mm等4組變量處理，結(jié)果表明畸形率、致死率、結(jié)實率和散粉率在根長達3-7mm時有最大值，且與根長的增加呈負相關(guān)，結(jié)實率和散粉率在3-7mm根長的處理下得到的數(shù)值與在8-18mm和19-28mm處理時差異并不顯著，表明在根長4-8mm處理下對單倍體進行藥劑浸泡能達到好的結(jié)果。

在秋水仙素浸泡的處理下，變量是處理時間時，設(shè)置了12h、22h、32h、42h、52h、62h以及對照組不浸泡等7組處理，結(jié)果表明散粉率和結(jié)實率均在42h達到最大值為58.14%和14.11%，而畸形率在42h達到最低，但并不是絕對的，處理時要把握藥劑濃度和處理時間，以防對幼苗產(chǎn)生致死性傷害[15]。