黑參皂苷的提取純化及其對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

郭曉萌，魏婷，張焱

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

人參，為五加科植物人參的干燥根，具有抗腫瘤[1]、降血糖[2]、提高免疫力[3]、抗炎[4]等多種活性，最具藥理活性的成分是人參皂苷[5]，其中人參皂苷Rg3、Rb1、Rh2等具有抗腫瘤活性。黑參是人參的新炮制品，在傳統(tǒng)方法中，黑參是通過(guò)九蒸九曬制成的。調(diào)查者明確指出，加工后的生曬參不僅色澤改變，而且有效成分及藥理作用也發(fā)生了變化，主要是在制備過(guò)程中形成了稀有皂苷，因此黑參有更強(qiáng)的生物活性[6]。除此之外，黑參還有抗氧化[7]、調(diào)節(jié)心血管功能[8]等作用。因此黑參的發(fā)展?jié)摿艽蟆?/p>

胃癌是世界第四大癌癥。早期胃癌由于癥狀不明顯而被患者忽視，所以絕大多數(shù)患者到胃癌中晚期才被確診且五年生存率很低[9]。幽門螺桿菌感染、飲食、煙酒是胃癌發(fā)病的主導(dǎo)因素[10]。由于其他治療方法對(duì)人體的副作用大，所以急需研究對(duì)人體傷害低、副作用小的抗癌天然藥物。

細(xì)胞凋亡途徑有兩種：外源型和內(nèi)源型途徑。前者是通過(guò)線粒體膜電位的降低，Cyt-C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，活化半胱氨酸蛋白酶Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。后者是通過(guò)刺激關(guān)鍵跨膜死亡受體家族成員（如Fas蛋白），進(jìn)一步激活起始蛋白Caspase-8和執(zhí)行者蛋白Caspase-3，最終導(dǎo)致凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12]。研究表明一些化療藥物可以同時(shí)引起細(xì)胞外源性和內(nèi)源性凋亡[13]。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh4能調(diào)節(jié)Cdk4和Cyclin D1的表達(dá)，使SW480細(xì)胞停滯在G0/G1期，并通過(guò)改變Caspase-3，8，9的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。另外，對(duì)大鼠的主要器官進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示，Rh4對(duì)大鼠的器官無(wú)明顯損害。

人參皂苷具有多種生物活性，且稀有皂苷在自然界的含量很少，只能通過(guò)不同的制備方法或者轉(zhuǎn)化方法獲得，具有極高的利用價(jià)值。因此，本研究以生曬參為原料制備黑參，提取黑參皂苷，并進(jìn)行純化，研究其對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響，旨在探究黑參皂苷的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生曬參：北京同仁堂國(guó)藥有限公司，參齡5年，大小一致；MGC-803、HepG2、J82、SPC-A1 細(xì)胞：北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基：美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；凋亡試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、異硫氰酸熒光黃（Annexin-V-FITC）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、Tris-HCl緩沖鹽溶液 （TBS）、吐溫 20（Tween20）、ECL Plus發(fā)光劑：北京索萊寶生物科技有限公司；血清：上海李記生物科技有限公司；Bax、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9、BCl-2：武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-30-SCIEX5600+）：島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；流式細(xì)胞儀（BD FACSCaliber）：美國(guó) BD 公司；電泳儀（164-5050）：美國(guó)伯樂(lè)公司；酶標(biāo)儀（Synergy HTX）：美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑參的制備

黑參制備工藝流程：生曬參→100℃蒸制5 h→100℃～102℃蒸制4 h→103℃～105℃蒸制4 h→106℃～108℃蒸 3 h→50℃取出→（50±2）℃干燥至水分含量＜12%。

1.3.2 黑參皂苷的提取及純化

1.3.2.1 黑參皂苷的提取

采用乙醇超聲輔助法提取黑參皂苷[15]，工藝流程：將黑參用粉碎機(jī)打成粉末，過(guò)80目篩，加入70%乙醇溶液，固液比 1∶40（g/mL），超聲 80 min（功率 1 000 W）。離心留上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味后將溶液凍干即為黑參皂苷。

1.3.2.2 D101大孔吸附樹脂純化黑參皂苷

D101大孔樹脂經(jīng)預(yù)處理后使用。上樣：稱取黑參皂苷2 g，加一定的超純水溶解后，用過(guò)濾器過(guò)濾去除雜質(zhì)以防堵住樹脂柱，然后以100 mL/h流速流穿樹脂柱，多次反復(fù)上樣，直至飽和吸附。洗脫：先用超純水洗脫色素雜質(zhì)，然后分別用200 mL 20%、40%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液依次沖洗吸附在樹脂中的皂苷，收集至每個(gè)離心管里，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥各組皂苷。

1.3.3 人參皂苷含量的測(cè)定

采用香草醛-硫酸比色法測(cè)定皂苷含量：準(zhǔn)確稱取一定量的人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶液溶解，使?jié)舛葹?0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。稱取一定量的樣品用甲醇溶解，使?jié)舛葹?.5 mg/mL。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品0.5 mL加入對(duì)應(yīng)試管，然后在試管中分別加入0.5 mL 8%的香草醛和5 mL 77%的硫酸，60℃下水浴20 min。同時(shí)設(shè)置空白組（蒸餾水代替樣品）。酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)得吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)

1.3.4.1 液相色譜條件

色譜柱為 C18（150 mm×2.5 mm，5 μm），柱溫為35℃，流速為0.3 mL/min，流動(dòng)相比例見表1。

表1 流動(dòng)相比例Table 1 Mobile phases ratio

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。ESI源條件：霧化氣壓（Gas 1）為50 psi（1 psi=6.895 kPa），輔助氣壓（Gas 2）為50 psi，氣簾氣（curtain gas，CUR）為 25 psi，離子源溫度 450℃，離子源電壓4400V，質(zhì)譜掃描范圍為100Da～1 200 Da，質(zhì)量掃描范圍為50Da～1000Da，質(zhì)譜累計(jì)時(shí)間0.2 s，離子累計(jì)時(shí)間0.01 s，二級(jí)質(zhì)譜采用信息依賴獲取方式（information dependent acquisition，IDA）獲得，并采用高分辨模式，去簇電壓（declustering potential，DP）±60 V，激發(fā)碰撞電壓（35±15）eV。

1.3.5 MTT法測(cè)細(xì)胞活性

將細(xì)胞置于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)。取細(xì)胞，接種于96孔板。用不同濃度（0～300 μg/mL）的皂苷培養(yǎng)液分別處理細(xì)胞 24、48、72 h，處理后分別加入 50 μL MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕吸去上清150 μL，每孔再加入150 μL DMSO溶液，搖床振蕩15 min，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)得OD值。

1.3.6 Hoechst 33258染色檢測(cè)黑參皂苷對(duì)MGC-803細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)變化

將狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板，并用不同濃度（100、150、200 μg/mL）黑參皂苷和對(duì)照組（未加黑參皂苷）處理細(xì)胞24 h。將每孔漂浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)離心管，其余貼壁細(xì)胞加入0.5 mL胰酶消化，等待細(xì)胞變圓后加1 mL培養(yǎng)液終止消化，移入對(duì)應(yīng)的離心管，在1 200 r/min速度下離心5 min。細(xì)胞沉淀用Hoechst 33258染液重新懸浮，37℃，避光30 min，倒置熒光顯微鏡進(jìn)行拍攝[16]。

1.3.7 Annexin V-FITC/PI雙染測(cè)定黑參皂苷誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡

處理細(xì)胞及收集細(xì)胞步驟見1.3.6。向細(xì)胞沉淀加入緩沖液500 μL，Annexin V-FITC染色液和PI溶液各5 μL?；旌媳芄?5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.8 黑參皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞線粒體膜電位的影響

處理細(xì)胞及收集細(xì)胞步驟見1.3.6。向細(xì)胞沉淀加入50 μL羅丹明123溶液，37℃30 min，生理鹽水洗3次后流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位水平。

1.3.9 黑參皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影響

處理細(xì)胞及收集細(xì)胞步驟見1.3.6。向細(xì)胞沉淀加入2 mL 2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）20 min。每隔 5 min混勻1次，使其混合更加充分。最后用生理鹽水洗3次后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的ROS水平。

1.3.10 Western Blot檢測(cè)MGC-803細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

處理細(xì)胞及收集細(xì)胞步驟見1.3.6。收集細(xì)胞后加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，與上樣緩沖液混合后煮沸5 min使其變性，然后存放于-80℃冰箱。用12%的分離膠分離蛋白后轉(zhuǎn)印在PVDF膜上，并把膜放入含有5%封閉液的孵育盒中封閉2 h。然后分別加入一抗（Bax、Bcl-2、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9）4 ℃過(guò)夜，1×TBST（TBS+Tween20）沖洗 15 min，共兩次。二抗孵育（稀釋比例 1∶5 000）2 h，用 1×TBST 緩沖液洗滌膜3次，每次洗10 min，最后將膜置于ECL Plus發(fā)光劑中顯影定影。拍照后分析計(jì)算相對(duì)灰度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，用GraphPad Prism進(jìn)行顯著性分析和誤差分析，若p＜0.05則代表具有顯著性，用Prism8.0.2作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑參皂苷純化前后的含量對(duì)比

人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ginsenoside Re

由圖1可知，純化前的皂苷含量為52.43%，推測(cè)是由于用70%乙醇提取皂苷，使提取物中含有色素、少部分多糖、脂溶性雜質(zhì)等成分，影響了黑參皂苷的純度。為了提高皂苷的含量，在對(duì)比其他型號(hào)的樹脂后，選用D101大孔樹脂進(jìn)行純化，不同濃度乙醇洗脫液中皂苷含量見圖2。

圖2 各洗脫液黑參皂苷含量Fig.2 Content of black ginseng saponins in each eluent

由圖 2可知，20%、40%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇洗脫液中黑參皂苷含量分別為13.66%、20.1%、54.76%、74.56%、93.55%、39.87%和30.98%。開始洗脫時(shí)（乙醇濃度20%～60%），因色素、多糖等雜質(zhì)的存在，皂苷含量較少；隨著乙醇梯度洗脫（乙醇濃度70%～80%），雜質(zhì)被洗脫，含量逐漸減少，皂苷含量隨之升高；當(dāng)乙醇濃度達(dá)到90%～100%時(shí)，樹脂吸附的皂苷已洗脫完全，含量逐漸降低。最后將70%～80%這一階段的洗脫液混合、旋蒸、凍干，并檢測(cè)其皂苷含量為89.02%。相對(duì)于純化前皂苷含量52.43%，純化后的含量提升了36.59%。D101大孔樹脂具有無(wú)毒無(wú)害、高解吸率、快速等特點(diǎn)，對(duì)提取和純化黑參皂苷有良好的效果。

2.2 黑參和人參皂苷的化學(xué)成分

LC-MS能快速、精確地測(cè)定人參皂苷的主要成分。Sun等[17]檢測(cè)黑參中19種人參皂苷，其中Rg6、Rk3、Rg3、Rg5等為稀有人參皂苷，有較強(qiáng)的抗癌活性。通過(guò)LC-MS分析并鑒定黑參和人參皂苷的化學(xué)成分，總離子流圖如圖3所示。

圖3 黑參皂苷和人參皂苷總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of black ginseng saponins and ginsenosides

通過(guò)高分辨質(zhì)譜保留時(shí)間和多級(jí)碎片離子的分析，初步推斷出黑參皂苷中含有14種人參皂苷類成分，分別為 Rg3、Rb3、Ro、Rb1、F3、Rb2、Re、F1、Rh1、Rf、Rg2、Rh2、Rg5、CK，而人參皂苷中含有 5 種，分別為 RO、Re、Rb2、F1、Rf，具體質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表 2 和表 3。

表2 黑參皂苷質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 2 Mass spectrometry data of black ginseng saponins

表3 人參皂苷質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 3 Mass spectrometry data of ginsenosides

由表2和表3可知，二者的不同之處在于黑參皂苷比人參皂苷多 9 種皂苷，如：Rg3、Rh1、Rh2、Rg5、CK等，其中Rg3和Rg5是稀有皂苷。推測(cè)是由于高溫條件下制備黑參時(shí)，可能發(fā)生了以下反應(yīng)。

1）C-20位糖苷鍵發(fā)生水解反應(yīng)

含糖基較多的原生皂苷變?yōu)榇紊碥?，?yōu)先脫去原人參二醇或原三醇型皂苷C-20位的糖基，如：蒸制干燥過(guò)程中人參皂苷Re在C-20位脫去一分子葡萄糖，轉(zhuǎn)化為Rg2。人參皂苷Re在C-6位末端脫去一分子鼠李糖，轉(zhuǎn)化為Rg1，Rg1在C-20位脫去一分子葡萄糖化為Rh1。二醇組皂苷C-20位上的糖鏈全部脫掉，C-3位糖鏈末端被水解，一部分生成Rg3，Rg3進(jìn)一步發(fā)生水解反應(yīng)生成Rh2[18]。人參皂苷Rb1在C-20位末端脫去一分子葡萄糖，轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd，人參皂苷Rd在C-20位末端脫去一分子葡萄糖，轉(zhuǎn)化為Rg3[19]。

2）羥基脫水反應(yīng)

苷元的C-12和C-20位羥基脫水生成雙鍵結(jié)構(gòu)[20]。如：Rg3在C-20位羥基脫水縮合形成雙鍵生成Rg5。

3）丙二酸單?；撊シ磻?yīng)

人參皂苷在高溫條件下會(huì)水解脫去丙二酸。生曬參中的丙二酸單?；藚⒃碥帐軣岚l(fā)生水解反應(yīng)，生成了相應(yīng)的人參皂苷 Rc、Rd、Rb1、Rb2。

這些反應(yīng)使得原級(jí)皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷。稀有皂苷在自然界中含量較少，具有獨(dú)特的使用價(jià)值，稀有皂苷可能使黑參有更強(qiáng)的生物活性。

2.3 黑參皂苷對(duì)細(xì)胞增殖的抑制情況

采用MTT法對(duì)黑參皂苷進(jìn)行體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其對(duì) MGC-803、HepG2、J82、SPC-A1 細(xì)胞 24 h的抑制率，比較黑參皂苷對(duì)4種癌細(xì)胞的活性。結(jié)果如表4所示。

表4 黑參皂苷對(duì)4種癌細(xì)胞的IC50值Table 4 IC50 of black ginseng saponins against four kinds of cancer cells μg/mL

由表4可知，黑參皂苷對(duì)4種癌細(xì)胞的IC50值不同，其中，對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的IC50最小，說(shuō)明對(duì)此細(xì)胞的抑制作用最明顯。所以決定使用胃癌MGC-803細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，研究凋亡機(jī)制。人參皂苷（a）與黑參皂苷（b）對(duì)MGC-803細(xì)胞活性的影響見圖4。

圖4 人參皂苷與黑參皂苷對(duì)MGC-803細(xì)胞活性的影響Fig.4 Effect of ginsenosides and black ginseng saponins on viability of MGC-803 cells

由圖4可知，人參皂苷和黑參皂苷對(duì)MGC-803細(xì)胞均有抑制作用，細(xì)胞存活率隨劑量的提升呈下降趨勢(shì)，且各個(gè)濃度在給藥24、48、72 h后的細(xì)胞存活率均隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降。人參皂苷24 h的IC50為 296.64 μg/mL，48 h 的 IC50為 266.46 μg/mL，72 h的IC50為188.40 μg/mL；而黑參皂苷 24 h的IC50為141.25 μg/mL，48 h 的 IC50為 120.23 μg/mL，72 h 的 IC50為95.50 μg/mL。以上結(jié)果表明黑參皂苷對(duì)MGC-803細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制作用。抑制率均具有時(shí)間-劑量依賴性，并呈現(xiàn)出時(shí)間-劑量關(guān)系。

2.4 Hoechst 33258染色觀察黑參皂苷對(duì)MGC-803細(xì)胞核變化情況

Hoechst 33258是一種藍(lán)色熒光染液，它能穿過(guò)細(xì)胞膜，在凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染[21]。

由圖5可知，對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)淡藍(lán)色熒光，染色質(zhì)在核仁內(nèi)分布均勻。當(dāng)用黑參皂苷處理胃癌MGC-803細(xì)胞時(shí)，由于染色質(zhì)聚集和細(xì)胞核固縮，分裂成很多的核碎片，所以細(xì)胞發(fā)出亮藍(lán)色熒光[22]。并且隨著黑參皂苷濃度的增加，亮藍(lán)色熒光也隨之增強(qiáng)。經(jīng)150 μg/mL和200 μg/mL黑參皂苷處理的細(xì)胞亮藍(lán)色熒光強(qiáng)度高于其余處理組。Hoechst 33258染色結(jié)果代表著黑參皂苷誘導(dǎo)胃癌MGC-803細(xì)胞核發(fā)生改變，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

圖5 Hoechst 33258染色熒光顯微鏡拍照（400倍）Fig.5 Nuclei of MGC-803 under fluorescence microscope（400 ×）（Hoechst 33258 staining）

2.5 Annexin V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

黑參皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的影響見圖6。

圖6 黑參皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of black ginseng saponins on apoptosis of gastric cancer MGC-803 cells

如圖6所示，隨著黑參皂苷濃度的增加，早期、晚期凋亡的細(xì)胞明顯增多，說(shuō)明黑參皂苷對(duì)MGC-803細(xì)胞有凋亡影響。早期凋亡由0.02%增長(zhǎng)到12.7%，晚期凋亡由0.21%增長(zhǎng)到54.26%，總凋亡率由0.23%增長(zhǎng)到66.96%（p＜0.001）。這一結(jié)果與唐立等[23]研究人參皂苷對(duì)SNU-1細(xì)胞有凋亡作用的結(jié)論一致。證明了在黑參皂苷作用下，MGC-803細(xì)胞發(fā)生凋亡的事實(shí)。

2.6 黑參皂苷通過(guò)降低線粒體膜電位促使細(xì)胞凋亡

線粒體膜電位的變化反映了線粒體的功能，與細(xì)胞凋亡有重要聯(lián)系，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最早的一種不可逆的變化，發(fā)生比DNA斷裂更早。這種改變可以導(dǎo)致細(xì)胞膜的滲透，并導(dǎo)致Cyt-C的釋放[24]。羅丹明123（rhodamine 123，Rh123）的熒光強(qiáng)度代表著線粒體膜電位的改變，并與染色的熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)[25]。黑參皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞線粒體膜電位的影響見圖7。

圖7 黑參皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.7 Effect of black ginseng saponins on mitochondrial membrane potential of gastric cancer MGC-803 cells

Rh123的變化代表細(xì)胞凋亡的程度。趙嘉琪等[25]研究表明，人參皂苷CK能使肝癌細(xì)胞的線粒體膜電位降低。由圖7可知，與對(duì)照組相比，Rh123的強(qiáng)熒光細(xì)胞比例從97.04%下降到23.45%（p＜0.001），隨黑參皂苷劑量的增大而降低。說(shuō)明細(xì)胞與Rh123的結(jié)合能力降低，即線粒體膜電位下降，是一種不可逆的變化，這表明細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生凋亡，細(xì)胞凋亡的比例也隨黑參皂苷濃度升高，進(jìn)一步證實(shí)了黑參皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的影響是通過(guò)線粒體途徑促使細(xì)胞凋亡。

2.7 黑參皂苷通過(guò)ROS途徑誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡

ROS在腫瘤發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用，ROS能增加線粒體膜的通透性使其氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26]。因此，活性氧水平在細(xì)胞凋亡過(guò)程中也起著重要作用。

李曼玲等[27]研究表明，人參皂苷Rg3能通過(guò)ROS途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了研究MGC-803細(xì)胞凋亡是否和ROS有關(guān)，進(jìn)行了ROS實(shí)驗(yàn)。活性氧熒光探針（DCFHDA）可被標(biāo)記在細(xì)胞內(nèi)，隨著濃度升高，凋亡細(xì)胞增加。黑參皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞ROS水平的影響見圖8。

圖8 黑參皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞ROS水平的影響Fig.8 Effect of black ginseng saponins on ROS level in gastric cancer MGC-803 cells

由圖8可知，隨著黑參皂苷劑量的增加，峰明顯向右平移，表明熒光探針的熒光強(qiáng)度逐步升高，黑參皂苷濃度為200 μg/mL時(shí)，ROS水平為74.65%，與對(duì)照組相比呈明顯上升趨勢(shì)（p＜0.001）。說(shuō)明當(dāng)細(xì)胞不能有效地除去產(chǎn)生的ROS，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化。細(xì)胞膜被破壞，線粒體膜通透性增加，導(dǎo)致了線粒體功能受損，從而引起凋亡。這與李曼玲等[27]研究結(jié)果一致，DCFH-DA染色實(shí)驗(yàn)再次證明了黑參皂苷可以誘導(dǎo)胃癌MGC-803細(xì)胞中生成大量ROS并在細(xì)胞內(nèi)累積，導(dǎo)致細(xì)胞損傷從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.8 黑參皂苷通過(guò)改變相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)促使MGC-803細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是由多種蛋白緊密調(diào)控的。Bcl-2是一種可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和保持線粒體膜完整的抗凋亡基因，可防止細(xì)胞凋亡[28-29]，Bax則可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[30]。因此，當(dāng)細(xì)胞開始凋亡時(shí)，不同的細(xì)胞凋亡蛋白可以轉(zhuǎn)移到線粒體中，造成細(xì)胞膜通透性的下降。線粒體膜對(duì)H+的滲透作用增強(qiáng)，使線粒體膜電位下降[30]。進(jìn)而使Cyt-C釋放，引發(fā)Caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終凋亡。Caspase家族分為3類：凋亡起始、凋亡效應(yīng)[31]和炎癥Caspase[32]，其中凋亡起始和效應(yīng)是通過(guò)起始Caspase激活下游效應(yīng)Caspase引發(fā)凋亡。Caspase-3是凋亡執(zhí)行中最關(guān)鍵的一環(huán)，其主要依靠Cyt-C的釋放。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了 Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9 蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖9。

圖9 黑參皂苷對(duì)MGC-803細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effect of black ginseng saponins on the expression of apoptosis-related proteins in MGC-803 cells

如圖9所示，經(jīng)Image J軟件分析得知：與β-actin相比，Bax、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9 表達(dá)量增加，Bcl-2的表達(dá)量減少。說(shuō)明在一定濃度下，黑參皂苷能顯著提高Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)量，并降低Bcl-2的表達(dá)量。

已有文獻(xiàn)證明人參皂苷可通過(guò)線粒體途徑使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，如熊明華[33]證實(shí)了人參皂苷Rg3能降低Bcl-2的表達(dá)量，促進(jìn)Bax的表達(dá)，從而誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡。Wang等[34]結(jié)果表明：人參皂苷CK對(duì)膀胱腫瘤T24細(xì)胞有顯著的抑制作用，經(jīng)CK處理后的細(xì)胞Bcl-2表達(dá)量降低，而Bax、Procaspase-3和Procaspase-9表達(dá)量提高。Gu等[35]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rd能促進(jìn)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡，其機(jī)制是通過(guò)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)量以及上調(diào)Caspase-3的表達(dá)量使細(xì)胞凋亡。

因此推斷黑參皂苷作用于胃癌MGC-803細(xì)胞時(shí)，Bax轉(zhuǎn)移至線粒體中，造成線粒體膜的通透性下降，從而使H+的滲透作用增強(qiáng)，線粒體膜電位下降、Cyt-C釋放，進(jìn)而引發(fā)Caspase-3和Caspase-9級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)胃癌MGC-803發(fā)生凋亡。

3 結(jié)論

將生曬參在高溫高濕條件下制成黑參，采用乙醇超聲輔助法提取、D101大孔樹脂純化皂苷，利用LCMS對(duì)人參和黑參中的皂苷類成分進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)黑參中含有14種單體皂苷，而人參中含有5種。人參不含 Rg3、Rh1、Rh2、Rg5、CK 等單體皂苷?？赡苁怯捎谠谥苽浜趨⒌倪^(guò)程中普通皂苷在高溫高濕的條件下發(fā)生糖苷鍵水解、羥基脫水等反應(yīng)轉(zhuǎn)化為稀有皂苷。黑參皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的抑制作用比人參皂苷更強(qiáng)，其凋亡機(jī)制是通過(guò)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的改變進(jìn)而導(dǎo)致線粒體膜電位變低，釋放Cyt-C，活化半胱氨酸蛋白酶家族成員細(xì)胞Caspase-9及凋亡執(zhí)行蛋白酶Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有助于黑參的進(jìn)一步開發(fā)與利用，為人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展作出貢獻(xiàn)。