基于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1信號(hào)通路探討紫草生肌膏對(duì)肛瘺大鼠的干預(yù)作用

郭 偉，閆麗霞，常少青，劉振麗

(1.保定市第二醫(yī)院肛腸科,河北 保定 071051;2.河北省第七醫(yī)院影像科,河北 定州 073000)

肛瘺是發(fā)生在肛門直腸周圍的膿腫潰破，患者初期出現(xiàn)肛瘺容易導(dǎo)致疼痛紅腫等不良癥狀，可以用保守方法治療，如服用抗炎類藥物，控制住肛腸部位的炎癥，也可以使用外用藥膏進(jìn)行治療[1-3]。本病大多數(shù)是由肛管或直腸周圍的膿腫引起的，反復(fù)發(fā)作、自愈困難是其特點(diǎn)。紫草膏具有化腐生肌、解毒止痛之功效，主治熱毒蘊(yùn)結(jié)所致的潰瘍[4]。紫草膏臨床療效肯定,安全性好，涂擦治療深Ⅱ度燒傷也有較好療效,能提高創(chuàng)面愈合率。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)家族在炎癥、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育發(fā)揮重要作用，紫草生肌膏是否通過(guò)對(duì)組織損傷有促進(jìn)作用的TGF-β發(fā)揮作用，以及在肛瘺創(chuàng)傷后的修復(fù)作用研究較少[5-6]。

本研究擬通過(guò)大鼠肛瘺模型探究紫草生肌膏在大鼠肛瘺治療中的作用，并探究對(duì)炎癥因子、創(chuàng)面再生的影響，并從TGF-β1信號(hào)通路分析其作用機(jī)制，為紫草生肌膏在肛瘺的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 60只8～10周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重(220±20)g，由北京邁德康納生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào):SYXK(京)2020-0050。

1.1.2 藥品與試劑：蘇木精-伊紅購(gòu)于北京維德維康生物技術(shù)有限公司(180823)；IL-6 ELISA kit(H007)、IL-8 ELISA kit(H008)、IL-1β(H002)ELISA kit 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TNF-α ELISA kit(RAB0479)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；VEGF ELISA試劑盒Kl-E684R購(gòu)于美國(guó)Cygnus公司；PDGF ELISA(RAB1927)，Ang Ⅱ EIA 試劑盒(RAB0010)購(gòu)于美國(guó)sigma公司；IGF-1R ELISA試劑盒購(gòu)于南京博研生物科技有限公司。TGF-β1 antibody (ab179695，稀釋比1∶1000)，Samd3 antibody (ab122028，0.04～0.4 μg/ml)，p-Smad3 antibody (ab80588,稀釋比1∶10000)，CD31 antibody (ab182981，稀釋比1∶2000)，GAPDH antibody(ab9485，稀釋比1∶2500)及Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab6721，稀釋比1∶5000)二抗抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.1.3 儀器設(shè)備：激光多普勒血流儀Peri Flux 5000 (SKK-1100)購(gòu)于瑞沃德生命科技有限公司;RM2015 切片機(jī)，德國(guó) Leica 公司；-80 ℃超低溫保存箱，美國(guó)Thermo公司；4 ℃冰箱，購(gòu)自合肥美菱股份有限公司；高速低溫離心機(jī)(ESD-1733)，德國(guó) Eppenndorf Centrifuge公司；TEF-1510多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；DM-BA400-B顯微鏡，美國(guó)Motic公司；Western blot電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠分組及飼養(yǎng)條件：SPF級(jí)鼠房進(jìn)行SD大鼠飼養(yǎng)，溫度(25±5)℃,濕度為40%～55%，12 h交替照明，自由攝食和飲水。

1.2.2 大鼠肛瘺動(dòng)物模型的建立、分組及處理:大鼠分為對(duì)照組、模型組和試驗(yàn)組。大鼠采用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后，手術(shù)區(qū)剃除肛門部毛發(fā)備皮并進(jìn)行消毒，在肛管旁用標(biāo)記筆作半徑1.25 cm的圓形標(biāo)記，并切開肛管，傷口深達(dá)肌肉層約0.3 cm，止血后在創(chuàng)面滴1.5 ml糞液，并用油紗、敷料和膠帶固定48 h，造模成功標(biāo)準(zhǔn)為傷口有糞臭味并且有膿性分泌物。對(duì)照組大鼠制作傷口采用相同操作，但不滴糞液。試驗(yàn)組取紫草生肌膏擦洗大鼠創(chuàng)面后紗布包扎，對(duì)照組和模型組采用相同處理，包扎但不用生肌膏處理，換藥時(shí)用0.9%氯化鈉溶液清洗各組大鼠傷口，1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d[7]。

1.2.3 大鼠創(chuàng)面動(dòng)態(tài)血流值測(cè)定:激光多普勒血流儀檢測(cè)動(dòng)態(tài)血流值，將探頭放置在創(chuàng)面上，選3個(gè)點(diǎn)，以肛瘺內(nèi)口的頂端為第1個(gè)點(diǎn)，在瘺道走行方向上取第2和第3個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)記錄時(shí)間為30 s， 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用Power Lab Chart5 v5.2.2圖像分析軟件，該內(nèi)口創(chuàng)面的血流值為3個(gè)點(diǎn)測(cè)量值的平均值[8]。

1.2.4 大鼠創(chuàng)面愈合率測(cè)定:大鼠創(chuàng)面愈合率測(cè)定在最后一次干預(yù)后測(cè)定創(chuàng)面愈合率，觀察并測(cè)定各組大鼠的創(chuàng)面愈合情況，創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%[9]。

1.2.5 新生毛細(xì)血管數(shù)檢測(cè):取各組大鼠肛管相近處的創(chuàng)面肉芽組織，依次采用甲醛固定，制備石蠟切片，經(jīng)過(guò)CD31抗體染色，新生毛細(xì)血管在抗體標(biāo)記后，用顯微鏡200倍下統(tǒng)計(jì)新生毛細(xì)血管數(shù)[8]。

1.2.6 大鼠創(chuàng)面肉芽組織HE染色:對(duì)各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織進(jìn)行固定包埋后切片，脫蠟覆水，蘇木精染色5 min，5%乙酸1 min，伊紅染色1 min，70%、80%、90%、100%乙醇各脫水10 s，二甲苯透明1 min，自然晾干再封片，于顯微鏡下觀察病理學(xué)特點(diǎn)[10]。

1.2.7 ELISA檢測(cè)大鼠創(chuàng)面肉芽組織炎癥因子:各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織進(jìn)行低溫勻漿，4 ℃ 2000 r/min 15 min離心后取上清液，加入酶標(biāo)抗體，37 ℃,30 min，加入底物液，每孔100 μl,置37 ℃避光放置5 min,加入終止液顯色，每孔加入反應(yīng)終止液50 μl終止反應(yīng),于20 min內(nèi)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定吸光度OD值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔[11]。

1.2.8 Western blot 檢測(cè)創(chuàng)面肉芽組織TGF-β1/Smad蛋白的表達(dá):對(duì)各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織組織分離后進(jìn)行液氮研磨，裂解蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳條件為80 V 15 min，120 V 2 h，轉(zhuǎn)膜120 V 2.5 h，一抗4 ℃過(guò)夜，二抗室溫1 h溫孵育后，曝光后采用photoshop軟件通過(guò)灰度值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)，測(cè)量灰度重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布并且滿足方差齊性數(shù)據(jù)采用雙尾獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合、血流及新生毛細(xì)血管情況比較 見表1。與對(duì)照組相比，模型組和試驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面愈合率、局部血流量、大鼠新生毛細(xì)血管數(shù)顯著降低，創(chuàng)面難愈，并且表面流膿、糜爛。試驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面愈合率、局部血流量、大鼠新生毛細(xì)血管數(shù)顯著提高，創(chuàng)面恢復(fù)優(yōu)于模型組，但仍顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織HE染色比較 對(duì)照組創(chuàng)面肉芽組織多被鱗狀上皮覆蓋，創(chuàng)面肉芽組織已成熟，毛細(xì)血管閉塞，成纖維細(xì)胞顯著增多,排列致密。模型組中性粒細(xì)胞大量滲出，未見片狀的膠原纖維沉積，創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)較對(duì)照組和試驗(yàn)組緩慢,成纖維細(xì)胞偏少,排列紊亂。試驗(yàn)組創(chuàng)面肉芽組織成熟，部分毛細(xì)血管閉塞，小靜脈和小動(dòng)脈初步形成，成纖維細(xì)胞增多并有序排列，偶見成片狀的膠原纖維沉積(圖1)。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合、血流及新生毛細(xì)血管情況比較

圖1 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織病理圖(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組與試驗(yàn)組炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均顯著上升(P<0.01)，而試驗(yàn)組炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均顯著低于模型組，但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

表2 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平比較

2.4 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織成血管分化因子水平比較 見表3。與對(duì)照組相比，模型組與試驗(yàn)組成血管因子VEGF、PDGF、AngⅡ、IGF-1R水平均顯著降低(P<0.01)，而試驗(yàn)組成血管因子VEGF、PDGF、Ang Ⅱ、IGF-1R水平均顯著高于模型組，但仍顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織成血管分化因子水平比較

2.5 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織TGF-β1信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較 見表4(圖2)。與對(duì)照組比較，模型組TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白水平均顯著降低；與模型組比較，試驗(yàn)組TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白水平顯著升高，試驗(yàn)組和對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，蛋白質(zhì)相對(duì)定量分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這種趨勢(shì)(P<0.01)。

表4 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織TGF-β1信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較

圖2 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織TGF-β1信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平

3 討 論

肛瘺是肛門直腸瘺的簡(jiǎn)稱，是肛門直腸周圍膿腫破潰或切口引流的后遺癥[12]。大多數(shù)是由肛管或直腸周圍的膿腫引起的，反復(fù)發(fā)作、自愈困難是肛瘺的特點(diǎn)。 肛瘺有間歇期和發(fā)作期。 在間歇期階段不需要藥物治療，在發(fā)作期間，可能會(huì)出現(xiàn)流膿、發(fā)紅、腫脹和疼痛等癥狀。 如果不能及時(shí)進(jìn)行手術(shù)，通常采用藥物治療來(lái)暫時(shí)緩解癥狀[13-14]。紫草膏具有活血解毒、祛腐生肌的功效,對(duì)臨床上常見的瘡瘍流膿、糜爛、創(chuàng)面難愈、新肌難生具有良好的治療作用[15]。在深Ⅱ度燒傷患者治療中，紫草膏涂擦治療能明顯改善患者創(chuàng)面情況,通過(guò)調(diào)控血清5-羥色胺(5-HT)、β-內(nèi)啡肽(β-EP)的表達(dá)水平提高創(chuàng)面愈合率。同時(shí)有研究表明三黃紫草膏輔助治療糖尿病足有助于創(chuàng)面的愈合,促進(jìn)肉芽組織的生長(zhǎng),有效緩解疼痛,利于患者的康復(fù)。改良版紫草膏能改善局限性神經(jīng)性皮炎的皮損厚度、色澤及瘙癢程度,同時(shí)具有改善表皮增厚、抗炎和促進(jìn)表皮修復(fù)的作用[16-17]。本研究通過(guò)HE染色和ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了紫草生肌膏可以促進(jìn)肛瘺大鼠創(chuàng)傷組織修復(fù)，降低炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，同時(shí)降低組織細(xì)胞的IL-6、IL-8等炎癥因子釋放，發(fā)揮抗炎作用，降低了創(chuàng)傷組織的炎癥損傷。由于組織修復(fù)過(guò)程伴隨著組織內(nèi)血管生成，本研究發(fā)現(xiàn)在紫草生肌膏干預(yù)后，大鼠創(chuàng)傷組織小靜脈血管和小動(dòng)脈血管均有一定程度的增加，結(jié)合ELISA結(jié)果中證實(shí)的血管生成相關(guān)因子VEGF、AngⅡ等多種促血管生成因子釋放增加，可推測(cè)紫草生肌膏對(duì)創(chuàng)傷組織的保護(hù)作用可通過(guò)促進(jìn)血管生成，促進(jìn)組織修復(fù)實(shí)現(xiàn)。

傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，它依賴于各種類型的細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)元素[18]。TGF-β1是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，也是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)因子，在基質(zhì)愈合過(guò)程中，主要由TGF-β的激活而轉(zhuǎn)化為可運(yùn)動(dòng)和收縮的肌成纖維細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和擴(kuò)散愈合，每種TGF-β亞型可能對(duì)傷口愈合產(chǎn)生不同的影響，此過(guò)程通常取決于細(xì)胞的微環(huán)境，其中TGF-β1主要介導(dǎo)傷口的纖維化，TGF-β3可以促無(wú)瘢痕愈合，減少的瘢痕形成[19-20]。本研究表明，大鼠肛瘺發(fā)生后，TGF-β1、Smad3及p-Smad3水平顯著降低，提示傷口愈合能力下降，而紫草生肌膏干預(yù)后，大鼠創(chuàng)面肉芽組織TGF-β1、Smad3及p-Smad3水平顯著升高，提示紫草生肌膏可以通過(guò)TGF-β1促進(jìn)傷口愈合，介導(dǎo)傷口纖維化，實(shí)現(xiàn)傷口的加速愈合，并且此過(guò)程與Smad蛋白的磷酸化修飾調(diào)控顯著相關(guān)，同時(shí)通過(guò)TGF/Smad通路抑制IL-6和TNF-α等炎癥反應(yīng)[21-22]，發(fā)揮降低組織炎性損傷的作用。

綜上所述，紫草生肌膏對(duì)肛瘺大鼠創(chuàng)面愈合具有促進(jìn)作用，其可以通過(guò)降低炎癥發(fā)應(yīng)和促進(jìn)血管生成發(fā)揮作用，此過(guò)程的分子機(jī)制與TGF-β1信號(hào)通路的調(diào)控及磷酸化修飾相關(guān)。本研究可以進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)該分子機(jī)制進(jìn)行深入探究，完善紫草生肌膏在臨床應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。