25%吡唑醚菌酯懸浮劑在7種蔬菜中的消解動態(tài)

張昕淳，李榮玉，湛興瑜，孫明明，姚小龍，李 明，廖 遜

(1.貴州大學 作物保護研究所，貴州 貴陽 550025；2.貴州省山地農業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 農學院，貴州 貴陽 550025)

吡唑醚菌酯別名唑菌胺脂，屬于具吡唑結構的甲氧基丙稀酸脂類殺菌劑[1]，具有保護作用、治療作用、內吸傳導性和耐雨水沖刷性能；持效期較長，應用范圍較廣[2]；通過阻止細胞色素間的電子傳遞而抑制線粒體呼吸作用導致細胞死亡。其由德國巴斯夫公司于1993年開發(fā)，被廣泛用于防治谷物、蔬菜、水果、藥用植物等由子囊菌、擔子菌、半知菌和卵菌等真菌病原體引起的各種病害[3]，如玉米大斑病[4]、小麥白粉病[5]、番茄頸腐病[6]、大白菜黑斑病[7]、黃瓜蔓枯病[8]、蘋果炭疽病[9]、楊梅褐斑病[10]、草莓白粉病[11]等。

吡唑醚菌酯在我國主要登記作物有水稻、大豆、番茄、楊梅等40余種[12]，其殘留情況受到密切關注。目前，針對探究吡唑醚菌酯在作物中的最大殘留限量、殘留半衰期、消解動態(tài)、在作物上的最終殘留限量等的研究較多，但在蔬菜中的研究較少。為評估吡唑醚菌酯在不同類型作物中的殘留，國內外學者建立了其在不同作物上的殘留檢測方法及消解動態(tài)試驗[13-20]。如采用高效液相色譜法測定出吡唑醚菌酯在湖南、河北兩地白菜中的半衰期分別為2.97 d和3.34 d，且一次施藥7 d后符合安全要求[21]；噴施吡唑醚菌酯4 d后檢測出在花生殼與花生仁中的殘留量低于檢出限 0.05 mg/kg[22]；吡唑醚菌酯在黃瓜中消解較快，長期膳食攝入風險較低[23]；高效液相色譜-串聯質譜法檢測出吡唑醚菌酯在人參植株中的半衰期為0.2～8.4 d，且符合慢性膳食風險可接受水平[24]；采用超高液相色譜-串聯質譜法檢測出吡唑醚菌酯在枇杷中的半衰期為9.5～12.8 d，且發(fā)現在施藥2～3次間隔7 d及推薦安全間隔期為14 d的條件下，其殘留符合安全要求[25]。

綜上所述，吡唑醚菌酯被廣泛地應用于防控多種病害，但其消解動態(tài)研究多集中在谷物、水果和中藥材等作物上，在蔬菜上的消解動態(tài)和最終殘留試驗研究較少。我國2021年新頒布的《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規(guī)定了吡唑醚菌酯在蔬菜中的最大殘留限量(GB2763—2021)，其值為0.02～5.00 mg/kg[26]。因此，為明確吡唑醚菌酯在不同蔬菜中的殘留消解動態(tài)，保障蔬菜生產安全，本文采用高效液相色譜法QuECHES提取與高效液相色譜儀檢測方法，研究吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的殘留消解動態(tài)，為其在7種蔬菜中安全合理地使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

吡唑醚菌酯標準品(純度99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer Gmb H公司)；25%吡唑醚菌酯懸浮劑(安徽輝隆集團銀山藥業(yè)有限責任公司)；乙腈、無水硫酸鎂、氯化鈉等；N-丙基乙二胺(PSA)。

高效液相色譜儀(DAD檢測器，安捷倫1260)；CK2000渦旋振蕩儀(Thmorgan)；AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；4000 rpm/min離心機(Thermo Fisher)；12 000 rpm/min離心機(Sigma)。

1.2 田間試驗設計

試驗參照《農作物中農藥殘留試驗準則》[27]和《農藥登記殘留田間試驗標準操作規(guī)程》[28]設計消解動態(tài)和最終殘留試驗。露地栽種蔬菜，每種蔬菜設4個處理，3次重復，1個對照。每個小區(qū)面積為30 m2，小區(qū)定苗150株左右，小區(qū)間設保護帶，常規(guī)管理。待蔬菜長至出苗時，采用背負式噴霧器(3WBD-18B)噴霧施藥。

1.2.1消解動態(tài)試驗方法

在貴州大學農學院實驗基地(露地)進行殘留消解動態(tài)試驗。每種蔬菜試驗小區(qū)面積30 m2，重復3次；分別在每種蔬菜葉片發(fā)育期施藥，施藥劑量45 mL/667 m2(制劑用量)，采用背負式噴霧器兌水噴霧，兌水量按每畝50 L，施藥1次，于施藥后2 h，1、2、3、5、7、10、14、21、28 d分別采集各種蔬菜樣品。另設對照區(qū)，施用等量清水，并采集對照樣品。所有樣本在采集后2 h內運回實驗室，并立即制成實驗室樣品于-20℃冷凍保存。

1.2.2最終殘留試驗方法

在貴州大學農學院實驗基地(露地)進行最終殘留試驗。試驗小區(qū)面積30 m2，重復3次；分別以30 mL/667 m2(制劑用量)和45 mL/667 m2(制劑用量)兌水稀釋使用，兌水量按每畝50 L。分別于每種蔬菜葉片發(fā)育期，進行莖葉噴霧。分別施藥2、3次，每次施藥間隔期為7天。在最后一次施藥后的7、14、21和28 d采集每種蔬菜莖葉樣品。試驗重復3次。另設清水對照區(qū)，施用等量清水，同時采集對照樣品。所有樣本在采集后2 h內運回實驗室，并立即制成實驗室樣品-20 ℃冷凍保存。

1.3 測定方法

1.3.1樣品提取及凈化

提取：分別稱取不同時期不同蔬菜的樣品于高速組織搗碎機中搗碎，分別稱取10 g研磨后樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，振蕩提取3 min，加入硫酸鎂分散于樣品中至不結塊，樣品成糊狀。將離心管以4000 r/min離心5 min，使有機溶劑與樣品分離。

凈化：取上清液1.5 mL于2 mL離心管中(2 mL離心管要預先加入150 mg無水硫酸鎂和50 mg PSA吸附劑)，渦旋振蕩儀振蕩3 min，再以12 000 r/min離心3 min。

檢測樣品的制備：用一次性注射器吸取凈化后的上清液1 mL，過0.22 μm濾膜，注入2 mL樣品瓶內，進液相色譜測定。

1.3.2液相色譜儀檢測條件

色譜柱：ZORBAX 300SB-C18 250 mm×4.6 mm(5.0 μm)；柱溫30 ℃；流動相：甲醇-水(80∶20)；流速1.0 mL/min；檢測波長：278 nm；進樣量20 μL；相對保留時間2.00 min。

1.3.3標準溶液配制和標準曲線繪制

準確稱取0.01 g吡唑醚菌酯標準品，用甲醇溶解定容至50 mL，配制成200 mg/L的標準儲備液，于4 ℃下避光保存。根據需要，用50%的甲醇逐漸稀釋成100、50、25、6.25、0.625 mg/L的標準溶液，按1.3.2條件檢測，以標準品的進樣質量濃度(mg/L)為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4計算1.3.4.1樣品中吡唑醚菌酯含量的計算方法

式中Xs為樣品中吡唑醚菌酯的殘留量，單位mg/kg。

Cs為把樣品峰面積代入標準曲線中計算得到的濃度，單位mg/L。

VAC為提取時加入乙腈的體積，單位mL。

m為提取時所稱量樣品的質量，單位g。

以采樣時間為橫坐標，殘留量為縱坐標，繪制散點圖，用下面的一級動力學方程擬合出參數k和x，利用參數k計算半衰期。

一級動力學方程：y=xe-kt

半衰期：T1/2=ln2/k

式中：y為時間t時農藥的殘留量(mg/kg)，x為農藥的初始質量分數(mg/kg)，k為降解速率常數，t為降解時間(d)。

1.4 添加回收率與相對標準偏差分析

分別在空白基質中添加0.05、0.2、1.0 mg/kg 3個水平的吡唑醚菌酯標準溶液，每個水平重復3次，按1.3.1和1.3.2測定回收率，并計算其相對標準偏差(RSD)。

2 結果與分析

2.1 分析方法的靈敏度和線性范圍

精準稱取吡唑醚菌酯的標準樣品0.01 g(精確至0.0001g)，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成200 mg/L的標準儲備液待用。根據需要，用50%的甲醇溶液稀釋成100、50、25、6.25、0.625 mg/L的標準工作溶液于4 ℃保存。以標準品的進樣質量濃度(mg/L)為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線(圖1)。吡唑醚菌酯在蔬菜樣品中的最低定量限(LOQ)為0.27 mg/kg，以3倍信噪比(S/N)計算得吡唑醚菌酯在蔬菜樣品中的檢出限(LOD)為0.15 mg/kg。吡唑醚菌酯的回歸方程為：y=77.19x+3.87，R2=0.99997，在0.625～100 mg/L范圍內溶液濃度與峰面積的靈敏度及線性關系良好(圖1)。

圖1 吡唑醚菌酯液相色譜圖(a)及標準曲線(b)Fig.1 Chromatogram(a) and standard curve(b) of pyraclostrobin

2.2 分析方法的準確度和精密度

在0.05～1.00 mg/kg的添加水平下，吡唑醚菌酯在香菜、韭菜、白菜、奶油生菜、蘿卜菜、黃心烏白菜、奶油小白菜7種蔬菜中的平均添加回收率均在89.7%～103.4%之間，相對標準偏差RSD值在添加回收率和相對標準偏差皆符合農藥殘留試驗要求(表1)。

表1 吡唑醚菌酯的添加回收率表Tab.1 Fortified recovery of pyraclostrobin

2.3 25%吡唑醚菌酯懸浮劑在7種蔬菜中的消解動態(tài)

25%吡唑醚菌酯懸浮劑在7種蔬菜中的消解動力學方程見表2和圖2。結果表明，25%吡唑醚菌酯懸浮劑在7種蔬菜中的原始沉積量分別為9.25、6.40、12.82、5.59、7.99、12.45、11、52 mg/kg；用一級動力學方程擬合吡唑醚菌酯在香菜、韭菜、白菜、奶油生菜、蘿卜菜、黃心烏白菜、奶油小白菜中的消解動態(tài)方程如表2所示。吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的半衰期為1.36～6.93 d，屬于易降解農藥。表明吡唑醚菌酯在不同蔬菜中的消解速率有一定差異，其中在白菜中的消解率最快，而在奶油生菜中的消解率最慢。

表2 吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的消解動態(tài)Tab.2 Dissipation of pyraclostrobin in seven vegetables

圖2 吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的消解動態(tài)曲線Fig.2 Degradation curve of pyraclostrobin in seven vegetables

2.4 25%吡唑醚菌酯懸浮劑在7種蔬菜中的最終殘留

25%吡唑醚菌酯懸浮劑在7種蔬菜中的最終殘留如表3所示，采集末次施藥后7、14、21、28 d的7種蔬菜作為最終殘留試驗檢測樣品，測定7種蔬菜中農藥殘留量。結果顯示，施藥量為30或45 mL/667 m2，施藥2～3次，施藥后14～28 d，所有蔬菜樣品中吡唑醚菌酯均符合安全要求(低于5 mg/kg)。

表3 吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的最終殘留Tab.3 Terminal residues of pyraclostrobin in seven vegetables

30 mL/667 m2(制劑用量)噴施莖葉，施藥2～3次，距離末次施藥后7 d，黃心烏白菜、奶油小白菜、香菜、白菜和奶油生菜樣品中吡唑醚菌酯殘留量為1.14～4.84 mg/kg，均低于我國規(guī)定吡唑醚菌酯在蔬菜中的最高殘留量(MRL)5 mg/kg，而韭菜和蘿卜菜樣品中吡唑醚菌酯殘留量為4.12～6.20 mg/kg，高于安全要求。距離末次施藥后14～28 d，7種蔬菜中吡唑醚菌酯殘留量為0.00～3.89 mg/kg，均低于規(guī)定的MRL值，符合安全要求；尤其28 d后奶油小白菜中未檢出吡唑醚菌酯。

45 mL/667 m2(制劑用量)噴施莖葉，施藥2～3次，距離末次施藥后7 d，黃心烏白菜和奶油小白菜中吡唑醚菌酯殘留量為1.13～2.44 mg/kg，未超安全限量；而白菜、韭菜、奶油生菜、香菜和蘿卜菜中吡唑醚菌酯殘留量為1.98～10.78 mg/kg，部分超過殘留限量。距離末次施藥14～28 d后，7種蔬菜中吡唑醚菌酯殘留量為0.00～4.95 mg/kg，均低于吡唑醚菌酯在蔬菜上的最大殘留限量，且28 d后奶油小白菜中仍未檢出吡唑醚菌酯。

3 結論與討論

本研究建立了高效液相色譜法測定吡唑醚菌酯殘留的分析方法，明確了其在7種蔬菜中的消解動態(tài)及最終殘留量。該方法靈敏度好，準確度和精密度均符合農藥殘留分析標準要求。消解動態(tài)試驗結果表明，吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的殘留消解動態(tài)均符合一級動力學方程。田間施藥后，吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的降解半衰期有一定差異，其在奶油生菜中的降解半衰期為6.93 d，而在白菜中的降解半衰期為1.36 d。降解速率快，屬易降解農藥。

本研究中測定的吡唑醚菌酯在白菜中的降解半衰期為1.36 d，這與張少軍等[21]測定吡唑醚菌酯在大白菜(河北試驗點，半衰期為2.97 d；湖北試驗點，半衰期為3.34 d)中的消解動態(tài)試驗結果，以及余維維等[23]測定吡唑醚菌酯在黃瓜(廣西試驗點，半衰期為2.08 d)中的消解動態(tài)試驗結果具有一定差異，可能是由作物自身、土壤、地理條件、氣候以及人為因素等所導致的差異。最終殘留試驗結果表明，距末次施藥14～28 d，殘留量均小于我國規(guī)定的吡唑醚菌酯MRL值(0.5 mg/kg)，表明吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的殘留風險較低。

本文通過研究吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的消解動態(tài)及最終殘留量，為評估吡唑醚菌酯在蔬菜中的膳食風險提供相關科學依據[29]。同時，吡唑醚菌酯在除白菜外的許多常見蔬菜中的MRL值并未有明確的制定，本研究也為7種蔬菜中吡唑醚菌酯MRL值的制定提供參考依據。