產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的發(fā)酵條件優(yōu)化

林楊，李雪，楚敏，唐琦勇，顧美英，譚慧林，孫建*，張志東*

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是動(dòng)物體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，由谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）催化谷氨酸（glutamic acid，L-Glu）或其鈉鹽脫羧而成[1]，具有鎮(zhèn)靜安神、抗焦慮、調(diào)節(jié)血壓、改善睡眠[2]、治療糖尿病及改善肝、腎臟功能[3]等多種生理功效，是一種新型功能性因子，2009年我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)其為新資源食品的生產(chǎn)原料之一[4]，并逐漸應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。因此，GABA的合成引起了人們的關(guān)注和重視。目前，GABA的制備方法主要有化學(xué)合成法、植物富集法和微生物發(fā)酵法，其中通過化學(xué)合成法和植物富集法得到的GABA存在安全性差、產(chǎn)量低及獲取難度大[5]等問題，相較而言，微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA具有條件溫和、安全性高、污染小[6]等優(yōu)點(diǎn)，成為主要的研究趨勢(shì)。現(xiàn)有研究表明，大腸桿菌、曲霉菌、酵母菌和乳酸菌等微生物均具有產(chǎn)GABA能力，其中乳酸菌作為食品安全級(jí)（generally recognized as safe，GRAS）微生物[7]，其發(fā)酵GABA產(chǎn)量相較于其他菌種普遍較高；同時(shí)相比于霉菌、大腸桿菌等可能產(chǎn)生毒素的微生物來說，乳酸菌的食品安全性更高[8]，極具發(fā)展?jié)摿?。因此，利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA已被公認(rèn)為安全、綠色的方法。

目前研究顯示，多數(shù)乳酸菌具有產(chǎn)GABA能力，如乳桿菌[9]、乳球菌[10]、鏈球菌[11]等，其中菌株多來源于酸奶等乳制品中，如高冬臘[12]從賽里木酸奶中獲得5株產(chǎn)GABA的乳酸菌，隸屬于糞腸球菌和徳氏乳桿菌保加利亞亞種；Ribeiro等[13]從奶酪中分離出8株GABA產(chǎn)量在300 mg/L以上的菌株，涉及OTakiensis乳桿菌屬、副干酪乳桿菌屬及植物乳桿菌屬，而對(duì)于戊糖乳植桿菌屬（Lactiplantibacillus pentosus，L.pentosus）產(chǎn)GABA的研究卻鮮有報(bào)道。L.pentosus多來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，較常用酸乳發(fā)酵劑如德式乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌等，其耐酸和耐膽鹽能力更強(qiáng)，進(jìn)入人體腸道后能夠更好地發(fā)揮益生作用，將高產(chǎn)GABA的L.pentosus應(yīng)用于功能性乳制品的開發(fā)，可進(jìn)一步提高乳品的益生性。此外，在利用乳酸菌發(fā)酵代謝GABA的過程中，不同的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件會(huì)對(duì)菌株的GAD活性產(chǎn)生影響[14]，且產(chǎn)物對(duì)菌株代謝有負(fù)反饋抑制等，導(dǎo)致乳酸菌發(fā)酵GABA產(chǎn)量仍相對(duì)較低。因此，探索乳酸菌發(fā)酵GABA的最適條件成為提高GABA生產(chǎn)效率的關(guān)鍵。

本研究旨在對(duì)前期從傳統(tǒng)酸乳中分離篩選獲得的L.pentosus Z6-15試驗(yàn)菌株的產(chǎn)GABA能力進(jìn)行研究，并通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高其GABA產(chǎn)量，為后續(xù)將產(chǎn)GABA乳酸菌應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)及功能性食品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L.pentosus Z6-15：新疆微生物資源保藏管理中心。

GABA 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.9%）、L-谷氨酸鈉（sodium hydrogen glutamate，L-MSG）、碳酸鈉、硼酸、硼砂、苯酚、次氯酸鈉（有效氯≥10.0%）、無水乙醇（均為分析純）：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-250BF）：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；立式冷藏柜（SC-316）：青島海爾股份有限公司；自動(dòng)高壓滅菌鍋（HVE-50）：日本HIRAYAMA公司；紫外分光光度計(jì)（UVZ2550）：日本島津儀器公司；TS恒溫振蕩器（TS-2102C）：德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D）：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)（PLCD）：德國(guó)Sigma公司。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)及產(chǎn)物測(cè)定

將MRS斜面保藏的乳酸菌Z6-15于MRS平板活化2代～3代后，取一環(huán)于MRS液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24 h，按4%接種量復(fù)接于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后，取10 mL發(fā)酵液于10000r/min、4℃條件下離心10min，取上清液于4℃保藏，備用。

GABA的測(cè)定：通過Berthelot比色法，繪制GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體參照梁慧[15]的方法。

菌體量的測(cè)定：采用分光光度計(jì)法。

葡萄糖的測(cè)定：采用硫酸-苯酚法[16]。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1 碳源的選擇

以MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以蔗糖19 g/L、乳糖19 g/L、麥芽糖20 g/L、可溶性淀粉19 g/L、糊精18 g/L替代葡萄糖20 g/L作唯一碳源，其中添加量以含碳量一致為原則，并設(shè)置MRS培養(yǎng)基作對(duì)照，考察不同種類碳源對(duì)菌株Z6-15的菌體量和GABA產(chǎn)量的影響。

1.4.2 氮源的選擇

以MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在最適碳源的條件下，有效含氮量按2 g/L進(jìn)行換算，分別以酵母粉+蛋白胨（N1），酵母粉+氯化銨（N2），酵母粉+硫酸銨（N3），蛋白胨+氯化銨（N4），蛋白胨+硫酸銨（N5），酵母粉+蛋白胨+氯化銨（N6），酵母粉+蛋白胨+硫酸銨（N7），酵母粉+蛋白胨+氯化銨+硫酸銨（N8）這8種組合，按同比例配比作復(fù)合氮源，考察不同組合氮源對(duì)菌株Z6-15的菌體量和GABA產(chǎn)量的影響。

1.4.3 Plackett-Burman優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用Design expert 8.0軟件，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的9種成分進(jìn)行分析。試驗(yàn)以GABA產(chǎn)量為響應(yīng)值，兩水平分別取原水平的±25%，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Plackett-Burman experimental design

1.4.4 響應(yīng)面分析

基于Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，以GABA產(chǎn)量為響應(yīng)值，對(duì)蛋白胨、L-MSG和初始pH值作三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。每組試驗(yàn)做3次平行，因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010、Design Expert 8.0、Origin 8.0、SPSS 20.0等數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行整理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線

基于OD645nm繪制的GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of GABA

由圖1可知，線性回歸方程：y=1.737x+0.083，R2=0.999 3。由此可見，在0.1 g/L～0.5 g/L內(nèi)，GABA的吸光值與其濃度具有良好的線性關(guān)系。在此條件下，取稀釋適當(dāng)倍數(shù)后的菌株發(fā)酵上清液0.8 mL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得菌株Z6-15的GABA產(chǎn)量為2.84 g/L。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 碳源的選擇

微生物利用碳源來為機(jī)體代謝活動(dòng)提供能量，而不同微生物的最適碳源則有所不同。不同種類碳源對(duì)菌株Z6-15的菌體量及GABA產(chǎn)量的影響見圖2。

圖2 不同碳源對(duì)菌株Z6-15產(chǎn)GABA及菌體量的影響Fig.2 Effects of different carbon on GABA production and biomass of strain Z6-15

由圖2可知，6種碳源對(duì)菌株Z6-15的菌體量和GABA產(chǎn)量的影響存在明顯的差異，其中葡萄糖作碳源時(shí)，菌株Z6-15的菌體量最高，且與其他碳源相比存在顯著性差異；同時(shí)葡萄糖價(jià)格低廉、易獲得，作為發(fā)酵原料可節(jié)約成本。因此，選擇葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

2.2.2 氮源的選擇

氮源在微生物代謝產(chǎn)物尤其是含氮代謝物的合成中起著至關(guān)重要的作用。微生物對(duì)不同氮源類型有不同的利用程度，對(duì)有機(jī)氮的利用程度遠(yuǎn)高于無機(jī)氮，且有機(jī)氮更利于代謝產(chǎn)物的形成。在以葡萄糖為最適碳源的基礎(chǔ)上，考察不同組合的復(fù)合氮源對(duì)菌株Z6-15的菌體量及GABA產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同組合氮源對(duì)菌株Z6-15產(chǎn)GABA及菌體量的影響Fig.3 Effects of different combined nitrogen on GABA production and biomass of strain Z6-15

由圖3可知，在以蛋白胨和酵母粉為組合氮源（N1）時(shí)，菌株Z6-15的菌體量和GABA產(chǎn)量最高，較其他組合具有顯著性差異；而添加無機(jī)氮源則不利于菌體的生長(zhǎng)和GABA的合成。這可能是由于有機(jī)氮源中的氮化物等物質(zhì)有助于細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，同時(shí)其富含的維生素可在一定程度上提高GAD活力。因此，選擇酵母粉和蛋白胨為發(fā)酵培養(yǎng)基的組合氮源。

2.2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)優(yōu)化分析

選用N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，對(duì)菌株發(fā)酵過程中的11個(gè)因素（9個(gè)實(shí)際因素、2個(gè)虛擬因素）進(jìn)行分析。試驗(yàn)以GABA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，其設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，各因素效應(yīng)見表4。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiment

表4 因素效應(yīng)Table 4 Effects of factors

由表 4可知，蛋白胨（B）、L-MSG（E）、初始 pH 值（G）對(duì)GABA產(chǎn)量的影響率分別為26.68%、18.91%、22.94%，其中蛋白胨對(duì)GABA產(chǎn)量的影響為正相關(guān)，即隨著其含量的增加GABA產(chǎn)量也增加；L-MSG和初始pH值則為負(fù)相關(guān)；而虛擬因素影響不大，可信度高。因此，選擇以上3個(gè)主要因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.4 響應(yīng)面分析

依據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)蛋白胨、L-MSG、初始pH值進(jìn)行5個(gè)中心點(diǎn)（17個(gè)試驗(yàn)）的分析。試驗(yàn)以GABA產(chǎn)量為響應(yīng)值，其設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5，回歸模型方差分析見表6。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and resuls of Box-Behnken experiment

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance

方差分析結(jié)果顯示，影響GABA產(chǎn)量的因素順序：L-MSG＞初始pH值＞蛋白胨。其中回歸模型P＜0.000 1，呈極顯著水平，決定系數(shù)R2=0.978 2；同時(shí)失擬項(xiàng) P=0.509 0＞0.05，R2Adj=0.950 3，說明模型擬合度良好，能夠反映響應(yīng)值的變化，可以用于發(fā)酵工藝的分析預(yù)測(cè)。其二次回歸方程：Y=3.88+0.19A+0.25B-0.21C-0.10AB+0.18AC+0.18BC-0.11A2-0.19B2-0.18C2。

2.2.5 響應(yīng)面及等高線圖解析

因素交互作用的響應(yīng)面分析見圖4。

圖4 交互因素的響應(yīng)面分析Fig.4 Response surface analysis of interaction factors

由圖4可知，在L-MSG為零水平時(shí)，最佳蛋白胨含量和初始pH值分別為11.5 g/L和5.49，此時(shí)兩者對(duì)GABA產(chǎn)量的影響較為顯著；在初始pH值和蛋白胨含量分別取零水平時(shí)，L-MSG對(duì)GABA產(chǎn)量的影響較大。在一定范圍內(nèi)，GABA產(chǎn)量與初始pH值成反比，這可能與GAD適宜酸性環(huán)境有關(guān)；同時(shí)從交互作用可以看出，在蛋白胨11.5 g/L、L-MSG 4.49 g/L、初始pH5.49條件下，GABA產(chǎn)量最高，為4.01 g/L。

2.2.6 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

數(shù)據(jù)分析表明，菌株的最佳發(fā)酵工藝：蛋白胨11.54 g/L、L-MSG 4.49 g/L、初始 pH 值 5.49，此條件下生成GABA的理論預(yù)測(cè)最大值為4.01 g/L。基于實(shí)際情況，選擇蛋白胨11.5 g/L、L-MSG 4.5 g/L、初始pH值5.5進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3批發(fā)酵試驗(yàn)實(shí)測(cè)GABA產(chǎn)量分別為 3.99、3.92、3.96 g/L，平均產(chǎn)量 3.96 g/L，較預(yù)測(cè)值接近度達(dá)98.75%。

2.3 發(fā)酵過程曲線

菌株Z6-15發(fā)酵GABA的過程曲線見圖5。

圖5 菌株Z6-15發(fā)酵GABA的過程曲線Fig.5 Process curve of GABA fermentation by strain Z6-15

從菌株發(fā)酵GABA的過程曲線可知，0～4 h為菌株的生長(zhǎng)延遲期，4 h～16 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此后則為穩(wěn)定期。同時(shí)，從菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物形成的關(guān)系看，在菌體主要生長(zhǎng)階段（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期），葡萄糖被大量消耗，菌體量迅速增加，但合成GABA較少；而當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，GABA大量生成。

3 討論與結(jié)論

GABA作為一種天然的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有多種生理活性，目前通過微生物發(fā)酵就可方便地得到GABA。其中，乳酸菌因其良好的益生特性及食用安全性，是目前生產(chǎn)GABA的主要菌株。然而從自然界初篩獲得的乳酸菌合成GABA的能力往往較低，約為0.3 g/L～2 g/L左右，因此優(yōu)良菌株的篩選成為了開發(fā)GABA的重要任務(wù)。此外，利用乳酸菌發(fā)酵合成GABA，菌體的生長(zhǎng)狀況及其代謝產(chǎn)物的積累，均取決于發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵培養(yǎng)條件，合適的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及濃度配比有利于菌體的生長(zhǎng)代謝，因此有必要對(duì)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高其GABA產(chǎn)量。

本研究利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響乳酸菌L.pentosus Z6-15產(chǎn)GABA的發(fā)酵條件進(jìn)行篩選，最終得到蛋白胨、L-MSG、初始pH值3個(gè)影響較大的因素，這一結(jié)果與王冰聰[17]、司闊林等[18]的研究較為相近；同時(shí)響應(yīng)面3D圖及其等高線模型顯示，初始pH值和L-MSG含量對(duì)GABA產(chǎn)量的影響呈現(xiàn)極顯著作用。其中L-MSG作為菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA的底物，提高其含量有助于GABA的生成，而過量的L-MSG又會(huì)使發(fā)酵過程中的pH值上升，導(dǎo)致GABA產(chǎn)量降低。相關(guān)研究表明，GAD的最適pH值為4.0～6.0，此范圍有利于GABA的合成，同時(shí)又可抑制GABA的分解[19]；而pH值的升高則會(huì)使L-Glu的脫羧作用減弱，導(dǎo)致GABA的分解加快。如李歡等[20]在研究植物乳桿菌14發(fā)酵GABA的條件過程中，發(fā)現(xiàn)pH值為6.0時(shí)，菌株的菌體量及GABA產(chǎn)量達(dá)到最高值，而隨著pH值的升高，GABA產(chǎn)量逐漸降低；李理等[21]探索植物乳桿菌DNC75017產(chǎn)GABA的最適條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌株在初始pH值為4.65時(shí)產(chǎn)GABA能力最強(qiáng)。因此，試驗(yàn)通過設(shè)定目標(biāo)響應(yīng)值，最終得到菌株發(fā)酵的最優(yōu)參數(shù)：葡萄糖20 g/L、酵母粉 10 g/L、蛋白胨 11.5 g/L、L-MSG 4.5 g/L、K2HPO42 g/L、無水乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.2 g/L、吐溫-80 0.1%、初始 pH值 5.5，接種量 4%、裝添量 175 mL、37℃、160 r/min、發(fā)酵時(shí)間72 h。此條件下得到GABA產(chǎn)量為3.96 g/L，較優(yōu)化前提高了39.63%，與預(yù)測(cè)值4.01 g/L的接近度為98.75%，擬合度較好。

乳酸菌在發(fā)酵過程中，菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成并不一定是同步的[22]。菌株Z6-15發(fā)酵GABA的過程曲線表明，0～16 h為菌體主要生長(zhǎng)階段，此時(shí)葡萄糖被大量消耗，但合成GABA較少；而當(dāng)菌株進(jìn)入穩(wěn)定期，即16 h以后，GABA開始大量合成，即菌體代謝生長(zhǎng)和GABA生成存在一定的滯后性。這一結(jié)果與Yogeswara等[23]的研究相一致，而與曾林等[24]研究的植物乳桿菌BC114培養(yǎng)24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，GABA在發(fā)酵40 h后激增，在72 h達(dá)到最大值而有所不同，說明不同種類的菌種其生產(chǎn)周期和培養(yǎng)特性存在差異。

本研究的開展，為后續(xù)開發(fā)L.pentosus Z6-15的發(fā)酵乳制品，并將該菌株用于乳品工業(yè)中生產(chǎn)具有功能因子的乳酸菌飲品等提供一定的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為研制和開發(fā)富含GABA的相關(guān)功能性食品奠定理論基礎(chǔ)。