羧基化纖維素納米晶制備工藝優(yōu)化及其性能表征

李利玲，呂肖瑞，王文秀，孫劍鋒，馬倩云，王頡

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

近年來，由于Pickering乳液具有穩(wěn)定性好、無毒無害、對環(huán)境友好等優(yōu)點[1]，在食品、醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域的研究受到了越來越多的關(guān)注。其中影響Pickering乳液性質(zhì)的主要因素是固體顆粒。目前，固體顆粒主要包括淀粉、纖維素等多糖、蛋白質(zhì)和無機(jī)粒子等[2]。纖維素與其他一些高分子固體顆粒相比，具有更豐富的尺寸分布，對于Pickering乳液的穩(wěn)定效果影響顯著[3]。以纖維素為固體顆粒的Pickering乳液具有提高穩(wěn)定性、生物相容性和安全性等優(yōu)點，尤其是纖維素納米晶（cellulose nanocrystals，CNCs）具有高強(qiáng)度、高結(jié)晶度、巨大的比表面積、極好的穩(wěn)定性及生物降解性等優(yōu)異性能[4-8]。因此，CNCs作為固體顆粒穩(wěn)定劑在Pickering乳液中具有廣泛的應(yīng)用前景。

無機(jī)酸水解法是研究最早和最商業(yè)化的制備CNCs的方法，用到的酸有硫酸[9]、硝酸[10]、鹽酸[11]等。采用強(qiáng)酸水解纖維素會導(dǎo)致設(shè)備嚴(yán)重腐蝕，酸廢水難以處理和回收。此外，由于硫酸水解引入硫酸基，所得CNCs熱穩(wěn)定性較低，難以進(jìn)一步功能化[12]。采用氧化法，如過硫酸銨氧化降解[13]和 2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物（TEMPO）氧化反應(yīng)[14]已被用于制備羧基化CNCs，但是容易氧化不完全，穩(wěn)定性差，殘留的金屬離子降低CNCs的吸附性能。最新研究表明采用可回收無毒無害的檸檬酸水解也可以制備羧化度好、分散性好的CNCs[15]。檸檬酸是一種無毒無害的有機(jī)酸，與其他用于CNCs生產(chǎn)的酸相比，實驗方法較溫和。此外，檸檬酸作為一種三羧酸類化合物，可以提供很多途徑與纖維素進(jìn)行酯化反應(yīng)，并在纖維素表面釋放更多的羧基。這些負(fù)電荷將提供一些靜電斥力，有利于CNCs懸浮液具有更好的穩(wěn)定性。超聲破碎處理產(chǎn)生的剪切力可以增強(qiáng)陰離子帶電羧基CNCs的分離，更好地分散懸浮液中的單個CNCs顆粒。同時，超聲空化作用能夠在長度上碎裂羧基化CNCs顆粒，有利于降低粒徑。因此，超聲處理常用于制備納米顆粒。但是目前缺乏超聲輔助檸檬酸水解制備羧基化CNCs的具體工藝研究。

基于此，本文采用超聲輔助檸檬酸水解的方法制備羧基化CNCs，通過單因素試驗，研究了各因素對羧基化CNCs羧基含量的影響，包括液料比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，再通過響應(yīng)面法對各因素間的相互關(guān)系進(jìn)行研究，確定制備羧基化CNCs的最優(yōu)工藝條件。并利用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、X 射線衍射 （X-ray diffraction，XRD）、透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）和固體核磁共振波譜（solid state nuclear magnetic resonance spectroscopy，13C-NMR） 對羧基化CNCs的光譜特征、晶體結(jié)構(gòu)、形貌以及反應(yīng)位點進(jìn)行分析和研究。該研究將為檸檬酸制備羧基化CNCs提供理論依據(jù)，同時也為羧基化CNCs作為Pickering乳液固體顆粒穩(wěn)定劑的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微晶纖維素（白色粉末，分子量162.06 Da，CAS：9004-34-6）：北京索萊寶生物科技有限公司；一水合檸檬酸（檸檬酸）、鹽酸、碳酸氫鈉、氯化鈉（均為分析純）：上海展云化工有限公司。甲基紅（分析純）：浙江天諾化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電動攪拌器（OES-40M）：常州崢嶸儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)（Neofuge 15R）：上海力申科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（LDO-101-5）：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)：諸城市天順機(jī)械有限公司；電熱恒溫水溫箱（H.SWX-600BS）：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；超聲波分散儀（SCIENTZ-F）：寧波新芝生物科技股份有限公司；近紅外光譜儀（VERTEX 70v）、X 射線衍射儀（D2 Phaser）、固體核磁共振儀（Brucker 400M）：德國Bruker公司；透射電子顯微鏡（JEOL JEM 2100F）：日本電子株式會社；納米粒度及Zeta電位分析儀（Malvern Zetasizer Nano ZS90）：馬爾文儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羧基化納米纖維素的制備

稱取3.0 g的微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC），分散于一定量的檸檬酸（3 mol/L）溶液中，以6 mol/L鹽酸（20%，體積分?jǐn)?shù)）為催化劑置于250 mL的燒瓶中機(jī)械攪拌進(jìn)行水解，設(shè)置不同溫度和時間，所得懸浮液用蒸餾水反復(fù)離心洗滌至中性。然后，將懸浮液在超聲細(xì)胞破碎機(jī)（1 400 W）中處理30 min，獲得羧基化CNCs水溶液，最后，將其真空冷凍干燥24 h得到羧基化CNCs粉末。

1.3.2 CNCs羧基含量的測定

根據(jù)TAPPIT237cm-08《美國紙漿與造紙工業(yè)技術(shù)協(xié)會：紙漿的羧基含量》，采用滴定法測定CNCs的羧基含量[16]。準(zhǔn)確稱取0.5g樣品于燒杯中，加入50mL濃度為0.10 mol/L的HCl溶液后以300 r/min速度于室溫下攪拌2h。用蒸餾水徹底清洗混合物，直至濾液pH值達(dá)到6～7。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的濕漿餅于50mLNaHCO3/NaCl溶液（0.010 mol/L，摩爾比為 1∶1）的燒杯中，室溫下繼續(xù)以300r/min分散1h。之后，用真空泵進(jìn)行抽濾，取25mL濾液備用，以甲基紅為指示劑，然后用0.010 mol/L的HCl溶液進(jìn)行滴定。按式（1）計算羧基含量。

式中：B為滴定25 mL的NaHCO3/NaCl溶液消耗的0.010 mol/L鹽酸的用量，mL；A為滴定25 mL濾液消耗的0.010 mol/L鹽酸的用量，mL；m為濕漿餅中的水的質(zhì)量，g；N為0.010 mol/L鹽酸的實際滴定濃度，mol/L；W為烘箱干燥樣品的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

通過滴定法測定CNCs的羧基含量，按照1.3.1的工藝條件制備CNCs，根據(jù)表1列出的因素水平表進(jìn)行單因素試驗分析。當(dāng)選取某個因素試驗時，其他因素水平固定為：液料比 50∶1（mL/g），反應(yīng)溫度 80 ℃，反應(yīng)時間 4 h。

表1 單因素試驗設(shè)計Table 1 Design of single factor experiment

1.3.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化制備條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert軟件的Box-Behnken設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，具體試驗因素和水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 FTIR測試

準(zhǔn)確稱量2 mg樣品，并將其與200 mg干溴化鉀粉末混合。用壓片機(jī)將其壓為透明片，以進(jìn)行FTIR檢測。設(shè)置分辨率為 4 cm-1，掃描范圍為 4 000 cm-1～400 cm-1。

1.3.6 XRD測試

將MCC、CNCs粉末放入X射線衍射儀的衍射槽內(nèi)進(jìn)行測試，掃描范圍為 10°～80°，掃描速率為 5°/min。采用Segal公式（2）計算樣品的相對結(jié)晶度（crystallinity index，CI）。

式中：I200代表 2θ=22.7°的衍射峰強(qiáng)度；Iam代表2θ=18 °的衍射峰強(qiáng)度。

1.3.7 TEM測試

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CNCs懸浮液超聲處理后，用膠頭滴管將1滴～2滴CNCs分散液滴在銅網(wǎng)上，采用TEM對樣品進(jìn)行觀察。

1.3.8 粒度和Zeta電位分析

將制備好的CNCs稀釋到一定濃度。采用納米粒度及Zeta電位分析儀測定粒度和Zeta電位，設(shè)置折射率為1.361。

1.3.913C-NMR分析

將MCC、CNCs粉末放在ZrO轉(zhuǎn)子上，通過固體核磁共振波譜儀進(jìn)行測定。自旋速率為10kHz，回收時間為4 s，預(yù)掃描延遲為6.5 μs，質(zhì)子共振頻率為125 MHz。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗采用Origin2018、SPSS26.0等軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計和分析，以P≤0.05的Duncan法進(jìn)行顯著性分析。每個試驗進(jìn)行3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 液料比對CNCs羧基含量的影響

液料比對CNCs羧基含量的影響如圖1所示。

圖1 液料比對CNCs羧基含量的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on carboxyl content of CNCs

從圖1可以看出，當(dāng)液料比低于50:1（mL/g）時，CNCs羧基含量隨著液料比的增加呈現(xiàn)顯著增加的趨勢（P＜0.05），在 50∶1（mL/g）時，CNCs羧基含量最大為1.18 mmol/g。其原因是檸檬酸溶液相對微晶纖維素較少，導(dǎo)致與MCC酸水解反應(yīng)的反應(yīng)位點較少，從而使得水解反應(yīng)不充分[17]。但當(dāng)液料比超過 50∶1（mL/g），CNCs羧基含量隨液料比增加呈顯著降低的趨勢（P＜0.05）。這是由于檸檬酸溶液能夠完全接觸MCC表面，從而加速了水解反應(yīng)，甚至?xí)?dǎo)致酯化反應(yīng)在酸性條件下發(fā)生水解[18]，從而使CNCs羧基含量顯著降低。因此，液料比選擇 50∶1（mL/g）為最佳。

2.1.2 反應(yīng)時間對CNCs羧基含量的影響

反應(yīng)時間對CNCs羧基含量的影響如圖2所示。

圖2 反應(yīng)時間對CNCs羧基含量的影響Fig.2 Effect of reaction time on carboxyl content of CNCs

從圖2可以看出，當(dāng)反應(yīng)時間在2 h～4 h時，CNCs羧基含量隨著反應(yīng)時間的延長呈現(xiàn)顯著增加的趨勢（P＜0.05）。在反應(yīng)時間為4 h時，CNCs羧基含量達(dá)到最大值1.19 mmol/g，這可能是由于MCC與檸檬酸溶液接觸不充分，水解反應(yīng)進(jìn)行不完全，而隨著反應(yīng)時間的延長使得酯化反應(yīng)形成更多的羧基，但當(dāng)反應(yīng)時間超過4 h時，會使纖維素過度降解為葡萄糖等糖類物質(zhì)[20]，從而導(dǎo)致 CNCs羧基含量顯著降低（P＜0.05）。因此，反應(yīng)時間選擇4 h為最佳。

2.1.3 反應(yīng)溫度對CNCs羧基含量的影響

反應(yīng)溫度對CNCs羧基含量的影響如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對CNCs羧基含量的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on carboxyl content of CNCs

從圖3可以看出，當(dāng)反應(yīng)溫度在50℃～80℃時，隨溫度的升高CNCs羧基含量呈現(xiàn)顯著增加的趨勢（P＜0.05）。在80℃時，CNCs羧基含量達(dá)到了最大值1.20 mmol/g。這是由于纖維素的無定形區(qū)分子鏈排列無序，較松弛，分子間距離較大。故溫度升高能夠使檸檬酸最先進(jìn)入無定形區(qū)反應(yīng)，使得CNCs羧基含量顯著增加。由于纖維素進(jìn)一步水解為葡萄糖，也會導(dǎo)致一些非結(jié)晶區(qū)的長鏈葡萄糖部分?jǐn)嗔裑19]，故CNCs羧基含量隨溫度的增加無顯著變化（P＞0.05）。因此，反應(yīng)溫度選擇80℃為最佳。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert軟件中的Box-Behnken進(jìn)行試驗設(shè)計，選定液料比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間3個因素的水平范圍，以CNCs羧基含量為響應(yīng)值Y。試驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

2.2.2 模型的建立與檢驗結(jié)果

利用Design-Expert軟件將表3中的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，方差分析如表4所示。

表4 Box-Behnken設(shè)計分析Table 4 Analysis of Box-Behnken design

由表 4可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1）；失擬項不顯著（P=0.198 5＞0.05）。線性相關(guān)系數(shù)R2和模型調(diào)整決定系數(shù)R2Adj都可以表示響應(yīng)面回歸方程的擬合優(yōu)度，本試驗?zāi)Ｐ偷南嚓P(guān)系數(shù)值R2=0.992 1，R2Adj=0.981 9表明模型擬合度較好。

由表4中的P值可知，因素A、B，交互項AB以及A2、B2、C2對 CNCs羧基含量的影響極顯著（P＜0.01），交互項BC對CNCs羧基含量的影響顯著（P＜0.05）。由F值可以得出3個因素對CNCs羧基含量的影響順序為：B＞A＞C，即反應(yīng)時間＞液料比＞反應(yīng)溫度。根據(jù)Design-Expert軟件對響應(yīng)值CNCs羧基含量進(jìn)行方差分析，模擬出回歸方程為Y=1.18+0.015A-0.044B+8.750×10-3C-0.020AB+0.000AC+0.018BC-0.087A2-0.090B2-0.040C2。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

利用Design-Expert軟件得出各因素間交互作用的響應(yīng)面3D圖及等高線圖，結(jié)果如圖4所示。

圖4 兩因素交互作用對納米纖維素羧基含量的影響Fig.4 Effect of interaction of two factors on the content of nanocellulose carboxyl

在此試驗中選擇的范圍具有極值，即響應(yīng)曲面的最高點和等高線最小橢圓的中心點。響應(yīng)曲面圖在響應(yīng)曲面圖中，響應(yīng)面曲線越陡，說明該因素對響應(yīng)值影響越大，反之亦然；在等高線圖中，橢圓表示因素之間交互作用越顯著，對響應(yīng)值影響也就越顯著，圓形則表示因素間交互作用不顯著，對響應(yīng)值影響也就不顯著[21]。

由圖4a中的響應(yīng)曲面圖可知，當(dāng)反應(yīng)溫度一定時，隨著液料比和反應(yīng)時間的增加，CNCs羧基含量都呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢；由等高線圖可以看出，等高線圖呈橢圓形，說明A（液料比）和B（反應(yīng)時間）兩因素之間的交互作用顯著且對CNCs羧基含量影響顯著（P＜0.01），這與方差分析結(jié)果一樣。由圖4b中的響應(yīng)曲面圖可得，當(dāng)反應(yīng)時間固定時，隨著液料比的增加，CNCs的羧基含量先增加后減少；隨著反應(yīng)溫度的升高，CNCs的羧基含量先增加后略有降低；從等高線圖可知，等高線圖呈圓形，說明A（液料比）和C（反應(yīng)溫度）之間的交互作用不顯著。由圖4c中的響應(yīng)面圖可以看出，當(dāng)液料比不變時，隨著反應(yīng)時間的增加，CNCs的羧基含量先升高后降低；隨著反應(yīng)溫度的升高，CNCs的羧基含量開始增加，然后有輕微的降低趨勢。從圖4c中可以清楚地看出，反應(yīng)時間曲線比反應(yīng)溫度更為陡峭，說明反應(yīng)時間對CNCs羧基含量的影響比反應(yīng)溫度的影響更顯著；從等高線圖可以看出，等高線圖的形狀是橢圓形的，表明B（反應(yīng)時間）和C（反應(yīng)溫度）之間的相互作用顯著，對CNCs的羧基含量有顯著影響（P＜0.05）。

2.2.4 驗證試驗

通過回歸方程計算與分析預(yù)測出的最優(yōu)制備條件為液料比 51.15∶1（mL/g），反應(yīng)溫度 80.54 ℃，反應(yīng)時間3.75 h，預(yù)測得出的最高CNCs羧基含量為1.19 mmol/g。考慮到實際操作情況，將上述各因素水平調(diào)整為液料比 51∶1（mL/g），反應(yīng)溫度 80 ℃，反應(yīng)時間 3.75 h 進(jìn)行3次平行試驗，得CNCs羧基含量為1.18 mmol/g，與預(yù)測值接近，說明分析結(jié)果可靠。

2.3 FTIR結(jié)果分析

樣品MCC和CNCs的FTIR光譜如圖5所示。

圖5 樣品MCC和CNCs的FTIR光譜圖Fig.5 FTIR spectra of MCC and CNCs samples

從圖5中可以看出，MCC和CNCs均在3 342、2 890、1 635、1 164、1 060 cm-1處有吸收峰。3 342 cm-1處出現(xiàn)由O—H拉伸振動產(chǎn)生的吸收峰；2890cm-1處的吸收峰來自于C—H對稱拉伸；1635cm-1附近對應(yīng)的是CC雙鍵的拉伸振動吸收峰；1 164 cm-1和1 060 cm-1附近產(chǎn)生的吸收峰來源于纖維素分子的C—C骨架伸縮振動和C—O伸縮振動[22]，表明CNCs保持了MCC的基本骨架結(jié)構(gòu)。但從圖中可以看出，在CNCs的1 735 cm-1處出現(xiàn)了一個新的峰，即CO的吸收峰。證明了MCC的羥基與檸檬酸的羧基反應(yīng)，形成CO的化學(xué)結(jié)構(gòu)，表明成功制備出羧基化CNCs。

2.4 XRD結(jié)果分析

樣品MCC和CNCs的XRD光譜如圖6所示。

圖6 樣品MCC和CNCs的XRD譜圖Fig.6 XRD spectra of MCC and CNCs samples

從圖6可以看出，MCC和CNCs均有3個衍射峰且衍射峰的位置基本保持一致，分別在16.2°、22.6°、34.7°處對應(yīng)的是纖維素的100、200、004衍射面，這是典型的纖維素I型結(jié)構(gòu)[23]。表明檸檬酸酸解MCC的過程中，纖維素的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。結(jié)晶度通過Segal方法計算，得出CNCs的結(jié)晶度為74.06%，高于MCC結(jié)晶度69.07%。這是因為酸解反應(yīng)過程中，檸檬酸無法進(jìn)入MCC結(jié)構(gòu)致密的結(jié)晶區(qū)，主要發(fā)生在排列無序的無定形區(qū)，從而提高了結(jié)晶區(qū)域的占比，使得CNCs結(jié)晶度增加。

2.5 TEM、粒徑分布及Zeta電位結(jié)果分析

CNCs的透射電鏡圖、粒度分布以及Zeta電位如圖7所示。

圖7 CNCs的透射電鏡和粒度分布圖以及Zeta電位Fig.7 Transmission electron microscopy，particle size distribution and Zeta potential of CNCs

根據(jù)圖7（a）CNCs的透射電鏡結(jié)果可以看出，試驗制備的CNCs呈短棒狀，顆粒分散均勻，直徑約在10 nm～30 nm，長度約在80 nm～200 nm，這是因為纖維素經(jīng)過超聲破碎處理后，使其由原來的微米減小到納米尺寸。由圖7（b）可知，CNCs的粒度主要集中在350 nm～400 nm，少量分布在20 nm～30 nm，說明制備的CNCs達(dá)到了納米尺寸。由圖7（c）的結(jié)果能夠看出CNCs的Zeta電位為-39.8 mV，表明得到的CNCs懸浮液具有較好的穩(wěn)定性。

2.6 13C-NMR結(jié)果分析

樣品MCC和CNCs的13C-NMR如圖8所示。

圖8 樣品MCC和CNCs的13C-NMRFig.8 13C-NMR spectra of MCC and CNCs samples

由于13C-NMR能夠確定纖維素分子上各種碳的位置和分子的構(gòu)型、構(gòu)象[24]，因此可以進(jìn)一步研究水解反應(yīng)發(fā)生的位置。由圖8可知，樣品的吸收信號主要在化學(xué)位移 δ為 50×106～120×106，MCC 和 CNCs都呈現(xiàn)了典型的纖維素核磁信號吸收峰?；瘜W(xué)位移δ為105.8×106、89.5×106和 66.1×106分別歸屬于纖維素的C1、C4 和 C6 的共振特征峰[25]；70×106～80×106的峰對應(yīng)的是纖維素的C2、C3和C5，它們在糖環(huán)上不與糖苷鍵連接[26]；CNCs在化學(xué)位移 δ為 43.7×106、173.2×106附近的特征信號峰是由檸檬酸的亞甲基（C8，C11）、羧酸羰基（C10，C12）和檸檬酸的酯基（C7）產(chǎn)生的。說明MCC經(jīng)過檸檬酸酸解后得到的羧基化CNCs的反應(yīng)位點主要是在C6位置。

3 結(jié)論

本研究采用超聲輔助檸檬酸水解MCC制備羧基化CNCs，綜合單因素試驗和響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到制備CNCs的最佳工藝條件為液料比51∶1（mL/g），反應(yīng)時間3.75 h，反應(yīng)溫度80℃，CNCs的羧基含量最大為1.18 mmol/g。并對MCC和CNCs進(jìn)行表征，從FTIR圖得出制備的羧基化CNCs在1 735 cm-1處出現(xiàn)CO基團(tuán)，表明檸檬酸成功接枝在MCC表面；XRD表明其典型的纖維素Ⅰ型結(jié)晶結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變，結(jié)晶度為74.06%，跟MCC相比有所提高。由TEM圖和粒徑分布可以看出羧基化CNCs呈短棒狀，直徑為10 nm～30 nm，長度為80 nm～200 nm，平均粒度為358 nm；從13CNMR圖譜看，MCC和檸檬酸之間發(fā)生了酯化反應(yīng)，且檸檬酸主要是與MCC上的C6發(fā)生了反應(yīng)。本文制備的羧基化CNCs可為穩(wěn)定Pickering乳液的應(yīng)用提供參考。