響應(yīng)面法優(yōu)化天麻發(fā)酵液發(fā)酵工藝

陳剛，高晴，和勁松，羅艷霞，楊春蕾，盧文麗，錢瑞，付曉萍

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

天麻為蘭科植物，天麻的干燥塊莖又名赤箭、明天麻、定風(fēng)草根等[1-3]，屬于多年生寄生草本植物，主要分布在云南省[1-4]。天麻具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，常用于頭痛、肢體麻木等癥狀的治療[5]?，F(xiàn)代眾多藥理實驗及臨床應(yīng)用表明，天麻具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥的作用[5-8]，還能夠改善記憶、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力等[9-11]。

馬克斯克魯維酵母代謝底物十分廣泛[12-13]，可代謝的底物包括葡萄糖、菊芋、糖蜜、乳清和木質(zhì)纖維素等原料[12，14-16]。馬克斯克魯維酵母不僅具有生長迅速、耐熱性高、底物譜廣及能產(chǎn)多種酶等特點(diǎn)，而且具有較高的安全性[17-19]，2013年該酵母被中國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會批準(zhǔn)為新食品原料。由于馬克斯克魯維酵母在生長特性及某些營養(yǎng)特性方面與釀酒酵母類似[20-21]，并且在耐熱性及底物范圍等方面更具優(yōu)勢，其在食品工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[17]。

目前天麻的食用方式傳統(tǒng)且單一，以中藥炮制方式處理鮮天麻居多。天麻屬于藥食同源植物，經(jīng)微生物發(fā)酵可得到含有豐富活性物質(zhì)及功效酶的發(fā)酵產(chǎn)物[22-24]，微生物通過自身的新陳代謝，使原料中各成分之間發(fā)生多種復(fù)雜反應(yīng)，在產(chǎn)生新的活性物質(zhì)和功效酶的基礎(chǔ)上還可以一定限度地保留原有營養(yǎng)物質(zhì)[22，25-26]。本研究通過馬克斯克魯維酵母發(fā)酵鮮天麻，探索鮮天麻發(fā)酵的工藝條件，以期為天麻發(fā)酵液衍生產(chǎn)品的后續(xù)開發(fā)提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與菌種

烏天麻：產(chǎn)自云南省昭通市彝良縣小草壩，在4℃條件下貯藏備用；馬克斯克魯維酵母（ATCC 36534）：北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。

1.2 化學(xué)試劑

乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氯化鈉、葡萄糖淀粉酶（酶活≥50 000 U/g）、普魯蘭酶（酶活≥100 000 U/g）、纖維素酶（酶活≥100 000 U/g）、葡萄糖（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；麥芽汁液體培養(yǎng)基：環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

EU-K1-20TQ超純水器：南京歐鎧環(huán)境科技有限公司；DJM膠體磨：上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；BSA124SCW電子天平：德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；101HGZF電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；HH-8恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱：上海恒科學(xué)儀器有限公司；FE20 pH計：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 馬克斯克魯維酵母發(fā)酵天麻工藝流程

鮮天麻前處理→過膠體磨→酶解→調(diào)配→高溫滅菌（85℃，15 min）→接種發(fā)酵→過濾→發(fā)酵液。

1.4.2 工藝操作要點(diǎn)

鮮天麻前處理：選取新鮮、飽滿、無霉斑、未發(fā)芽的天麻，洗凈表皮的泥土，晾干表面水分之后與蒸餾水以 1∶1（g/mL）料液比打漿 3 min。

過膠體磨：打漿后的天麻汁顆粒比較大，需要利用膠體磨進(jìn)一步將大顆粒打磨細(xì)。將漿液過膠體磨3次，每次3 min。

酶解：基于天麻中淀粉含量較高，不利于微生物利用，因此選擇通過葡萄糖淀粉酶、普魯蘭酶、纖維素酶組成的復(fù)合酶（酶活比1∶1∶1）酶解天麻汁，酶解時間為180 min[27]。

調(diào)配：為獲得適合菌種發(fā)酵的pH值，采用碳酸氫鈉將天麻勻漿pH值調(diào)配至適合馬克斯克魯維酵母生長的條件。

高溫滅菌：將調(diào)配好的天麻勻漿置于85℃水浴條件下殺菌15 min，取出封口冷卻至室溫備用。

接種發(fā)酵：將低溫保藏的菌種于室溫融化，以1%接種量接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中活化增殖兩代，在無菌條件下將菌種濃度調(diào)整至7.30 lg（CFU/mL），隨后在無菌條件下，將固定濃度的馬克斯克魯維酵母種子液接種于滅菌完成并且冷卻至室溫的天麻勻漿液中，之后將其置于120 r/min、28℃的恒溫?fù)u床中搖瓶發(fā)酵。待發(fā)酵完成即得天麻發(fā)酵液[20]。

1.4.3 發(fā)酵工藝單因素試驗

1.4.3.1 發(fā)酵時間的確定

固定初始pH值為6.0、裝瓶量100 mL（250 mL）、菌液濃度7.30 lg（CFU/mL）、菌種添加量1%和發(fā)酵溫度 28℃，于 120 r/min 的搖床中分別發(fā)酵 6、12、18、24、30、36、42 h，以馬克斯克魯維酵母的活菌數(shù)作為評價指標(biāo)，選擇適宜的發(fā)酵時間。

1.4.3.2 菌種添加量的確定

固定初始pH值為6.0、裝瓶量100 mL（250 mL）、菌液濃度 7.30 lg（CFU/mL），分別添加 0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%的馬克斯克魯維酵母，于28℃、120 r/min的搖床中發(fā)酵36 h，以活菌數(shù)作為評價指標(biāo)，選擇適宜的菌種添加量。

1.4.3.3 初始pH值的確定

固定菌液濃度7.30 lg（CFU/mL）、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時間36 h、裝瓶量100 mL（250 mL）和菌種添加量1.25%，改變初始 pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5），以活菌數(shù)作為評價指標(biāo)，選擇適宜的初始pH值。

1.4.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

以單因素試驗為基礎(chǔ)，選取發(fā)酵時間、菌種添加量、初始pH值3個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗，以活菌數(shù)為響應(yīng)值，采取Design-Expert 8.0.6軟件對二次多項式方程進(jìn)行顯著性分析，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.5 數(shù)據(jù)處理

在數(shù)據(jù)分析過程中，采用Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用Design-Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果進(jìn)行分析，并使用Origin 2019進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 發(fā)酵時間對活菌數(shù)的影響

發(fā)酵時間對活菌數(shù)的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the viable count

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，馬克斯克魯維酵母的活菌數(shù)在18 h前增長較快，在18 h～36 h內(nèi)增長減緩，36 h以后活菌數(shù)趨于穩(wěn)定。說明馬克斯克魯維酵母發(fā)酵天麻勻漿期間，18 h前該菌處于對數(shù)生長期，之后逐漸生長減緩，到36 h以后處于穩(wěn)定期。對數(shù)期的菌種繁殖速率較快，有利于縮短發(fā)酵周期。穩(wěn)定期菌種數(shù)量最高，有利于收獲發(fā)酵產(chǎn)物[17，25]。因此，選擇發(fā)酵時間為30、36、42 h進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.2 菌種添加量對活菌數(shù)的影響

菌種添加量對活菌數(shù)的影響見圖2

圖2 菌種添加量對活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of inoculum amount on the viable count

由圖2可知，隨著菌種添加量的增加，天麻發(fā)酵液中活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，活菌數(shù)在馬克斯克魯維酵母的添加量為1.25%時達(dá)到最大值，之后隨著菌種添加量的提高活菌數(shù)迅速下降。造成此現(xiàn)象的原因可能是發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)含量一定時，當(dāng)菌種添加量較少時，可供菌種代謝的營養(yǎng)物質(zhì)相對充裕，菌種大量繁殖，伴隨著菌種添加量的增大，發(fā)酵液中可供菌種代謝的營養(yǎng)物質(zhì)不再充足甚至不足以支撐菌種代謝完成時，菌種的生長可能受到影響[25]。因此，選擇菌種添加量為1.00%、1.25%、1.50%進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.3 初始pH值對活菌數(shù)的影響

初始pH值對活菌數(shù)的影響見圖3。

圖3 初始pH值對活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of initial pH value on the viable count

由圖3可知，活菌數(shù)在初始pH4.0～5.0之間隨初始pH值增大處于增長狀態(tài)，之后伴隨初始pH值的提高，活菌數(shù)開始下降，活菌數(shù)在初始pH值為5.0時達(dá)到最大，造成此現(xiàn)象的原因可能是發(fā)酵基質(zhì)的初始pH值影響馬克斯克魯維酵母的生長、代謝及產(chǎn)物合成。初始pH值過低不利于菌株的生長，當(dāng)初始pH值過高時，菌株的生長也會受到影響從而生長變緩，導(dǎo)致活菌數(shù)變少，代謝能力減弱。當(dāng)初始pH值為5.0時，天麻發(fā)酵液中的馬克斯克魯維酵母活菌數(shù)最高，因此，選擇初始pH值為4.5、5.0、5.5進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計方案與結(jié)果

響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface design and results

2.2.2 建立回歸模型和方差分析

采用響應(yīng)面軟件對表2進(jìn)行統(tǒng)計分析后，得到活菌數(shù)的回歸方程：Y=8.45+0.31A-0.00749B-0.034C+0.12AB+0.020AC+0.027BC-0.18A2+0.068B2-0.14C2，對活菌數(shù)的回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

表3表明，活菌數(shù)的回歸模型顯著性結(jié)果顯示P＜0.01，為極顯著，表示擬合獲得的模型方程極顯著，說明試驗方法可靠，可用該模型對結(jié)果進(jìn)行分析預(yù)測。失擬項P=0.304 5＞0.05，不顯著，模型校正系數(shù)R2=0.985 9，R2Adj=0.960 6，說明模型回歸擬合度和可信度均較好，試驗誤差小。活菌數(shù)的回歸模型中一次項A，交互項AB及二次項A2、C2對活菌數(shù)的影響極顯著（P＜0.01），其余項不顯著（P＞0.05）。此外，通過 F 值大小可以得到各因素對活菌數(shù)的影響順序為發(fā)酵時間（A）＞菌種添加量（C）＞初始pH 值（B）。

2.2.3 響應(yīng)面因素交互分析

根據(jù)Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件獲得響應(yīng)值的3D曲面圖，分析各交互作用對天麻發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 各因素交互作用對天麻發(fā)酵活菌數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagram of the interactions of factors on the viable count in Gastrodia fermentation broth

由圖4可知，在探究發(fā)酵時間與初始pH值的交互作用時，當(dāng)發(fā)酵時間一定時，發(fā)酵液中的活菌數(shù)伴隨著初始pH值的增大呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，響應(yīng)面坡面變化陡峭，當(dāng)初始pH值固定時，活菌數(shù)伴隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，坡面變化陡峭，且等高線呈橢圓形，表明發(fā)酵時間與初始pH值的交互作用顯著；發(fā)酵時間與菌種添加量的交互作用，以及初始pH值與菌種添加量的交互作用的曲面圖則較為平緩。上述結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.2.4 驗證試驗

通過回歸模型對馬克斯克魯維酵母發(fā)酵天麻的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最適發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間42 h、菌種添加量1.26%、初始pH5.5，此條件下，天麻發(fā)酵液中活菌數(shù)預(yù)測值為8.764 lg（CFU/mL）。按照上述條件進(jìn)行3次平行驗證試驗，得到發(fā)酵液中活菌數(shù)為8.7 lg（CFU/mL），實際值與預(yù)測值結(jié)果基本一致，說明該模型基本復(fù)合預(yù)測實際情況的要求。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面法對馬克斯克魯維酵母發(fā)酵天麻的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化后的發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間42 h、菌種添加量1.26%、初始pH值為5.5，在此優(yōu)化條件下，天麻發(fā)酵液中的活菌數(shù)為8.7 lg（CFU/mL），與預(yù)測值結(jié)果基本一致，實測結(jié)果與回歸模型的相對誤差為0.73%，表明響應(yīng)面模型具備一定的可靠性，該模型可為天麻發(fā)酵工藝及其衍生產(chǎn)品的開發(fā)提供參考依據(jù)。