不同處理方法對(duì)中草藥體外抑菌及抗氧化活性的影響

王寶剛，楊立軍，曹鵬亮，梁曉凱，汪金萍，陳 瓊*

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院食品學(xué)院，河南信陽(yáng) 464000；2.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院制藥工程學(xué)院，河南信陽(yáng) 464000）

為防治疾病，禽畜生產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中約有60多種抗生素被用于動(dòng)物臨床治療中，大量抗生素的使用會(huì)導(dǎo)致禽畜體內(nèi)微生物菌群失調(diào)并產(chǎn)生耐藥性（Zhang，2015）。劉肖利等（2021）從采集的7個(gè)奶牛場(chǎng)中患乳房炎奶牛乳汁樣本分離出5株金黃色葡萄球菌，結(jié)果顯示這些金黃色葡萄球菌最少耐1種藥，最多耐5種藥物，部分耐藥率為60%～80%；張璐等（2020）研究表明，雞白痢沙門菌2001—2010年比1970—2000年藥物耐藥率及耐藥種類升高；Xin等（2021）分析2008—2017年美國(guó)食品和藥物管理局收集的46937份禽肉樣本的數(shù)據(jù)，表明與減少抗生素使用樣本中的分離株相比，常規(guī)樣本中的沙門氏菌分離株對(duì)三種或三種以上抗菌藥物的耐藥幾率（多重耐藥）高2.61倍。在養(yǎng)殖過(guò)程中減少抗生素的使用勢(shì)在必行，2018年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織制定了《獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)試點(diǎn)工作方案（2018-2021年）》。

中草藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)特點(diǎn)，在診治禽畜感染性疾病方面被證實(shí)有一定的療效，可在一定程度上降低多重耐藥菌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。馮平等（2017）表明，連翹、黃連、金銀花、魚腥草、蒲公英可作為藥物預(yù)防和治療奶牛乳房炎。蒲公英、金銀花、菊花作為藥食兼用的傳統(tǒng)中藥材在我國(guó)使用歷史悠久，均具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤的功效 （朱文卿，2021；周衡樸，2019；Nikzad，2017）。本文通過(guò)探索不同處理方法對(duì)蒲公英、金銀花、菊花這三種中藥材抑菌效果和抗氧化活性的影響，旨在為它們?cè)谇菪箴B(yǎng)殖方面的應(yīng)用提供一定的參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 測(cè)試菌種 金黃色葡萄球菌、甲型副傷寒沙門氏菌均由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院制藥工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，這兩種菌均為禽畜類常見(jiàn)致病菌。

1.2 中草藥與試劑 蒲公英、金銀花、菊花購(gòu)自信陽(yáng)美銳大藥房；乳酸菌購(gòu)自信陽(yáng)恒大華聯(lián)超市，蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、營(yíng)養(yǎng)瓊脂均購(gòu)自上海博微生物科技有限公司；DPPH、鄰苯三酚均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 主要儀器 SW-CJ-2FD實(shí)用型雙人單面垂直凈化工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；XFH-75CA型電熱壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；DNP型電熱恒溫培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠產(chǎn)品；DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司產(chǎn)品；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；Tu-1900紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 7種組方組合方法 將三種中草藥按照不同方式進(jìn)行組合，共7組，分別為：A組蒲公英12.0 g，B組金銀花12.0 g，C組菊花12.0 g，D組蒲公英、金銀花各6.0 g，E組蒲公英、菊花各6.0 g，F(xiàn)組金銀花、菊花各6.0 g，G組蒲公英、金銀花、菊花各4.0 g。

2.2 水煎煮處理方法 將以上7種組方分別加入100 mL的蒸餾水浸泡30 min，再加熱煎煮30 min后，用紗布過(guò)濾，濾渣再加水提取2次，合并3次濾液得水煎煮原液。將水煎煮原液于50℃、50 r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏狀，用蒸餾水定容得濃縮液（1.0 g/mL）。濃縮液用濾膜（孔徑0.45μm）過(guò)濾裝于無(wú)菌具塞試劑瓶?jī)?nèi)密封，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 乳酸菌發(fā)酵處理方法 將7種組方分別裝入300 mL三角瓶中，加入蒸餾水200 mL，密封。將三角瓶置于65℃水浴鍋中，保溫30 min，進(jìn)行巴氏消毒。無(wú)菌條件下，稱取0.4 g乳酸菌粉加入巴氏消毒后的7組三角瓶中，然后將它們放于恒溫培養(yǎng)箱中，37℃發(fā)酵7 d，每24 h手動(dòng)晃動(dòng)一次。發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液進(jìn)行抽濾得發(fā)酵濃縮液，后續(xù)操作同2.2。

2.4 體外抑菌試驗(yàn)

2.4.1 培養(yǎng)基制備 肉湯培養(yǎng)基制備：取蛋白胨10.0 g，牛肉膏粉3.0 g，氯化鈉5.0 g，加1000 mL蒸餾水，加熱溶解，121℃滅菌30 min。營(yíng)養(yǎng)瓊脂制備：取營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉33.0 g，加1000 mL蒸餾水，加熱溶解，121℃滅菌30 min。

2.4.2 菌懸液制備 在無(wú)菌條件下，取甲型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌各一菌環(huán)接種于肉湯培養(yǎng)基試管，37℃靜置培養(yǎng)24 h，取出，使用無(wú)菌水調(diào)整菌懸液濃度約106～107CFU/mL。

2.4.3 藥敏片制作 用打孔器制作若干圓形濾紙片（直徑6 mm），將其按需分裝入2 mL離心管中，高壓滅菌后，加入不同處理方法所得的7種組方中草藥濃縮液，室溫放置30 min，無(wú)菌條件下取出濾紙片于無(wú)菌平皿中，50℃條件下烘干，4℃保存，備用。

2.4.4 濾紙片法測(cè)體外抑菌效果 用移液槍吸取50μL測(cè)試菌懸液滴加到制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用涂布棒涂布均勻。待其表面無(wú)水后用無(wú)菌鑷子將制備好的藥敏片貼附于培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h，取出，用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑（d）＞20 mm為極敏，15 mm＜d≤20 mm為高敏，10 mm＜d≤15 mm為中敏，d≤10 mm為低敏，“—”表示無(wú)抑菌圈（姚火春，2012）。

2.5 抗氧化性試驗(yàn) 利用得到的各種提取物原液進(jìn)行超氧陰離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力的測(cè)定，具體參考姜峰（2021）方法。

2.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（S-N-K檢驗(yàn)）和多重比較，試驗(yàn)結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 體外抑菌試驗(yàn)3.1.1 7種組方水煎煮液體外抑菌效果 由表1可知，7種組方水煎煮濃縮液，對(duì)金黃色葡萄球菌和甲型副傷寒沙門氏菌均表現(xiàn)出不同的抑制效果，不同組方之間均表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05）；金黃色葡萄球菌對(duì)E組表現(xiàn)出高敏，對(duì)A、B、D、F、G組表現(xiàn)為中敏，對(duì)C組表現(xiàn)為低敏，最大E組（蒲公英+菊花）比最小C組（菊花）抑菌圈直徑大68%；甲型副傷寒沙門氏菌對(duì)A組表現(xiàn)出極敏，對(duì)G組表現(xiàn)出高敏，對(duì)D、E、F組表現(xiàn)為中敏，對(duì)B、C組表現(xiàn)為低敏，最大A組（蒲公英）比最小C組（菊花）抑菌圈直徑大224%。

表1 7種組方水煎煮液抑菌圈直徑mm

3.1.2 7種組方乳酸菌發(fā)酵液體外抑菌效果 由表2可知，7種組方乳酸菌發(fā)酵濃縮液，對(duì)金黃色葡萄球菌和甲型副傷寒沙門氏菌均有較好的抑制效果，不同組方之間均表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05）；金黃色葡萄球菌對(duì)B、D、F、G組表現(xiàn)極敏，對(duì)A、C、E組表現(xiàn)為高敏，最大F組（金銀花+菊花）比最小C組（菊花）抑菌圈直徑大61%；甲型副傷寒沙門氏菌對(duì)A、C、D、F、G組方表現(xiàn)極敏，對(duì)B組方表現(xiàn)為高敏，最敏感的D組（蒲公英+金銀花）比最小B組（金銀花）抑菌圈直徑大62%。

表2 7種組方乳酸菌發(fā)酵液抑菌圈直徑mm

3.1.3 不同處理方式抑菌效果比較 為了較直觀地比較水煎煮和乳酸菌發(fā)酵抑菌效果的差異，按測(cè)試致病菌不同將7種組方抑菌圈直徑如圖1、圖2所示。從圖1和圖2看出，針對(duì)金黃色葡萄球菌和甲型副傷寒沙門氏菌，每種組方的乳酸菌發(fā)酵液均比水煎煮液抑制效果好。依次對(duì)比從A組到G組的抑菌圈直徑，乳酸菌發(fā)酵較水煎煮，對(duì)于金黃色葡萄球菌分別提高了63%、75%、65%、85%、20%、135%、112%，對(duì)于甲型副傷寒沙門氏菌分別提高了12%、128%、329%、123%、89%、106%、81%。

圖1 不同處理方式對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

圖2 不同處理方式對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌的抑菌效果

3.2 抗氧化試驗(yàn)

3.2.1 7種組方水煎煮液抗氧化效果 由表3可知，7種組方水煎煮原液，對(duì)超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有不同程度的清除能力，不同組方之間均表現(xiàn)差異顯著（P<0.05）；對(duì)超氧陰離子自由基清除能力依次為G組＞D組＞B組＞F組＞E組＞C組＞A組，G組（蒲公英+金銀花+菊花）比A組（蒲公英）清除率高263%；對(duì)DPPH自由基清除能力依次為B組＞C組＞G組＞F組＞D組＞E組＞A組，B組（金銀花）比A組（蒲公英）清除率高127%。

表3 7種組方水煎煮液抗氧化能力%

3.2.2 7種組方乳酸菌發(fā)酵液抗氧化效果 由表4可知，7種組方乳酸菌發(fā)酵原液，對(duì)超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有不同程度的清除能力，組方之間均表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05）；對(duì)超氧陰離子自由基清除能力依次為E組＞C組＞G組＞A組＞D組＞B組＞F組，E組（蒲公英+菊花）比F組（金銀花+菊花）清除率高440%；對(duì)DPPH自由基清除能力依次B組＞F組＞C組＞D組＞E組＞G組＞A組，B組（金銀花）比A（蒲公英）組清除率高137%。

表4 7種組方乳酸菌發(fā)酵液抗氧化能力%

3.2.3 不同處理方式抗氧化活性比較 按自由基不同，將7種組方的水煎煮液和乳酸菌發(fā)酵液的抗氧化活性進(jìn)行比較，如圖3、圖4所示。從圖3和圖4看出，針對(duì)超氧陰離子自由基和DPPH自由基，每種組方的清除效果均是乳酸菌發(fā)酵液比水煎煮液高。依次對(duì)比從A組到G組抗氧化結(jié)果，乳酸菌發(fā)酵較水煎煮，對(duì)于DPPH自由基分別提高了23%、28%、16%、44%、49%、37%、8%；對(duì)于超氧陰離子自由基分別提高了287%、9%、798%、22%、535%、14%、104%。

圖3 不同處理方式對(duì)超氧陰離子自由基清除能力

圖4 不同處理方式對(duì)DPPH自由基清除能力

4 討論與結(jié)論

水煎煮是我國(guó)中草藥臨床應(yīng)用最早、最廣泛方法之一。通過(guò)煎煮，可減少藥物的副作用降低毒性（周友紅，2010），促進(jìn)藥物有效成分的浸出（黃斯，2015），利于組方中其他難溶性、揮發(fā)性物質(zhì)析出（張明明，2012）。發(fā)酵法也是中草藥炮制方法的一種，如常用的六神曲、淡豆豉、百藥煎等就是通過(guò)發(fā)酵炮制的中草藥。中草藥通過(guò)發(fā)酵可提高有效成分的提取率（楊新波，2022），降低毒副作用（Lin，2020），并產(chǎn)生新的成分（Chen，2019），中草藥發(fā)酵尤其是益生菌發(fā)酵中草藥越來(lái)越受重視。

乳酸菌作為益生菌發(fā)酵中草藥在禽畜養(yǎng)殖中有較好的應(yīng)用效果。郭宏偉等（2019）統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，投喂經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的生乳散比沒(méi)發(fā)酵生乳散的妊娠母豬產(chǎn)活仔數(shù)高10.09%。李雪雁等（2020）用乳酸菌發(fā)酵添加了黃芪、淫羊霍、甘草等的飼料飼喂雛雞，4～5周后統(tǒng)計(jì)得出發(fā)酵中草藥制劑提高了雛雞生長(zhǎng)性能，降低了料肉比。

本試驗(yàn)利用乳酸菌發(fā)酵蒲公英、金銀花、菊花三種中草藥的7種組方，它們的抑菌效果和抗氧化活性均高于水煎液?？赡苁怯捎诮?jīng)乳酸菌發(fā)酵后，產(chǎn)生了一些新的物質(zhì)，如有機(jī)酸（胡愛(ài)心，2021）、細(xì) 菌 素（Baliv，2016）、過(guò) 氧 化 氫（Knaus，2017）等，它們均被證明有一定的抑菌及抗氧化活性（張開(kāi)屏，2021），這與其他中藥發(fā)酵結(jié)果有相似之處。如白俊毅等（2020）表明，連梔礬發(fā)酵后抑菌效果增加，并經(jīng)HPLC測(cè)定發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后連梔礬溶液活性成分發(fā)生變化，產(chǎn)生了新的成分，其認(rèn)為這些是發(fā)酵后抑菌活性增強(qiáng)的原因；鄭慧敏等（2021）對(duì)五谷蟲粉水提物發(fā)酵前后抑菌試驗(yàn)進(jìn)行了比較，證明發(fā)酵后五谷蟲粉的抑菌效果提高；張紅艷等（2021）表明，發(fā)酵中草藥方劑相比直接熬制，鋅、銅、鐵和鈣的含量顯著提高，DPPH自由基的清除能力提高2.2倍，羥基自由基的清除能力提高4.2倍，總多酚含量提高了2.2倍，對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌活性更強(qiáng)。

綜上所述，本試驗(yàn)條件下，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳的是乳酸菌發(fā)酵金銀花+菊花組方，抑菌圈直徑為（24.39±1.63）mm；對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌抑制效果最好的是乳酸菌發(fā)酵蒲公英+金銀花組方，抑菌圈直徑為（31.58±0.95）mm；對(duì)超氧陰離子自由基清除能力最強(qiáng)的是乳酸菌發(fā)酵蒲公英+菊花組方，清除率為（100±1.93）%；對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)的是乳酸菌發(fā)酵金銀花組方，清除率為（85.47±2.56）%；7種組方之間抑菌效果和抗氧化活性方面均存在顯著差異性；乳酸菌發(fā)酵液抑菌效果和抗氧化活性均優(yōu)于水煎煮液，抑菌圈直徑比水煎液提高12%～329%，抗氧化能力比水煎液提高8%～798%。