普魯蘭多糖產(chǎn)生菌出芽短梗霉的紫外誘變及其培養(yǎng)基優(yōu)化

趙廷彬，殷海松，2*，張琳，喬長(zhǎng)晟，3，4*

（1.天津慧智百川生物工程有限公司，天津 300457；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津 300350；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；4.天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457）

普魯蘭多糖是微生物產(chǎn)生的一種胞外水溶性中性多糖，是以α-（1，4）糖苷鍵連接D-葡萄糖單體縮合成的麥芽三糖單元通過α-（1，6）糖苷鍵連接而成的線性多糖[1-3]，又可稱為聚麥芽三糖。普魯蘭多糖獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其具有高水溶性、成膜性、可塑性、可降解性、阻氧性和穩(wěn)定性等諸多特性[4-7]，被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，是一種極具開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景的新型功能性生物大分子，分子范圍為5 ku～9 000 ku[8-10]。

目前，能夠生產(chǎn)普魯蘭多糖的菌株有寄生真菌（Cytaria spp.）、出芽暗色孢霉（Dematium pullulans）、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）、紅酵母（Rhodotorula bacarum）、黃金銀耳（Tremella mesenterica）和產(chǎn)氣桿菌（Aerobacter aerogenes）等[1，11-13]。出芽短梗霉因其產(chǎn)糖量高，逐漸成為微生物發(fā)酵產(chǎn)普魯蘭多糖的主要菌種[7，13-15]。

出芽短梗霉由于其變種很多，性能差異大而不能直接滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，并且在普魯蘭多糖合成的過程中往往伴有黑色素等多種副產(chǎn)物的生成[4，13，16]，對(duì)后期普魯蘭多糖的分離提取帶來極大的困難，加上該菌株形態(tài)多異，不好控制等原因，導(dǎo)致普魯蘭多糖的工業(yè)化生產(chǎn)成為難題。為了實(shí)現(xiàn)普魯蘭多糖高產(chǎn)量、高品質(zhì)、低成本的工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)糖量高、色素合成低的菌種是關(guān)鍵前提。李慧穎等[17]利用紫外誘變篩選出了1株高產(chǎn)普魯蘭多糖的突變株UV-1，其普魯蘭多糖產(chǎn)量為46.96 g/L，較原始菌株提高了1.43倍。王賢卓[18]通過硫酸二乙酯、亞硝基胍、紫外線等復(fù)合誘變，篩選出一株普魯蘭多糖高產(chǎn)菌P1012，普魯蘭產(chǎn)量為25.60 g/L，較出發(fā)菌株P(guān)23提高了22.4%。

本文實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的出芽短梗霉CGMCC NO.3337具有較高的普魯蘭多糖合成能力，多糖產(chǎn)量在60 g/L左右。為了進(jìn)一步提高普魯蘭多糖的產(chǎn)量，以該菌株為出發(fā)菌株，利用紫外誘變技術(shù)進(jìn)行普魯蘭高產(chǎn)菌的選育。后續(xù)以單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析法對(duì)突變株UV-10的發(fā)酵培養(yǎng)基成分配比進(jìn)行優(yōu)化，尋找最佳產(chǎn)糖培養(yǎng)基配比，為后續(xù)工業(yè)化放大提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）：保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。保藏號(hào)：CGMCC NO.3337。

斜面培養(yǎng)基（g/L）[馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）]：土豆 200，瓊脂粉 20，葡萄糖20，加入蒸餾水至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 100，酵母浸粉 3.0，NaCl 2.5，MgSO4·7H2O 0.4，（NH4）2SO41，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，K2HPO42，初始pH值6.0，121℃下滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 150，蛋白胨 5，MgSO4·7H2O 0.4，K2HPO47，NaCl 3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，初始pH值6.0，121℃下滅菌20 min。

1.1.2 主要試劑

蔗糖：廣西田東縣制糖有限公司；酵母浸粉：維科特化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；硫酸銨、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀：天津博迪化工股份有限公司；蛋白胨、牛肉粉：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；硫酸鎂：淄博川北化工有限公司；氯化鈉：維科特化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外/可見分光光度計(jì)：日本島津公司；SKY-2102搖床：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；YJ-875S醫(yī)用超凈臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；SPK-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LD5-10高速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；Agilent 1100高效液相色譜分析儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

1.3.1.1 斜面培養(yǎng)

將-80℃甘油管中保存的菌體溶化后劃線轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA斜面中，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d～4 d。

1.3.1.2 種子培養(yǎng)

取出培養(yǎng)好的斜面，在無菌操作條件下挑取一環(huán)孢子接到裝有50 mL種子培養(yǎng)基并滅好菌的500 mL擋板瓶中，并放入到28℃搖床中，180 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)20 h。

1.3.1.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液在無菌條件下混勻，然后按照10%（體積比）的接種量，接種到裝有45 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板瓶中。采用兩階段控溫發(fā)酵，前24 h為32℃，后64 h溫度調(diào)為28℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min培養(yǎng)周期為88 h。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 菌體量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19]中的試驗(yàn)方法進(jìn)行菌體量測(cè)定。

1.3.2.2 殘?zhí)堑臏y(cè)定

參考文獻(xiàn)[20]中的試驗(yàn)方法進(jìn)行殘?zhí)堑臏y(cè)定。

1.3.2.3 普魯蘭多糖的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[21]中的試驗(yàn)方法進(jìn)行普魯蘭多糖的測(cè)定。

1.3.3 紫外誘變?cè)囼?yàn)

1.3.3.1 制備菌懸液

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液5 mL于離心管中，5 000 r/min下離心5min，收集菌體，將菌體用無菌生理鹽水洗滌離心2次，并重懸于45 mL無菌生理鹽水中，然后倒入放有玻璃珠的三角瓶中，振蕩20 min，使孢子充分分散。用無菌脫脂棉過濾，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度到約108CFU/mL，制成孢子懸液。

1.3.3.2 紫外誘變處理

取5 mL制備好的孢子懸液放入內(nèi)置有滅菌磁力轉(zhuǎn)子的無菌培養(yǎng)皿中，在30 W紫外燈下，20 cm處進(jìn)行照射，照射時(shí)間分別為 0、30、60、90、120、150 s。在暗室中將1 mL不同照射時(shí)間處理液稀釋到適合的濃度，然后取100 μL稀釋液涂布于PDA平板上，于28℃避光培養(yǎng)3 d～4 d。計(jì)算各個(gè)照射時(shí)間的致死率，并繪制致死率曲線。

1.3.3.3 初篩

將誘變的孢子懸浮液涂布于PDA平板上，28℃下培養(yǎng)3 d～4 d。以菌落顏色深淺，形態(tài)大小及表面質(zhì)地為篩選指標(biāo)，挑取出芽短梗霉菌落直徑大、表面濕潤(rùn)、顏色淺或白色的變異株。并將平板初篩獲得的變異菌株進(jìn)行搖瓶初篩。

1.3.3.4 復(fù)篩

選取平板初篩變異株刮取一環(huán)接種到種子培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)30 h。然后將種子培養(yǎng)基按2%的比例接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，并按1.3.1.3所描述的方法進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定普魯蘭多糖產(chǎn)量，并選出產(chǎn)量最高的突變株1株～2株。

1.3.3.5 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將復(fù)篩選出的變異菌株在斜面上連續(xù)傳代10代，選第2代、第4代、第6代、第8代和第10代進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定突變株的普魯蘭產(chǎn)量，檢驗(yàn)菌株遺傳穩(wěn)定性。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.4.1 單因素優(yōu)化

分別以發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源種類（蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、F42果葡糖漿）、目標(biāo)碳源質(zhì)量濃度（100、125、150、175、200 g/L）、氮源種類（酵母浸粉、蛋白胨、玉米漿、牛肉粉、硝酸銨、氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨）、目標(biāo)氮源質(zhì)量濃度（2、4、6、8、10、12、14、16 g/L）、金屬離子種類（Na+、K+、Mg2+、Fe2+）及不同初始 pH 值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）為自變量，以普魯蘭多糖產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的主要因素及其添加量。

1.3.4.2 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)基的成分及pH值進(jìn)行篩選：蔗糖、牛肉粉、MgSO4·7H2O、K2HPO4、FeS O4·7H2O、初始pH值。每個(gè)因素設(shè)計(jì)高和低兩個(gè)水平值，忽略個(gè)因素之間的交互作用，建立模型，確定因素的效應(yīng)值。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)表如表1所示。

表1 PB設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.3.4.3 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)以PB試驗(yàn)的試驗(yàn)值變化方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)PB試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)步長(zhǎng)，盡快逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.3.4.4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）

以最陡爬坡試驗(yàn)最優(yōu)點(diǎn)的數(shù)據(jù)作為中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)三因素三水平中心組合試驗(yàn)，使用Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析。中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)表如表2所示。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 2 Factors and levels of central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變

2.1.1 誘變時(shí)間的確定

對(duì)原始菌株進(jìn)行紫外誘變處理，并繪制致死率曲線，如圖1所示。

圖1 誘變時(shí)間對(duì)出芽短梗霉致死率的影響Fig.1 Effect of UV mutation time on the mortality of A.Pullulans

由圖1可知，隨紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸增加。致死率一般控制在80%～90%為宜，當(dāng)照射時(shí)間為100 s時(shí)，致死率為79.5%，120 s時(shí)達(dá)到97.9%。因此，選擇最佳誘變時(shí)間為110 s。

2.1.2 突變菌株篩選

通過平板初篩和搖瓶復(fù)篩得到5株普魯蘭多糖產(chǎn)量高且不產(chǎn)黑色素的突變株，結(jié)果如表3所示。

表3 突變菌株復(fù)篩結(jié)果Table 3 The results of secondary screening of mutant strains

選擇產(chǎn)量提高在20%以上的2株突變菌，分別命名為UV-4和UV-10，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

UV-4和UV-10遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如下表4所示。

表4 UV-4和UV-10遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 4 Genetic stability experiment of UV-4 and UV-10

由表4可知，隨著傳代次數(shù)的增多，UV-4突變株在傳至第4代之后普魯蘭的產(chǎn)量明顯降低。說明該突變株不穩(wěn)定，容易發(fā)生了回復(fù)突變。而UV-10突變株經(jīng)過10代的傳代培養(yǎng)，普魯蘭多糖產(chǎn)量較穩(wěn)定。因此，選用UV-10突變株進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 初始pH值對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響

不同初始pH值對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同初始pH值對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響Fig.2 The effect of different initial pH on pullulan fermentation

由圖2可知，pH值對(duì)于普魯蘭多糖產(chǎn)量和菌體量影響較大。當(dāng)初始pH值為6.5時(shí)，菌體量達(dá)到最大，但普魯蘭多糖在初始pH6.0時(shí)達(dá)到最大。出芽短梗霉UV-10菌體最適生產(chǎn)pH值和產(chǎn)物最佳合成pH值并不相同。pH值不僅影響菌體的生長(zhǎng)，而且也會(huì)影響發(fā)酵后期pH的動(dòng)態(tài)變化以及菌體合成普魯蘭多糖的能力，同時(shí)對(duì)出芽短梗霉的菌體形態(tài)產(chǎn)生影響[19]。

2.2.1.2 碳源種類及濃度對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響

不同碳源對(duì)普魯蘭發(fā)酵影響非常大[22]。碳源對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 碳源對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響Fig.3 The effect of carbon sources on pullulan fermentation

由圖3A可知，以蔗糖為唯一碳源發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖時(shí)產(chǎn)量最高，達(dá)到80.46 g/L，而麥芽糖最適合菌體生產(chǎn)。因此，選擇蔗糖作為出芽短梗霉生產(chǎn)普魯蘭多糖的碳源。如圖3B所示，隨著蔗糖濃度的增加，普魯蘭多糖產(chǎn)量和菌體量也在增加。當(dāng)蔗糖濃度為150 g/L時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率和單位菌體產(chǎn)糖量最高。底物濃度再增加時(shí)，轉(zhuǎn)化率和單位菌體產(chǎn)糖量均處于下降趨勢(shì)，為節(jié)約生產(chǎn)成本，蔗糖的最適濃度應(yīng)選擇為150 g/L。

2.2.1.3 氮源種類及濃度對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響

不同氮源對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同氮源對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources on pullulan fermentation

如圖4A所示，當(dāng)有機(jī)氮源作為唯一氮源時(shí)，發(fā)酵普遍優(yōu)于無機(jī)氮源。在有機(jī)氮源中，牛肉粉作為氮源時(shí)發(fā)酵結(jié)果最為理想，普魯蘭多糖產(chǎn)量高達(dá)91.93 g/L。無機(jī)氮源作為唯一氮源時(shí)發(fā)酵結(jié)果均不理想，可能是由于無機(jī)氮源除可提供單一氮元素外，無其他微量元素，導(dǎo)致既不利于菌體生長(zhǎng)，也不利于普魯蘭多糖的產(chǎn)生[23]。由圖4B可以看出，菌體量隨著牛肉粉添加量的增加而持續(xù)增大，而普魯蘭多糖的產(chǎn)量先增大后減小，在4 g/L時(shí)，多糖產(chǎn)量達(dá)到最大，為92.6 g/L，大于4 g/L后普魯蘭的產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。故牛肉粉的最適添加量為4 g/L。

2.2.1.4 無機(jī)鹽對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響

無機(jī)鹽對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 無機(jī)鹽對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of inorganic salt on pullulan fermentation

在大量無機(jī)元素中，鈉離子與維持細(xì)胞滲透壓有關(guān)，雖不參與細(xì)胞的組成，但仍是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的必要成分，故在培養(yǎng)基中常加入少量的鈉鹽。圖5A可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加NaCl對(duì)普魯蘭多糖的產(chǎn)量影響甚微，菌體量隨著NaCl濃度的增加而略微有下降趨勢(shì)。為了考慮經(jīng)濟(jì)成本，決定將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的NaCl去掉。

由圖5B可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加MgSO4·7H2O時(shí)，發(fā)酵液中菌體量只有少量積累，過少的菌體量不利于多糖產(chǎn)量的合成。隨著發(fā)酵液中MgSO4·7H2O，濃度的提高，菌體量大量積累，普魯蘭多糖也快速合成。當(dāng)MgSO4·7H2O的濃度為0.6 g/L，普魯蘭多糖產(chǎn)量和菌體量達(dá)到最大，分別為90.8 g/L和16 g/L。究其原因是MgSO4·7H2O激活了普魯蘭多糖合成途徑中關(guān)鍵酶的活性[21]。

由圖5C可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基中K2HPO4是否存在對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響很大。當(dāng)不添加K2HPO4時(shí)，普魯蘭多糖產(chǎn)量?jī)H為34.15 g/L。隨著K2HPO4的添加量的增大，普魯蘭多糖產(chǎn)量隨之增大。當(dāng)K2HPO4的濃度達(dá)到7 g/L時(shí)，普魯蘭多糖產(chǎn)量達(dá)到最大，為80.22 g/L。之后隨著K2HPO4濃度的增加普魯蘭多糖產(chǎn)量基本不再發(fā)生變化。而菌體量隨著K2HPO4濃度的增大呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，在3 g/L時(shí)達(dá)到最大，為15.9 g/L。說明低濃度的K2HPO4有利于菌體量的積累。

由圖5D可以看出，F(xiàn)eSO4·7H2O對(duì)普魯蘭多糖的發(fā)酵影響較小。與未加FeSO4·7H2O時(shí)的產(chǎn)量（81.53g/L）相比，添加0.03 g/L的FeSO4·7H2O時(shí)，產(chǎn)量提高了3.07 g/L。而當(dāng)FeSO4·7H2O的濃度超過0.03 g/L，普魯蘭多糖的產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。

2.2.2 PB試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照N=12進(jìn)行試驗(yàn)。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見表5，各因素效應(yīng)值及顯著性分析見表6。

表5 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Design and results for the Plackett-Burman experiment

表6 PB試驗(yàn)分析結(jié)果Table 6 Result of regression analysis of Plackett-Burman design

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)PB設(shè)計(jì)的結(jié)果進(jìn)行方差分析，該模型中R2=0.97，P＜0.05，說明模型可信度較高。其中正影響因子有A、B、C和D。負(fù)影響因子為E和F。對(duì)普魯蘭產(chǎn)量影響由大到小排列：C＞B＞D＞A＞E＞F。選擇影響最顯著的3個(gè)因素即MgSO4·7H2O、牛肉粉、K2HPO4進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

在PB試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，結(jié)果如表7所示。

表7 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Experimental design and results of steepest ascent method

由表7可知，當(dāng)牛肉粉、MgSO4·7H2O和KH2PO4的濃度分別增加到4.0、0.7、8 g/L時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中普魯蘭多糖的產(chǎn)量達(dá)到最大，因此我們選擇該濃度作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 8 The experiment design and results of the CCD

利用Design expert 8.0.6軟件對(duì)表8結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到二階回歸方程：普魯蘭多糖/（g/L）=93.75+6.71A+7.50B+4.16C-0.075AB-4.12AC+0.88BC-7.96A2-6.52B2-5.66C2。

中心組合設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果如表9所示。

表9 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析Table 9 Analysis of variance（ANOVA）for the quadratic model

該模型的F值為548.24，P值＜0.000 1，說明該模型具有高度顯著性。其中 A、B、C、AC、A2、B2、C2項(xiàng)的 P值均小于0.000 1，說明這些項(xiàng)均為顯著項(xiàng)。由可信度分析得該模型決定系數(shù)R2=99.8%，說明該模型能夠解釋99.8%的普魯蘭多糖產(chǎn)量的變化，回歸擬合程度好，可用此模型來預(yù)測(cè)發(fā)酵液中普魯蘭多糖產(chǎn)量的變化。

利用Design expert 8.0.6軟件對(duì)該回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面三維圖，如圖6、圖7、圖8所示。

圖6 牛肉粉和MgSO4·7H2O添加量的相互關(guān)系圖Fig.6 The response surface plots showing interaction between beef powder and MgSO4·7H2O addition amount

圖7 牛肉粉和K2HPO4添加量的相互關(guān)系圖Fig.7 The response surface plots showing interaction between beef powder and K2HPO4addition amount

圖8 K2HPO4和MgSO4·7H2O添加量的相互關(guān)系圖Fig.8 The response surface plots showing interaction between K2HPO4and MgSO4·7H2O addition amount

由圖 6～8可知，牛肉粉、MgSO4·7H2O 和 K2HPO4與普魯蘭多糖的產(chǎn)量存在顯著相關(guān)性，其中牛肉粉和K2HPO4對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響較為顯著。在一定范圍內(nèi)，隨著牛肉粉和K2HPO4添加量的增加，普魯蘭多糖的產(chǎn)量明顯增加。但隨著牛肉粉和K2HPO4添加量的進(jìn)一步增加，普魯蘭多糖產(chǎn)量會(huì)有不同程度的下降。由相應(yīng)的等高線圖可以看出，牛肉粉和K2HPO4、MgSO4·7H2O和K2HPO4的等高線圖呈橢圓形，交互作用顯著。牛肉粉和MgSO4·7H2O的等高線圖近乎圓形，交互作用不顯著。通過軟件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，當(dāng)A、B、C的編碼值分別為（4.17、0.76、8.58），即牛肉粉、MgSO4·7H2O和K2HPO4的濃度分別為 4.17 g/L、0.76 g/L和8.58 g/L時(shí)，響應(yīng)值Y（普魯蘭多糖產(chǎn)量）達(dá)最大值。此時(shí)，普魯蘭多糖的產(chǎn)量預(yù)測(cè)值為97.72 g/L。

為了驗(yàn)證優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基是否達(dá)到預(yù)期效果，以響應(yīng)面分析得到的最佳濃度組合及其他單因素最佳值進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)。優(yōu)化后多糖平均產(chǎn)量為97.60 g/L，與預(yù)測(cè)模型有較高的一致性，與優(yōu)化前相比多糖產(chǎn)量提高了26.8%。菌體量從之前的12.5 g/L提高到了18.6 g/L，較優(yōu)化前提高了48.8%。結(jié)果表明，優(yōu)化后的培養(yǎng)基更有利于普魯蘭多糖的合成和菌體量的積累。

3 結(jié)論

本研究以普魯蘭多糖產(chǎn)生菌株Aureobasidium pullulans CGMCC NO.3337為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外誘變后，得到1株高產(chǎn)普魯蘭多糖且穩(wěn)定性良好的突變株UV-10。利用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法分析，得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成（g/L）：蔗糖150，牛肉粉4.17，MgSO4·7H2O 0.76，K2HPO48.58，F(xiàn)eSO40.03，初始pH6.0。與較優(yōu)化前相比，普魯蘭多糖產(chǎn)量提高了48.8%。因此，菌株的誘變選育與發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化可有效提高普魯蘭多糖產(chǎn)量，這對(duì)于普魯蘭多糖的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了有一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。