江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因的克隆和表達(dá)分析

張藝欣， 段 菲， 樊 潔， 符卉卉， 顧佳怡， 蘭佳欣， 李 嬌

(1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西上饒 334001； 2.上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西上饒 334001；3.上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西上饒 334001；4.上饒市薯芋類作物種質(zhì)保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西上饒 334001)

江西鉛山紅芽芋(ColocasiaesculentaL. Schoot var.cormosus‘Hongyayu’)為天南星科芋屬多子芋類型草本宿根植物，為江西省鉛山縣“兩紅”(紅芽芋和河紅茶)產(chǎn)業(yè)之一，2013年4月15日被核準(zhǔn)為國家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品，其肉白芽紅，營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細(xì)嫩，口感細(xì)松滑，糯香可口，是藥食兼優(yōu)、老幼皆宜的上好滋補(bǔ)佳品[1-2]。當(dāng)植物處于逆境時(shí)，適度積累蔗糖可保證細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性，避免胞內(nèi)外相關(guān)蛋白的降解，還可作為逆境脅迫下植物代謝所需能量的來源[3]。作為蔗糖代謝過程中的關(guān)鍵酶，蔗糖合成酶主要負(fù)責(zé)植物組織細(xì)胞壁成分或淀粉合成的調(diào)控，直接參與植物的生長發(fā)育過程[4]。因此，克隆江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因并檢測其組織表達(dá)特異性，對(duì)于了解江西鉛山紅芽芋糖類代謝及其品質(zhì)形成具有重要意義。目前，對(duì)紅芽芋的研究主要集中在營養(yǎng)成分[5]、品質(zhì)選育[6]、種植栽培[7]、組織培養(yǎng)[8]等方面。紅芽芋的淀粉含量較高，且淀粉顆粒細(xì)小，易被消化[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖合成酶的功能主要是參與淀粉的合成[9]。目前，關(guān)于紅芽芋蔗糖合成酶基因同源克隆和表達(dá)特性分析的研究還未見報(bào)道，關(guān)于紅芽芋蔗糖合成酶cDNA序列及其在紅芽芋不同組織器官中如何表達(dá)、如何參與紅芽芋淀粉的合成等問題尚待解決。本研究通過江西鉛山紅芽芋試管苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選到江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因的核心片段，通過設(shè)計(jì)簡并引物，用RT-PCR方法克隆江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶的編碼基因，并對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析蔗糖合成酶編碼基因在江西鉛山紅芽芋不同器官(根、莖和葉)、不同球莖膨大時(shí)期(初期、中期和末期)的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究蔗糖合成酶基因功能及代謝途徑奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為江西鉛山紅芽芋蔗糖代謝和生長發(fā)育提供較為豐富有效的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

江西鉛山紅芽芋單芽在MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個(gè)月，形成球莖膨大初期的完整試管苗；在MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4個(gè)月，形成球莖膨大中期的完整試管苗；在MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)6個(gè)月，形成球莖膨大末期的完整試管苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第1鏈的合成 2020年8月，參試劑盒說明書，用TRIzol提取江西鉛山紅芽芋試管苗的總RNA，RNA濃度和完整性用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。以提取的RNA作為模版，參照試劑盒(M-MLV cDNA第1鏈的合成)說明書進(jìn)行cDNA第1鏈的合成。以O(shè)ligo(dT)18 Primer作為逆轉(zhuǎn)錄引物(引物序列：5′-G G C C A C G C G T C G A C T A G T A C T T T T T T T T T T T T T T T T T T-3′)。

1.2.2 蔗糖合成酶基因的克隆 江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶的轉(zhuǎn)錄組Unigene序列信息為TRINITY_DN8401_c0_g1，引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，F(xiàn)：5′-A T G C C G G A A C G C C A G C T G A-3′；R：5′-T C A C T T C T C A T A G A T A C G C T T C A G G-3′。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，57.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測后，將含有目的基因的條帶與pMD19-T載體連接，并用熱激法將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α中，對(duì)鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 蔗糖合成酶基因的生物信息學(xué)分析 用BioEdit軟件將基因序列翻譯為氨基酸序列，用 ProtParam預(yù)測酶的理化性質(zhì)，用ProtScale預(yù)測酶的疏/親水性，用GOR軟件在線預(yù)測酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL在線預(yù)測酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，用WoLF PSORT在線預(yù)測基因的表達(dá)部位。通過DNAMAN和BioEdit軟件進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)，用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.4 蔗糖合成酶基因的組織表達(dá)分析 取在MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個(gè)月的江西鉛山紅芽芋完整試管苗根、莖、葉以檢測蔗糖合成酶基因在不同器官中的表達(dá)情況；取江西鉛山紅芽芋在MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個(gè)月(球莖膨大初期)、4個(gè)月(球莖膨大中期)和6個(gè)月(球莖膨大末期)的完整試管苗的試管球莖以檢測蔗糖合成酶基因在球莖膨大不同時(shí)期的表達(dá)情況。以上材料各提取得到500 ng RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過熒光定量PCR(qRT-PCR，SYBR Green I)檢測得出，其內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。設(shè)計(jì)引物(F：5′-G C C C C G T C T T A T T C A T A C C C T C G-3′；R：5′-C A T G C T T T T C C C A T T T T G T C C T C A-3′)。qRT-PCR檢測采用20 μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)蔗糖合成酶基因組織表達(dá)的差異顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因的cDNA序列

對(duì)江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因cDNA總長度為2256bp(圖2)，G+C含量為56.21%(圖3)。

2.2 江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶的氨基酸序列

通過ProtParam預(yù)測，得出江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶的氨基酸序列(圖4)。江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶由751個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為 85 350.64 u，等電點(diǎn)為5.83，為親水性蛋白。各氨基酸的數(shù)目和占比如下：丙氨酸(Ala，A)，47個(gè)，占比6.3%；精氨酸(Arg，R)，44個(gè)，占比5.9%；天冬酰胺(Asn，N)，32個(gè)，占比4.3%；天冬氨酸(Asp，D)，40個(gè)，占比5.3%；半胱氨酸(Cys，C)，10個(gè)，占比1.3%； 谷氨酰胺(Gln，Q)，26個(gè)，占比3.5%；谷氨酸(Glu，E)，60個(gè)，占比8.0%；甘氨酸(Gly，G)，51個(gè)，占比6.8%；組氨酸(His，H)，29個(gè)，占比3.9%；異亮氨酸(Ile，I)，41個(gè)，占比5.5%；亮氨酸(Leu，L)，86個(gè)，占比11.5%；賴氨酸(Lys，K)，36個(gè)，占比4.8%；甲硫氨酸(Met，M)，16個(gè)，占比2.1%；苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))，36個(gè)，占比4.8%；脯氨酸(Pro，P)，37個(gè)，占比4.9%；絲氨酸(Ser，S)，38個(gè)，占比5.1%；蘇氨酸(Thr，T)，32個(gè)，占比4.3%；色氨酸(Trp，W)，8個(gè)，占比1.1%；酪氨酸(Tyr，Y)，27個(gè)，占比3.6%；纈氨酸(Val，V)，55個(gè)， 占比7.3%。帶負(fù)電殘基總數(shù)(Asp+Glu)為100個(gè)，正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為80個(gè)。估計(jì)半衰期：30 h(哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外)>20 h(酵母，體內(nèi))>10 h(大腸桿菌，體內(nèi))。經(jīng)計(jì)算， 江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶失穩(wěn)指數(shù)(Ⅱ)為35.94，表明其在分類上屬于穩(wěn)定蛋白。

2.3 江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶親疏水性的分析

圖5中高峰值(正值)區(qū)域表示疏水區(qū)域，而負(fù)值的“低谷”區(qū)域是親水區(qū)域。疏水性結(jié)果顯示，最大疏水值為2.5左右，說明在該多肽中該處的疏水性最強(qiáng)；親水峰最大值為-2.5左右，整個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出高度的親水性，說明該蛋白為親水性蛋白。

2.4 江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)預(yù)測如下：根據(jù)GOR預(yù)測結(jié)果，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋(alpha helix，占比36.88%)、β-片層(extended strand，占比16.91%)、無規(guī)則卷曲(random coil，占比46.21%)構(gòu)成(圖7)。從分布位點(diǎn)上來看，C端主要含有無規(guī)則卷曲和α-螺旋，N端主要含有無規(guī)則卷曲和β-片層，無規(guī)則卷曲、β-片層和 α-螺旋散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

2.5 江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指整條多肽鏈的三維空間結(jié)構(gòu)，也就是包括碳骨架、側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子的空間排列。SWISS-MODEL是一款用同源建模法預(yù)測蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的全自動(dòng)在線預(yù)測軟件，共有3個(gè)工作方式：First Approach mode、Alignment Interface mode、Project(Optimise)mode。SWISS-MODEL預(yù)測結(jié)果顯示，江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)為同源四聚體，詳見圖8。

2.6 江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶的亞細(xì)胞定位

用WoLF PSORT在線軟件對(duì)江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測，圖9結(jié)果顯示，定位于細(xì)胞質(zhì)中的蔗糖合成酶基因數(shù)量為6個(gè)，定位于線粒體中的蔗糖合成酶基因數(shù)量為4.5個(gè)，定位于細(xì)胞質(zhì)_線粒體中的蔗糖合成酶基因數(shù)量為3個(gè)，定位于葉綠體中的蔗糖合成酶基因數(shù)量為1個(gè)，定位于細(xì)胞骨架_質(zhì)膜中的蔗糖合成酶基因數(shù)量為1個(gè)，表明江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因主要存在細(xì)胞質(zhì)中。

2.7 江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從構(gòu)建的進(jìn)化樹(圖10)可以看出，江西鉛山紅芽芋與芋(Colocasiaesculenta)、眼子菜(Potamogetondistinctus)在一個(gè)大分支下，說明江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶在進(jìn)化上與C.esculentahypothetical protein Taro_012658(MQL80204_c0_g1)、P.distinctussucrose synthase(BAE06059.1)的親緣關(guān)系較近，特別是與C.esculentahypothetical protein Taro_012658(MQL80204_c0_g1)具有最高的親緣關(guān)系。

2.8 江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶同源蛋白序列的比對(duì)結(jié)果

江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶同源蛋白的序列比對(duì)信息見圖11，其中的“※”號(hào)區(qū)域是該蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域。由圖11可知，江西鉛山紅芽芋與芋(Colocasiaesculenta)、眼子菜(Potamogetondistinctus)的同源性較高，再次說明江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶在進(jìn)化上與C.esculentahypothetical protein Taro_012658(MQL80204_c0_g1)、P.distinctussucrose synthase(BAE06059.1)的親緣關(guān)系較近，特別是與C.esculentahypothetical protein Taro_012658(MQL80204_c0_g1)具有最高的親緣關(guān)系。

2.9 江西鉛山紅芽芋不同器官及球莖膨大不同時(shí)期蔗糖合成酶基因的表達(dá)分析

以江西鉛山紅芽芋的GAPDH為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因在江西鉛山紅芽芋不同器官中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，但在不同組織器官中的表達(dá)情況差異顯著(圖12)，其中江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因在根、球莖膨大初期的相對(duì)表達(dá)量最高。

3 討論

植物光合作用的主要產(chǎn)物為蔗糖，植物經(jīng)光合作用形成蔗糖后通過葉片源源不斷地向庫器官(塊根、塊莖、球莖、鱗莖等)輸送，到達(dá)庫器官后直接或間接參與其生理代謝進(jìn)程，從而進(jìn)一步影響植株的生長發(fā)育和產(chǎn)量調(diào)控[10]。蔗糖到達(dá)庫器官后不能直接被細(xì)胞吸收利用，必須依靠蔗糖轉(zhuǎn)化酶或蔗糖合成酶的作用將其分解后才能參與植物的代謝活動(dòng)[11]。因此，蔗糖合成酶是蔗糖代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，主要影響植物細(xì)胞之間的碳水化合物分配及碳水化合物的結(jié)構(gòu)組成和貯藏[12]。蔗糖合成酶分解蔗糖活性的強(qiáng)弱與植物淀粉貯藏器官庫強(qiáng)度密切相關(guān)，包括植物的變態(tài)根、變態(tài)莖等[13]。在江西鉛山紅芽芋中，蔗糖是葉片光合碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和分配的主要形式，是江西鉛山紅芽芋球莖淀粉合成的初始原料。本試驗(yàn)利用同源克隆技術(shù)成功克隆了江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因序列，該基因cDNA總長度為2 256 bp，G+C含量為56.21%；江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶由751個(gè)氨基酸組成，分子量為85 350.64 u，等電點(diǎn)為5.83，為親水性蛋白；江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋(36.88%)、β-片層(16.91%)、無規(guī)則卷曲(46.21%)構(gòu)成，三級(jí)結(jié)構(gòu)為同源四聚體；江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶主要存在于細(xì)胞質(zhì)、線粒體中，在進(jìn)化上與C.esculenta、P.distinctus的親緣關(guān)系較近，尤其是與C.esculentahypothetical protein Taro_012658(MQL80204_c0_g1)在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖合成酶基因在植物中具有組織特異性和時(shí)間特異性。白及蔗糖合成酶基因的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，蔗糖合成酶基因在葉片中的表達(dá)量最高，在塊莖中的表達(dá)量最低；成熟葉片的表達(dá)量高于未成熟葉片的表達(dá)量[14]。半定量RT-PCR分析結(jié)果表明，蔗糖合成酶基因HbSS1、HbSS2在巴西橡膠樹各組織器官中均有表達(dá)，其中蔗糖合成酶基因HbSS1在葉中的表達(dá)量最高，蔗糖合成酶基因HbSS2在樹皮中的表達(dá)量最高[15]。蔗糖合成酶基因組織表達(dá)特異性分析結(jié)果顯示，SoSuS1在甘蔗熱帶種Badila莖、葉鞘、葉片中均有表達(dá)，且SoSuS1在甘蔗熱帶種Badila莖中的表達(dá)量最高[16]。實(shí)時(shí)定量PCR表達(dá)分析結(jié)果顯示，蔗糖合成酶LbSusy基因在枸杞莖中的表達(dá)量最高，在根中的表達(dá)水平較低[17]。半定量RT-PCR表達(dá)分析結(jié)果表明，蔗糖合成酶基因PhSUS在蝴蝶蘭的組織中均有表達(dá)，在花蕾發(fā)育中后期、成熟花和花器官的表達(dá)量都比營養(yǎng)階段根、葉中的表達(dá)量高[18]。蔗糖合成酶ZmSus6、ZmSus7基因在甜玉米的根、莖、葉、玉米芯和籽粒中均有表達(dá)，但以葉、根中的相對(duì)表達(dá)量最高[19]。鐵皮石斛葉、莖、根蔗糖合成酶的半定量RT-PCR檢測結(jié)果表明，蔗糖合成酶基因在鐵皮石斛植株中不同部位表達(dá)量不同，其表達(dá)模式表現(xiàn)為莖>葉>根[20]。玉米蔗糖合成酶的組織表達(dá)特異性分析發(fā)現(xiàn)，蔗糖合成酶基因ZmSUS1和ZmSUS2在胚和胚乳中大量表達(dá)，蔗糖合成酶基因ZmSUS5在所有被檢測組織中的表達(dá)量很低，蔗糖合成酶基因ZmSUS3及ZmSUS4在被檢測的組織中均有較高的表達(dá)量[21]。本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果較為類似。本試驗(yàn)的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，蔗糖合成酶基因在江西鉛山紅芽芋的表達(dá)存在器官特異性，在根、球莖膨大初期中的表達(dá)量最高。因此，江西鉛山紅芽芋蔗糖合成酶基因的克隆不僅為研究該基因在江西鉛山紅芽芋中的表達(dá)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，而且豐富了植物蔗糖合成酶分子進(jìn)化和結(jié)構(gòu)功能研究的材料。