軟棗獼猴桃休眠芽超低溫保存技術(shù)

●黃淑華（本溪市林業(yè)發(fā)展服務中心 遼寧 本溪 117000）

軟棗獼猴桃俗稱軟棗子、獼猴梨，是獼猴桃科獼猴桃屬藤本落葉植物，果實營養(yǎng)價值極高，且具有較高的經(jīng)濟價值、藥用價值。當前軟棗獼猴桃常規(guī)繁殖方法為種子繁殖、組織培養(yǎng)、扦插與嫁接，其中組培具有生根率高、成活率高、優(yōu)良性狀多的特點，但是，因組培出瓶煉苗期間缺乏適宜的休眠芽保存環(huán)境，對組培效果造成了較大的負面影響。 為解決休眠芽保存問題，提高軟棗獼猴桃組培出瓶煉苗效果，對休眠芽超低溫保存進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

軟棗獼猴桃休眠芽采自中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所軟棗獼猴桃種質(zhì)資源圃。0.1%氯化汞、5%次氯酸鈉、無菌水、0.3～0.7 mol/L 蔗糖、MS（有機硅改性聚醚膠）、1～2 mol/L 甘油、0.5 mol/L 山梨醇、15%乙二醇、7%～15%二甲基亞砜、15%聚乙二醇、Partec HR-A溶液（分離細胞核的檸檬酸）、Partec HR-B溶液（分離細胞核的檸檬酸）等。

1.2 試驗設計

在實驗室環(huán)境進行以下操作。

1.2.1 剝休眠芽依據(jù)再生能力強、遺傳穩(wěn)定、成活率高的標準，選擇采摘于12月中下旬到1月中下旬的休眠枝條（25年生軟棗獼猴桃樹），利用濕毛巾包裹枝條剪口并存放到4℃冰箱內(nèi)。

1.2.2 預培養(yǎng)根據(jù)休眠芽在生理狀態(tài)（抗凍性）改善需求，利用預培養(yǎng)方法，進行材料處理。其中，預培養(yǎng)主要是在蔗糖高滲培養(yǎng)液（或山梨醇高滲液、甘油高滲液、二甲基亞砜高滲液）內(nèi)，調(diào)整環(huán)境溫度在23～27℃，光照為12 h/d（雙管冷白色熒光燈管），誘導休眠芽細胞脫水1～6 d，使休眠芽組織細胞內(nèi)自由水含量下降到較低的水平，促使休眠芽抗凍性提升[1]。

1.2.3 凍存在室溫下，用0.4 mol/L 蔗糖、MS、2 mol/L 甘油配制高濃度混合裝載液（或0.5 mol/L山梨醇、2 mol/L甘油、15%聚乙二醇、7%二甲基亞砜、0.6 mol/L 蔗糖、MS），裝載 10～60 min，降低軟棗獼猴桃休眠芽組織細胞自由水含量。在室溫（23～27℃）下，用0.5 mol/L山梨醇、2 mol/L甘油、15%乙二醇、7%二甲基亞砜、15%聚乙二醇、0.4 mol/L蔗糖、MS配制玻璃化液A；若溫度低于0℃，則利用15%乙二醇、0.4 mol/L蔗糖、MS、15%二甲基亞砜配制玻璃化液B（植物玻璃化保護液），無菌調(diào)節(jié)下浸入軟棗獼猴桃休眠芽，進一步提高軟棗獼猴桃休眠芽的抗凍性。脫水處理后更換新鮮的玻璃化液，并在無菌條件下將軟棗獼猴桃休眠芽轉(zhuǎn)入2 mL凍存管內(nèi)，每管10芽，將其浸入液氮中，凍存24 h?；蛘邔⒚撍蟮能洍棲J猴桃休眠芽放入鋁箔條上玻璃化液滴內(nèi)進入液氮保存24 h及以上，促使軟棗獼猴桃休眠芽進入生機停頓狀態(tài)。

1.2.4 解凍培養(yǎng)在37～40℃溫水中（一般為38℃），水浴處理軟棗獼猴桃休眠芽2 min，使其在短時間內(nèi)升高溫度并通過冰晶生長區(qū)，規(guī)避軟棗獼猴桃休眠芽細胞內(nèi)再次結(jié)冰而死亡。解凍后利用1.2 mol/L蔗糖、MS配制而成的卸載液處理軟棗獼猴桃休眠芽20～30 min，卸除軟棗獼猴桃休眠芽細胞內(nèi)存在毒害作用的玻璃化液[2]。隨后利用2 mg/L 6-BA（6- 芐氨基嘌呤）、GA3（赤霉素）、0.02 mg/L NAA（萘乙酸）配制培養(yǎng)基（或者 MS、0.01 mg/L NAA、1 mg/L 6-BA），暗處培養(yǎng)3～8 d，促進軟棗獼猴桃休眠芽修復，提高軟棗獼猴桃休眠芽的生長速度。

1.3 測試方法

1.3.1 倍性鑒定方法以未應用超低溫保存技術(shù)的軟棗獼猴桃休眠芽發(fā)育的植株為對照，鑒定應用超低溫保存技術(shù)后的軟棗獼猴桃休眠芽發(fā)育成植株倍性[3]。即在潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)放入1 cm2幼嫩葉片，加入0.1 mL 的 Partec HR-A 裂解液，利用無菌刀片破碎軟棗獼猴桃休眠芽組織，處理5 min。裂解處理后，將軟棗獼猴桃休眠芽組織經(jīng)100 μm孔徑的濾網(wǎng)過濾到小試管內(nèi)，向試管內(nèi)加入 1.6 mL 的 Partec HR-B 溶液，暗處理 2 min，在Partec倍性分析儀內(nèi)分析軟棗獼猴桃休眠芽發(fā)育的植株倍性水平。

1.3.2 成活率測試方法為判定預培養(yǎng)液對軟棗獼猴桃休眠芽成活率的影響，其他因素不變（預培養(yǎng)時間2 d、裝載時間20 min，玻璃化溶液B），以蔗糖、甘油為滲透保護物質(zhì)，調(diào)整蔗糖濃度、甘油濃度。

為判定預培養(yǎng)時間對軟棗獼猴桃休眠芽成活率的影響，其他因素一定（蔗糖濃度為0.3 mol/L、甘油濃度為1 mol/L，裝載時間20 min，玻璃化溶液B），調(diào)整軟棗獼猴桃休眠芽預培養(yǎng)時間分別為2，3，4，5，6 d。

為判定裝載時間對軟棗獼猴桃休眠芽成活率的影響，其他因素一定（蔗糖濃度為0.3 mol/L、甘油濃度為1 mol/L，預培養(yǎng)時間2 d，玻璃化溶液B），調(diào)整軟棗獼猴桃休眠芽裝載時間分別為10，20，30，40，50 min。

為判定玻璃化保護液對軟棗獼猴桃休眠芽成活率的影響，其他因素一定（蔗糖濃度為0.3 mol/L、甘油濃度為 1 mol/L，預培養(yǎng)時間 2 d，裝載時間20 min），分別在玻璃化溶液A、玻璃化溶液B內(nèi)處理軟棗獼猴桃休眠芽。

2 結(jié)果與分析

2.1 倍性鑒定結(jié)果

倍性鑒定結(jié)果表明：軟棗獼猴桃休眠芽低溫處理前后的染色體倍性均為二倍體（58）。

2.2 成活率測試結(jié)果

當預培養(yǎng)時間、裝載時間一定，而蔗糖濃度與甘油濃度變化時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率變化，見表1。

表1 不同蔗糖濃度與甘油濃度下軟棗獼猴桃休眠芽成活率

由表1可知，蔗糖濃度與甘油濃度對軟棗獼猴桃休眠芽成活率具有一定影響。軟棗獼猴桃休眠芽成活率隨著蔗糖濃度、甘油濃度的升高先上升后下降，在蔗糖濃度為0.3 mol/L、甘油濃度為1.0 mol/L時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率最高。

當蔗糖濃度與甘油濃度、裝載時間一定，而預培養(yǎng)時間變化時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率變化，見表2。

表2 不同預培養(yǎng)時間下軟棗獼猴桃休眠芽成活率

由表2可知，預培養(yǎng)時間對軟棗獼猴桃休 眠芽成活率具有較大影響。隨著預培養(yǎng)時間的延長，軟棗獼猴桃休眠芽成活率不斷下降。在預培養(yǎng)時間為2 d時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率最高。

當蔗糖濃度與甘油濃度、預培養(yǎng)時間一定，而裝載時間變化時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率變化，見表3。

表3 不同裝載時間下軟棗獼猴桃休眠芽成活率

由表3可知，裝載時間對軟棗獼猴桃休眠芽成活率的影響較大。裝載時間為20 min時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率最高。

在玻璃化溶液A處理下，軟棗獼猴桃休眠芽成活率為43.25%；玻璃化溶液B下，軟棗獼猴桃休眠芽成活率為75.26%，表明玻璃化溶液B更適用于軟棗獼猴桃休眠芽超低溫處理。

3 結(jié)論

通過對比應用超低溫保存技術(shù)前后的軟棗獼猴桃休眠芽發(fā)育的植株倍性水平，得出兩者染色體倍性水平一致，表明超低溫冷凍保存技術(shù)不會影響軟棗獼猴桃休眠芽發(fā)育倍性水平。

當蔗糖濃度為 0.3 mol/L、甘油濃度為 1.0 mol/L時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率可以達到75.26%，調(diào)高或調(diào)低蔗糖與甘油濃度均會導致軟棗獼猴桃休眠芽成活率下降。當蔗糖濃度為0.7 mol/L、甘油濃度為2.0 mol/L時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率最低，為55.23%，可能是由于甘油、蔗糖作為滲透保護物質(zhì)對休眠芽產(chǎn)生滲透脅迫，破壞軟棗獼猴桃休眠芽組織結(jié)構(gòu)，致使組織細胞喪失活性。

預培養(yǎng)時間為2 d時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率最高，為75.26%。隨著預培養(yǎng)時間的延長，軟棗獼猴桃休眠芽成活率下降。預培養(yǎng)時間為6 d時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率下降到6.89%，這可能是由于長時間培養(yǎng)致使休眠芽解除休眠時間提前，在后續(xù)低溫處理時失去活性，無法順利發(fā)芽。

裝載時間為20 min時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率最高，為75.26%。在裝載時間為50 min時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率最低，為30.20%。在裝載時間為10，30，40 min時，軟棗獼猴桃休眠芽成活率分別為70.01%，61.20%，51.27%，表明裝載時間對軟棗獼猴桃休眠芽成活率具有較大影響。在后續(xù)軟棗獼猴桃休眠芽處理技術(shù)研究時，應進一步縮短裝載間隔，確定軟棗獼猴桃休眠芽發(fā)芽率最高時對應的精確裝載時間。

玻璃化溶液B可以提高軟棗獼猴桃休眠芽低溫處理成功率，改善軟棗獼猴桃休眠芽低溫處理時可溶性固形物下降的情況，提高軟棗獼猴桃休眠芽發(fā)芽率，可在后續(xù)軟棗獼猴桃休眠芽低溫處理時大規(guī)模應用。

綜上，軟棗獼猴桃休眠芽超低溫保存技術(shù)具有操作便捷、成功率高的特點，對儀器無特殊要求，且處理工序較少，可以確保處理后軟棗獼猴桃成活率處于較高水平。因此，在軟棗獼猴桃組培期間，可以采用超低溫保存休眠芽技術(shù)，將源于軟棗獼猴桃植物的休眠芽放入預培養(yǎng)液中無菌裝載，進而在0℃以下環(huán)境內(nèi)凍存，凍存后水浴解凍培養(yǎng)，提高軟棗獼猴桃組培成功率。