蒲公英、金銀花水提劑及顆粒劑對4種致病菌的抑菌作用

谷曉雨，李會，張佩，劉軒嘉，李博文，劉超怡

蒲公英為菊科植物，又名婆婆丁、黃花地丁及黃花三七等，其化學(xué)成分主要有黃酮類、植物甾醇類、香豆素類、倍半萜類及揮發(fā)油類等[1]。蒲公英苦甘寒，歸肝胃二經(jīng)，具有清熱解毒、散結(jié)及利尿活血等功效[2]。多篇研究報道蒲公英對細(xì)菌、真菌及病毒有不同程度的抑菌作用[3-5]。金銀花自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥，其性味甘寒而不傷胃，芳香透達(dá)又可祛邪，既可宣風(fēng)散熱，還可清熱解毒，用于治療身熱、發(fā)疹、發(fā)斑及咽喉腫痛等各種熱性病[6]。多篇報道顯示金銀花具有廣譜抗菌作用。蒲公英和金銀花為廣泛使用的中藥，其水提劑與顆粒劑的抑菌效果差異尚不明確。本實驗旨在比較蒲公英、金銀花水提劑與顆粒劑的抑菌效果，觀察兩者聯(lián)用的抑菌效果，為藥物使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗藥品：蒲公英全草、蒲公英根、金銀花均購自河南省張仲景大藥房股份有限公司。蒲公英顆粒劑由江西和明藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z36021952，規(guī)格：每袋裝10 g，相當(dāng)于6.5 g飲片；金銀花由江西和明藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z20063606，規(guī)格：每袋裝10 g，相當(dāng)于3.5 g飲片。(2)實驗菌株：標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌 ATCC25922、白色念珠菌ATCC10231、蠟樣芽孢桿菌ATCC14579均購于中國醫(yī)學(xué)菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌ATCC29213購于中國藥品生物制品檢定所。(3)實驗試劑：M-H(A) 瓊脂、M-H(B)肉湯購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；0.9%NaCl注射液購自山東齊都藥業(yè)有限公司。(4)實驗儀器及耗材：SW-CJ-1FD超凈臺，購自上海錦昱科學(xué)儀器有限公司；SC-329CA海爾冰箱；BGZ-246干燥箱、BXM-30R立式高壓滅菌器，購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DRAGON移液槍；DHP-9162數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；GH-500BC隔水保溫箱，購自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；FA2004N分析天平，購自上海箐海儀器有限公司；H·SWX-600BS恒溫水浴箱，購自上海圣科儀器設(shè)備有限公司；YRE-2010Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自鞏義市予華儀器設(shè)備有限公司；TYZD-1微量振蕩器，購自上海左樂儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備：(1)不同濃度中藥水提劑的制備：稱取蒲公英根、蒲公英全草、金銀花各75 g、100 g、150 g，分別置于砂鍋中加入適量蒸餾水浸泡30 min，大火煮沸后改用文火煎煮1 h，趁熱用無菌紗布將其過濾至燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮后放涼至室溫，用50 ml容量瓶定容后，分別得到濃度為150%、200%、300%的中藥煎劑溶液，將其放置于無菌小玻璃瓶中，高壓滅菌后，即得1.5 g/ml、2 g/ml、3 g/ml的蒲公英根、蒲公英全草、金銀花的水提劑，冷卻后4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?2)不同濃度中藥顆粒劑的制備：按照商品化蒲公英、金銀花顆粒劑中藥物含量說明，分別稱取相當(dāng)于原中藥飲片75 g、100 g、150 g的蒲公英、金銀花顆粒劑，將其分別放置于燒杯中加入蒸餾水溶解，用50 ml容量瓶定容后放置于無菌小輸液瓶中，分別得到濃度為150%、200%、300%的中藥顆粒水溶液，高壓滅菌后，即得1.5 g/ml、2 g/ml、3 g/ml的蒲公英顆粒劑、金銀花顆粒劑的水溶液，冷卻后4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液制備：冷凍保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及蠟樣芽孢桿菌無菌操作，劃線接種于M-H(A)平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h。取單菌落接種至 M-H(B)肉湯，37 ℃ 震蕩培養(yǎng)24 h，校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)?，用生理鹽水稀釋成1.5×105CFU/ml的菌懸液備用。

1.2.3 藥物敏感試驗：采用瓊脂打孔法對上述藥物進(jìn)行藥敏試驗。(1)接種：用移液槍分別取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及白色念珠菌的稀釋菌懸液100 μl置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再向培養(yǎng)皿中加入冷卻至55 ℃的 M-H(A)培養(yǎng)基25 ml，混合均勻冷卻后即得相應(yīng)的帶菌平板。用無菌棉簽蘸取蠟樣芽孢桿菌菌懸液均勻涂布M-H (A)培養(yǎng)基上。(2)加藥：用打孔器在平板均等位置上打4個孔，3個孔用于加入不同稀釋度的藥物100 μl，第4孔加入生理鹽水100 μl做陰性對照。(3)孵育觀察：所有平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育16～18 h，游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。每個實驗重復(fù)3次取平均值。抑菌結(jié)果觀察指標(biāo)：抑菌圈直徑>20 mm為高度敏感，11～20 mm為中度敏感，7～10 mm為低度敏感[7]。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)測定：采用微量稀釋法檢測蒲公英全草、金銀花顆粒劑和水提劑的MIC。在96孔板橫向1-11小孔內(nèi)各加入M-H(B)肉湯100 μl，縱向1號孔內(nèi)分別加入1.5 g/ml的蒲公英全草顆粒劑100 μl、蒲公英全草水提劑100 μl、金銀花顆粒劑100 μl、金銀花水提劑100 μl；分別將藥物對倍稀釋至9號孔，則1-9號孔的藥液濃度分別為750 mg/ml、375 mg/ml、187.50 mg/ml、93.75 mg/ml、46.88 mg/ml、23.44 mg/ml、11.72 mg/ml、5.86 mg/ml、2.93 mg/ml；用移液槍取1.5×105CFU/ml的菌懸液100 μl分別加入1-10號孔內(nèi)，則10號孔為無藥物只有菌液的陽性對照，11號孔為只有空白肉湯的陰性對照，12號孔為只加藥液100 μl的陰性對照。每種藥物做3個重復(fù)，接種完成后，微量振蕩器上振蕩1 min使其混勻，置37 ℃培養(yǎng)16～20 h。孔內(nèi)清晰不出現(xiàn)細(xì)菌生長的最低藥物濃度即為該抗菌藥物對該檢測菌的MIC。

1.2.5 聯(lián)合抑菌試驗：采用微量棋盤法測定聯(lián)合抑菌效果，在無菌96孔板中加入A藥、B藥，橫向孔分別加入50 μl 1/8 MIC到8 MIC的A藥，縱向孔分別加入50 μl 1/8 MIC到8 MIC的B藥，各個孔加入0.5麥?zhǔn)系拇郎y菌液100 μl，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，孔內(nèi)清晰不出現(xiàn)細(xì)菌生長的最低藥物濃度即為聯(lián)合抗菌藥物對該檢測菌的MIC。聯(lián)合抑菌結(jié)果判斷依據(jù)：分級抑菌濃度(FIC)指數(shù)=(A藥聯(lián)合的MIC/A藥單側(cè)MIC)+(B藥聯(lián)合的MIC/B藥單側(cè)MIC)，F(xiàn)IC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用，>0.5～1(包括=1)為相加作用，>1～2為無關(guān)作用，>2為拮抗作用。

2 結(jié) 果

2.1 蒲公英、金銀花水提劑及顆粒劑對4種致病菌的抑菌作用 蒲公英全草對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌及蠟樣芽孢桿菌均有一定的抑菌作用，且隨著藥物濃度的增加，抑菌效果增強(qiáng)；其中金黃色葡萄球菌對所有濃度的蒲公英水提劑及顆粒劑均為中度敏感(抑菌圈直徑11～20 mm)，大腸桿菌、白色念珠菌、蠟樣芽孢桿菌對蒲公英水提劑及顆粒劑均為低度敏感(抑菌圈直徑7～10 mm)。金銀花對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有一定的抑菌作用，且隨著藥物濃度增加，抑菌效果也逐漸增強(qiáng)，其中金黃色葡萄球菌對所有濃度的金銀花水提劑及顆粒劑均為中度敏感(抑菌圈直徑11～20 mm)，大腸桿菌對所有濃度的金銀花水提劑及顆粒劑均低度敏感(抑菌圈直徑7～10 mm)；金銀花對白色念珠球菌、大腸桿菌無抑菌作用。比較兩種劑型的抑菌結(jié)果顯示，蒲公英全草顆粒劑和金銀花顆粒劑的抑菌作用均優(yōu)于水提劑(P<0.05)，見表1。

表1 中藥顆粒劑和水提劑對四種致病菌的抑菌作用

2.2 蒲公英、金銀花水提劑及顆粒劑對4種常見致病菌的MIC值 蒲公英顆粒劑對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的MIC為46.88 mg/ml，對大腸桿菌、白色念珠菌的MIC為23.44 mg/ml；蒲公英全草水提劑對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的MIC為93.75 mg/ml，對大腸桿菌、白色念珠菌的MIC為46.88 mg/ml。金銀花顆粒劑對金黃色葡萄球菌的MIC為46.88 mg/ml，對大腸桿菌的MIC為93.75 mg/ml；金銀花水提劑對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC為93.75 mg/ml，金銀花對白色念珠菌和蠟樣芽孢桿菌無抑菌作用，見表2。

表2 蒲公英、金銀花水提劑及顆粒劑對4種常見致病菌的MIC值

2.3 蒲公英、金銀花水提劑及顆粒劑聯(lián)合應(yīng)用的作用效果 蒲公英顆粒劑和金銀花顆粒劑聯(lián)用對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌呈現(xiàn)相加作用，見表3。蒲公英水提劑和金銀花水提劑聯(lián)用對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑菌呈現(xiàn)相加作用，見表4。

表3 蒲公英、金銀花顆粒劑聯(lián)用對2種致病菌的抑菌作用

表4 蒲公英、金銀花水提劑聯(lián)用對2種致病菌的抑菌作用

3 討 論

抗生素在臨床治療中應(yīng)用廣泛，但其導(dǎo)致的不良反應(yīng)、耐藥性等問題日益凸顯。在疾病治療過程中耐藥菌的產(chǎn)生與日俱增，增加了疾病治療的難度。中藥在臨床使用過程中以其安全有效、較少出現(xiàn)耐藥等優(yōu)點受到廣泛的關(guān)注。

蒲公英、金銀花含有多種藥用活性成分，具有不同程度的抑菌作用。本實驗表明，蒲公英的抑菌作用效果優(yōu)于金銀花，兩者聯(lián)用抑菌效果增強(qiáng)；比較兩種中藥的顆粒劑與水提劑對常見致病菌抑菌效果，結(jié)果顯示，顆粒劑抑菌效果較好，與李健[8]的結(jié)果存在一定的差異，可能是因為中藥水提劑制作繁雜且無統(tǒng)一煎煮標(biāo)準(zhǔn)，可能產(chǎn)生質(zhì)量差異，市面上的中藥飲片出廠家不同、制作方法不同導(dǎo)致作用效果的差異[9]；在實驗過程中不排除誤差的影響，本實驗采取的是打孔法測定抑菌作用，藥物可能通過小孔外滲進(jìn)而影響實驗結(jié)果。

本實驗為體外抑菌實驗,雖可證明蒲公英、金銀花兩種中藥具有抑菌作用,但其臨床應(yīng)用效果還需進(jìn)一步進(jìn)行驗證。只有進(jìn)一步的進(jìn)行探討和比較，才能為臨床用藥提供有力的依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。