稀土、膽汁酸及其復(fù)配物對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能和腸肝結(jié)構(gòu)功能的影響

方攬?jiān)?，鄧志剛，?洋，徐杭忠，薛 洋，翟旭亮，李 虹，羅 莉*

（1.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，淡水魚(yú)類(lèi)資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.湖南德邦生物科技有限公司，湖南常寧 421500；3.重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，重慶 400000）

大口黑鱸（Micropterus salmoides），又名加州鱸，是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，現(xiàn)產(chǎn)量超過(guò)50萬(wàn)t，占全國(guó)淡水魚(yú)總產(chǎn)量1.88%（國(guó)家特色淡水魚(yú)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系，2021）。近年來(lái)，由于大口黑鱸人工配合飼料的應(yīng)用和消費(fèi)市場(chǎng)的認(rèn)可，大口黑鱸的養(yǎng)殖得到快速發(fā)展。目前配合飼料的營(yíng)養(yǎng)配方、加工工藝和日常管理技術(shù)尚不完善，長(zhǎng)期食用人工飼料易導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)出現(xiàn)肝臟腫大、組織損傷和其他不良問(wèn)題（Chen等，2020），容易造成水產(chǎn)動(dòng)物病害頻發(fā)。

為解決大口黑鱸魚(yú)生產(chǎn)中出現(xiàn)的脂肪肝（張露露，2015）、碳水利用率低（Yu，2020）等問(wèn)題，可以通過(guò)在飼料中添加功能性添加劑來(lái)達(dá)到改善動(dòng)物體質(zhì)、預(yù)防肝損傷等動(dòng)物疾病的效果。其中膽汁酸及其衍生物已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)中，已成為肝臟代謝異常、Ⅱ型糖尿病和肝臟相關(guān)疾病的治療藥物（Chiang John，2021），在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)極具發(fā)展利用前景。相關(guān)研究表明，在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中添加膽汁酸可保護(hù)腸道健康（Staessen等，2020），增強(qiáng)腸道消化酶的活性（向梟，2021），提高飼料轉(zhuǎn)化率，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝減少機(jī)體脂肪沉積（Ding等，2020），提高魚(yú)類(lèi)肌肉中的蛋白質(zhì)含量和品質(zhì)（朱龍，2017）。除此之外，一些研究在飼料中廣泛嘗試使用多種非抗生素類(lèi)功能性飼料添加劑，如單獨(dú)添加一定量的稀土（鈰和鑭）殼糖胺螯合鹽（Cui等，2013）、單甘酯（薛永強(qiáng)等，2020）、L-肉堿（Yu等，2020）等物質(zhì)到飼料中，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、免疫和抗氧化性能等已產(chǎn)生了一定的促進(jìn)作用。

近年來(lái)，膽汁酸對(duì)大口黑鱸的營(yíng)養(yǎng)作用、生理調(diào)控作用已有報(bào)道，且主要集中在高脂日糧基礎(chǔ)上的添加試驗(yàn)評(píng)價(jià)。至于在常規(guī)中等脂肪水平（10%）下膽汁酸的添加效果，以及膽汁酸與稀土等的其他添加劑復(fù)合添加的加成作用的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道?；谏鲜霈F(xiàn)狀，本試驗(yàn)在大口黑鱸飼料中添加不同含量的膽汁酸、稀土及其復(fù)配物，通過(guò)大口黑鱸的生長(zhǎng)指標(biāo)、消化酶、血液生化指標(biāo)，探究飼料中添加不同含量膽汁酸、稀土及其配合物對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)及脂肪代謝的影響，為復(fù)合添加劑在大口黑鱸飼料中的應(yīng)用提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 大口黑鱸魚(yú)購(gòu)自重慶市三峽漁業(yè)有限公司，稀土（鈰和鑭）螯合鹽等原料均由湖南德邦生物科技有限公司提供。L-肉堿由北京桑普生化技術(shù)有限公司提供，魚(yú)粉、豆粕等原料購(gòu)自重慶新希望飼料有限公司。

1.2 試驗(yàn)飼料 根據(jù)大口黑鱸的營(yíng)養(yǎng)需求，以進(jìn)口魚(yú)粉、雞肉粉為主要蛋白源，以魚(yú)油、大豆油為主要脂肪源，配制基礎(chǔ)飼料。對(duì)照組（D0）飼喂基礎(chǔ)飼料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，在其基礎(chǔ)上分別添加組分不同的添加劑，配制成5種等氮等脂的試驗(yàn)飼料，依次命名為D1、D2、D3、D4和D5，添加劑配方如表2。

表1 試驗(yàn)飼料組成及主要營(yíng)養(yǎng)水平%

表2 各處理組添加劑的組分

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)選擇規(guī)格為（12.34±0.11）g的大口黑鱸450尾，隨機(jī)分成6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25尾，飼養(yǎng)于室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)，正式試驗(yàn)周期56 d。每天早晚兩次近飽食投喂，日投喂量為體質(zhì)量的3%～4%，根據(jù)攝食情況適當(dāng)調(diào)整投喂量。飼養(yǎng)期間每缸水體保持在1 m3左右，水溫28～32℃，每天早晚對(duì)養(yǎng)殖水體溶解氧、pH、亞硝酸鹽、氨氮等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 樣品采集 試驗(yàn)開(kāi)始前，隨機(jī)取5尾鱸魚(yú)，采集魚(yú)體的肝臟、腸道，用于固定制作組織切片，并觀察記錄初始魚(yú)常規(guī)指標(biāo)。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h，每組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取6尾魚(yú)，參照劉長(zhǎng)江等（2021）的方法進(jìn)行處理后，用于血漿生化指標(biāo)測(cè)定。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取2尾大口黑鱸取部分肝臟、腸道組織，用4%多聚甲醛溶液浸泡固定后，用于組織切片的制作。

1.5 指標(biāo)測(cè)定 根據(jù)徐杭忠等（2021）的方法測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)，包括增重率（WGR）、特定生長(zhǎng)率（SGR）、飼料系數(shù)（FCR）、存活率（SR）。

血漿中的總高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TAG）、膽固醇（TC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）以及腸道組織勻漿中的胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和Na+-K+-ATP酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

肝臟粗脂肪（CL）含量采用索氏抽提法（GB/T 6433-1994）測(cè)定；肝臟組織的油紅O冰凍染色切片由武漢塞維爾生物科技有限公司代制。

1.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），用Duncan氏多重比較分析組間差異顯著性程度，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 五種添加劑對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能及飼料利用的影響 如表3所示，與D0組相比，各試驗(yàn)組的WGR、SGR、FCR和SR均無(wú)顯著差異（P＞0.05），但D1、D2、D4組的WGR與D0組及其他試驗(yàn)組相比有上升趨勢(shì)；在各組中D2組的FCR為最低、PER為最高。

表3 五種添加劑對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能及飼料利用的影響

2.2 五種添加劑對(duì)大口黑鱸腸道消化酶活性的影響 如表4所示，與D0組相比，D1組的胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性顯著上升（P＜0.05），分別提高24.36%、47.86%、47.62%；D2組的胰蛋白酶、脂肪酶活性顯著上升（P＜0.05），分別提高25.48%、39.31%，淀粉酶活性無(wú)顯著變化（P＞0.05）；D3組的脂肪酶、淀粉酶活性顯著上升（P＜0.05），分別提高21.99%、23.81%，胰蛋白酶活性無(wú)顯著變化（P＞0.05）；D4組的脂肪酶、淀粉酶活性顯著上升 （P＜0.05），分別提高25.49%、23.81%，胰蛋白酶活性無(wú)顯著變化（P＞0.05）；D5組的脂肪酶和淀粉酶活性顯著上升（P＜0.05），分別提高28.85%、33.33%，胰蛋白酶活性無(wú)顯著變化（P＞0.05）。與D0組相比，D1、D2、D3、D4和D5組的Na+-K+-ATP酶活性均降低，分別下降34.32%、27.68%、28.78%、55.35%、38.38%，D4組降低程度最顯著。

表4 五種添加劑對(duì)大口黑鱸腸道消化酶活性的影響U/mg prot

與D0組相比，D5組的腸道絨毛根數(shù)顯著下降（P＜0.05），其他各組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與D0組相比，各組的肌層厚度、絨毛長(zhǎng)度、杯狀細(xì)胞密度、空腔率均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表5 五種添加劑對(duì)大口黑鱸腸道組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

2.3 五種添加劑對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響 如表6所示，與D0組相比，D3組的TC含量顯著提高（P＜0.05）；D3組的TG含量顯著高于其他各組（P＜0.05）；D2、D4和D5組的HDL-C顯著高于D0組（P＜0.05），其中D4組LDL-C顯著高于其他各組（P＜0.05）。D0組的HDL-C/LDL-C顯著高于其他各組（P＜0.05）。D1、D3、D4和D5組的血漿GSH-Px顯著升高（P＜0.05），分別升高12.23%、9.89%、15.46%、9.63%，D2組的血漿GSH-Px有升高趨勢(shì)，但不顯著（P＞0.05）。D1和D5組的血漿MDA顯著下降（P＜0.05），分別下降11.90%、29.29%，D2和D4組有下降趨勢(shì)，但不顯著（P＞0.05）。

表6 五種添加劑對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響

2.4 五種添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟功能及肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響 如表7所示，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組的血漿AST活性顯著下降（P＜0.05），各組血漿AST分別下降32.37%、27.49%、17.07%、35.48%、10.86%。ALT活性無(wú)顯著變化 （P＞0.05）。D2組的肝脂含量顯著小于D1組（P＜0.05），此外雖與其他各組無(wú)顯著差異（P＞0.05），但相比之下肝脂含量最小。

表7 五種添加劑對(duì)大口黑鱸肝功能指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 五種添加劑對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能和消化酶的影響 本試驗(yàn)結(jié)果表明，D1組的增重率和特定生長(zhǎng)率相對(duì)較高，D2組的飼料系數(shù)最低，D1和D2組的胰蛋白酶和脂肪酶活性顯著高于其他各組，D1組淀粉酶顯著高于其他各組。江振瑩等（2007）研究表明，在德黃雜交鯉魚(yú)飼料中添加200～300 mg/kg硝酸稀土可提高其腸道蛋白酶、脂肪酶的活性，從而提高其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率。劉軍等（2008）指出，在鯽魚(yú)飼料中添加不同水平（0.08%、0.16%、0.24%）的稀土殼糖胺螯合鹽，結(jié)果表明，其腸道淀粉酶活性增加37.7%～48.1%，脂肪酶活性增加121.5%～190.2%，蛋白酶活性增加362.1%～542.2%?？梢?jiàn)本試驗(yàn)中稀土（鈰和鑭）殼糖胺螯合鹽對(duì)于提高消化酶活性起到了重要作用，通過(guò)消化作用將攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化分解成可被魚(yú)類(lèi)吸收的小分子物質(zhì)，再經(jīng)過(guò)循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)浇M織細(xì)胞里面，促進(jìn)吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而取得較好的生長(zhǎng)性能表現(xiàn)。而各試驗(yàn)組Na+-K+-ATPase均顯著低于D0組，說(shuō)明吸收功能受到了影響，這可能是本次試驗(yàn)在生長(zhǎng)性能指標(biāo)上沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異的原因。消化酶活性提高，說(shuō)明消化功能加強(qiáng)，但由于吸收能力下降，造成了各試驗(yàn)組生長(zhǎng)性能差異沒(méi)得到反映。但這幾種成分間是否有協(xié)同作用還需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中消化酶和生長(zhǎng)性能的表現(xiàn)相一致，D1和D2組促進(jìn)消化的能力明顯增強(qiáng)，下一步可以配伍其他添加劑改善飼料配方，如復(fù)合微量元素（胡凱等，2019）、?；撬幔ú軙岳虻?，2021）、谷氨酰胺前體物（趙志剛等，2017）等，這些添加劑均被證明可以增強(qiáng)Na+-K+-ATPase活性，從而提高魚(yú)類(lèi)的吸收能力，達(dá)到更好的生長(zhǎng)效果。

3.2 五種添加劑對(duì)大口黑鱸脂肪代謝的影響血液生化指標(biāo)體現(xiàn)的是魚(yú)體生理代謝狀態(tài)，與營(yíng)養(yǎng)狀況密切相關(guān)，血液生化指標(biāo)的改變可以反映其機(jī)體代謝、營(yíng)養(yǎng)狀況與疾病狀況（周玉香等，2012）。魚(yú)類(lèi)在正常情況下血液中轉(zhuǎn)氨酶活性很低，當(dāng)肝臟組織病變或受損程度較高時(shí)，細(xì)胞膜通透性增大，其中大量AST、ALT滲入血液，導(dǎo)致血液中AST、ALT活性持續(xù)增強(qiáng)（林偉華和陳華英，2005）。甘油三酯（TG）主要參與體內(nèi)能量的產(chǎn)生與儲(chǔ)存，是重要的能源物質(zhì)。膽固醇（TC）是合成膽汁酸、維生素D以及甾體激素的原料，也是細(xì)胞膜的構(gòu)成成分之一。魚(yú)類(lèi)的肝細(xì)胞遭到破壞或者功能性損傷，TG轉(zhuǎn)運(yùn)受到阻礙和AST、ALT通透性增加，使血液中的TG相對(duì)減少和AST、ALT活性增大。

本試驗(yàn)中，對(duì)照組的AST顯著大于其他各處理組，而血液中TG含量顯著小于其他各組。說(shuō)明使用添加劑后，提高了大口黑鱸對(duì)脂肪代謝的能力，尤其是在D3處理組中，血液中TG和TC的含量顯著高于其他各組，D2組血液中TG和TC的含量也有提高的趨勢(shì)。說(shuō)明在D3和D2組中的添加劑組分，可促進(jìn)脂肪乳化分解。HDL各組織的CHO送回肝代謝，而LDL把CHO從肝運(yùn)送到全身組織。本研究中結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，加入添加劑后，HDL-C、LDL-C及HDL-C/LDL-C部分升高，部分降低，大部分指標(biāo)之間沒(méi)有顯著差異，這種不規(guī)律的變化趨勢(shì)，其原因或許是都處在大口黑鱸正常的生理指標(biāo)水平。可能是本試驗(yàn)所選用的魚(yú)較小，配方中的脂肪含量是較合適的添加水平，并沒(méi)有引起其脂肪代謝異常。

3.3 五種添加劑對(duì)大口黑鱸抗氧化能力的影響機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能與GSH-Px等指標(biāo)密切相關(guān)，這些指標(biāo)活性的高低直接反映著機(jī)體對(duì)于應(yīng)激代償能力和清除自由基能力的強(qiáng)弱（方允中等，2003）。脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物為MDA，其濃度間接反映機(jī)體細(xì)胞的損傷程度（豐程程等，2013）。本研究中，各試驗(yàn)組均增強(qiáng)了大口黑鱸的抗氧化能力。

綜合來(lái)看，D1組提高生長(zhǎng)性能上表現(xiàn)更加突出，而D2組不僅在生長(zhǎng)還是脂肪代謝上都有較好表現(xiàn)。D1和D2組中都75 mg/kg的稀土（鈰和鑭）殼糖胺螯合鹽。D2比D1組使用了更多的膽汁酸。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，得出如下結(jié)論：（1）大口黑鱸飼料中添加膽汁酸、稀土及其復(fù)配物均具有促進(jìn)腸道脂肪酶活性的作用，但對(duì)氨基酸和糖類(lèi)等物質(zhì)的吸收能力指標(biāo)Na+-K+-ATPase活性均降低。（2）使用膽汁酸、稀土（鈰和鑭）殼糖胺螯合鹽與單甘酯或膽汁酸與稀土（鈰和鑭）殼糖胺螯合鹽或膽汁酸與肉堿的復(fù)配物，較高含量的單一膽汁酸添加劑對(duì)大口黑鱸消化酶活性提高、肝功能指標(biāo)改善、促進(jìn)脂代謝的效果更好，但最佳配比仍有必要進(jìn)行下一步探究。（3）復(fù)合添加劑D2組合和D3組合能顯著提高大口黑鱸脂肪酶活性、血液中甘油三酯和總膽固醇含量，促進(jìn)大口黑鱸對(duì)脂肪的消化和吸收。

綜上，相比較高含量的膽汁酸單一添加劑，復(fù)配上75 mg/kg稀土（鈰和鑭）殼糖胺螯合鹽的復(fù)合型添加劑D2組合，對(duì)促進(jìn)脂肪代謝，提高生長(zhǎng)性能起到更加明顯的效果。