抗奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-細(xì)菌素的篩選及特性研究

涂會鑫，董文龍，孟雨晴，張 涵，徐菁岐

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 動物科技學(xué)院，吉林吉林 132109）

奶牛乳房炎是一類嚴(yán)重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的常發(fā)疾病，給世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中細(xì)菌性乳房炎可造成奶牛產(chǎn)奶量下降，牛奶品質(zhì)降低，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致生產(chǎn)性能喪失（張倩等，2017）。研究表明，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）誘發(fā)的奶牛乳房炎，在某些奶牛場感染率達(dá)50%以上（Bannerman等，2008）。目前國內(nèi)外預(yù)防和治療奶牛乳房炎大多使用抗生素，抗生素濫用導(dǎo)致臨床致病株耐藥性不斷增強(qiáng)。奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌耐藥菌株數(shù)顯著增加，其耐藥性也不斷增強(qiáng)（劉肖利等，2021）。尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）流行株逐年增多，常誘發(fā)慢性和復(fù)發(fā)性奶牛乳房炎，使臨床治療更加困難。其中ST9作為我國MRSA中最常見的分子分型，已在中國香港、浙江和上海的牛源MRSA中檢出（Boost等，2013）。孟丹（2018）和Yi（2018）研究發(fā)現(xiàn)，新疆奶牛養(yǎng)殖業(yè)流行的臨床型奶牛乳房炎MRSA表現(xiàn)為多重耐藥，并從牛乳中分離到人源性ST188，ST9。此外Zhou（2017）和Li（2017）研究發(fā)現(xiàn)，我國上海、江蘇、浙江等地區(qū)檢出ST630的奶牛源MRSA菌株。因此研發(fā)新型替抗產(chǎn)品用于奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的防治已迫在眉睫。

乳酸菌在自然界中廣泛存在，是人和動物腸道中的有益微生物。乳酸菌能夠發(fā)酵原料中的糖生成乳酸、過氧化氫、細(xì)菌素和其他有機(jī)酸等產(chǎn)物，這些物質(zhì)特別是細(xì)菌素可有效抑制某些病原菌的生長（王利君等，2020）。細(xì)菌素（bacteriocin）是由一部分革蘭氏陽性菌和陰性菌在生長代謝過程中通過核糖體合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的蛋白類物質(zhì)，具有高效、安全、無毒、無殘留等特點(diǎn)，在新型天然抑菌劑研究與開發(fā)中有著巨大應(yīng)用潛力，可作為代替抗生素的新型抗菌藥物（Gálvez等，2007）。

為此本研究以金黃色葡萄球菌為指示菌，從奶酪樣品中分離到一株產(chǎn)細(xì)菌素乳桿菌（LS-1），并進(jìn)一步研究其細(xì)菌素的生物學(xué)特性，為開發(fā)一種新型天然替抗藥物防治金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 菌株LS-1由內(nèi)蒙古手工奶酪中分離獲得。金黃色葡萄球菌（S.aureus）ATCC25923、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes）ATCC19411。金黃色葡萄球菌S1、金黃色葡萄球菌S2，大腸桿菌E1、大腸桿菌E2，化膿隱秘桿菌T1、化膿隱秘桿菌T2，均為奶牛源臨床分離株，由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院動物微生物與免疫研究室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 用無菌鑷子取適量奶酪于MRS瓊脂培養(yǎng)基，涂布均勻，37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h。平板挑取不同菌落于MRS瓊脂培養(yǎng)基劃線純化，直至鏡檢觀察得到形態(tài)相同的菌體。挑起單個(gè)菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃恒溫增殖培養(yǎng)18 h，-80℃甘油保存。

1.2.2 拮抗菌株的初篩 將分離活化后的菌株按照1：300的比例接種于300 mL的LB液體培養(yǎng)基，37℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h。取出發(fā)酵液，3500 r/min離心45 min，使用0.22μm濾膜，真空泵抽濾除菌，初步得到發(fā)酵上清液，再放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至30 mL得到發(fā)酵上清濃縮液。采用瓊脂擴(kuò)散法測定各菌株無菌上清濃縮液的抑菌活性：將金黃色葡萄球菌ATCC25923的菌液濃度調(diào)整為1×108cfu/mL左右，在MH瓊脂培養(yǎng)基上均勻涂布后打孔（直徑約為8 mm），每孔加入200μL除菌上清濃縮液，室溫靜置1 h，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。測量抑菌圈直徑，篩選出產(chǎn)抗菌物質(zhì)菌株。

1.2.3 拮抗菌株的復(fù)篩 將活性菌株無菌上清濃縮液分成三組，第一組加入過氧化氫酶至終濃度為1 mg/mL，37℃水浴2 h，然后沸水浴煮5 min；第二組配制與無菌上清濃縮液具有相同pH的乳酸；第三組不做任何處理作為對照組。采用上述瓊脂擴(kuò)散法將各組處理樣品加入孔洞中，靜置1 h，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。除去因產(chǎn)生過氧化氫和酸性物質(zhì)起到抑菌作用的菌株。

1.2.4 LS-1的菌落、菌體形態(tài) 將菌株接種MRS瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取單個(gè)菌落，滴加一滴生理鹽水于載玻片上稀釋，酒精燈火焰上加熱固定，按照革蘭氏染色試劑盒說明書進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.5 LS-1的16SrRNA鑒定 用DNA提取試劑盒提取LS-1的基因組，以提取的DNA模板對LS-1的16SrRNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。通用引物如下（Moreno 等，2002）：16S rRNA -F：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16SrRNA-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到長度正確的PCR產(chǎn)物，合格樣品送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，將測序所獲得的16S rRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對。

1.2.6 LS-1細(xì)菌素生物學(xué)特性測定

1.2.6.1 酶對細(xì)菌素的影響 將發(fā)酵上清濃縮液分為4份，加入2 mg/mL蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）。胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶置于37℃水浴，木瓜蛋白酶60℃水浴，4 h后100℃加熱5 min終止反應(yīng)（Zhu等，2014）。以發(fā)酵上清濃縮液為對照組，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。方法同上。

1.2.6.2 溫度對細(xì)菌素的影響 將發(fā)酵上清濃縮液分為4份，于40、60、80℃水浴2 h，100℃水浴10 min，以發(fā)酵上清濃縮液為對照組，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。方法同上。

1.2.6.3 pH對細(xì)菌素的影響 用1 mol/L的乳酸、1 mol/L氫氧化鈉分別將發(fā)酵上清濃縮液的pH調(diào)至4.0、7.0、9.0、11.0，室溫靜置1 h后pH調(diào)回至5.0，以發(fā)酵上清濃縮液為對照組，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。方法同上。

1.2.6.4 抑菌譜的測定 取-80℃所儲存指示菌（9株）復(fù)蘇活化，接種到適宜液體培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h。采用平板計(jì)數(shù)法將菌液濃度調(diào)整為1×108cfu/mL左右，使用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，并記錄抑菌圈直徑。

以上所有抑菌試驗(yàn)均進(jìn)行3次，測量抑菌圈直徑，取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選 通過瓊脂擴(kuò)散法篩選到一株產(chǎn)細(xì)菌素菌株LS-1（圖1），經(jīng)復(fù)篩排除過氧化氫、有機(jī)酸的影響。發(fā)酵液經(jīng)過過氧化氫酶處理后，抑菌圈直徑大小不變，說明菌株的抑菌活性與過氧化氫無關(guān)。與發(fā)酵液具有相同pH的乳酸產(chǎn)生的抑菌圈直徑變小，說明發(fā)酵液產(chǎn)生的乳酸具有一定的抑菌作用，但起不到?jīng)Q定作用。因此可以初步判定LS-1具有抗菌作用主要是因?yàn)榧?xì)菌素。

圖1 LS-1發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌ATCC25923的抑菌效果

2.2 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的鑒定

2.2.1 LS-1的分離培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果 菌株LS-1在MRS固體培養(yǎng)基上劃線37℃培養(yǎng)24 h，觀察可見其表面乳白光滑、圓形突起、邊緣整齊（圖2）。將單菌落革蘭氏染色，油鏡下觀察菌體為陽性短桿、無芽孢（圖3）。

圖2 LS-1菌落形態(tài)

圖3 LS-1的革蘭氏染色鏡檢圖（1000×）

2.2.2 LS-1的16SrRNA鑒定 通過16S rRNA基因引物，PCR擴(kuò)增菌株LS-1的16S rRNA片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可得到一條位于1500 bp左右的條帶（圖4）。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，該菌株與Lacticaseibacillus saniviri（L.saniviri）同源性為98.71%。

圖4 16S rRNA基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2.3 細(xì)菌素穩(wěn)定性的測定 發(fā)酵液經(jīng)過木瓜蛋白酶、胃蛋白酶處理后失去抑菌活性，由此推斷LS-1的發(fā)酵液中的抑菌成分是一種細(xì)菌素（表1）。LS-1的細(xì)菌素具有良好熱穩(wěn)定性。發(fā)酵液經(jīng)過不同溫度處理后，抑菌效果有所下降，但是抑菌活性依舊接近80%（抑菌活性=試驗(yàn)組抑菌圈/對照組抑菌圈×100%）。LS-1的細(xì)菌素具有較好的酸堿穩(wěn)定性。細(xì)菌素在pH為4.0、7.0、9.0時(shí)保持良好抑菌活性，且抑菌活性不低于70%，pH＞9.0時(shí)抑菌活性消失（表1）。

表1 蛋白酶、溫度、酸堿對LS-1的細(xì)菌素活性影響

2.2.4 抑菌譜的測定 LS-1的細(xì)菌素對奶牛乳房炎主要病原菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、化膿隱秘桿菌）均有不同程度的抑菌作用。LS-1細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、奶牛源臨床分離株的抑菌作用最好，抑菌圈＞30 mm（表2）。整體而言，LS-1細(xì)菌素具有較高的抑菌活性。

表2 LS-1細(xì)菌素的抑菌譜

3 討論

近年來，在世界各國的奶牛業(yè)疫病中，金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的防治問題十分突出，也是我國奶牛業(yè)中具有重大經(jīng)濟(jì)學(xué)意義的疾病。金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎常常誘發(fā)乳房出血，溶血素是該菌一種重要的致病因子，其中α溶血素對人類有致病作用（魏志恒等，2009）。目前奶牛場常用防治和治療措施仍然是使用抗生素，而金黃色葡萄球菌極易產(chǎn)生針對常用抗生素的耐藥性，多重耐藥性MRSA的出現(xiàn)使奶牛乳房炎很難治愈（龐盛林，2014）。

耐藥性是所有抗菌性藥物必然會遇到的問題，細(xì)菌素與抗生素一樣也會有耐藥性菌株的出現(xiàn)，但其出現(xiàn)的概率在1×10-9～1×10-8，比抗生素的概率要低得多（Guinane等，2010）。研究表明，產(chǎn)細(xì)菌素菌株在自然界中普遍存在，30%～99%的細(xì)菌和古生菌可以產(chǎn)生至少一種細(xì)菌素（Gao等，2022）。此外，細(xì)菌素對多種蛋白酶敏感，不易殘留或產(chǎn)生抗藥性，安全性高。另外細(xì)菌素對高溫、酸性的耐受能力強(qiáng)，可用于開發(fā)抗生素類、激素類的替代藥品（Riley等，2007）。其中乳酸菌細(xì)菌素在安全性、抑菌性等其他活性研究方面逐漸被認(rèn)識，并成為蛋白質(zhì)研究的一個(gè)熱點(diǎn)（Xiang等，2021）。然而用于臨床的細(xì)菌素極少，目前只有乳酸鏈球菌產(chǎn)生的Nisin已被允許作為食品防腐劑，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化（王利君等，2020）。許女等（2016）發(fā)現(xiàn)，KF1細(xì)菌素對多重耐藥金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，主要的毒力因子具有明顯的抑制作用。陳宏偉等（2020）發(fā)現(xiàn)了5株代謝產(chǎn)生細(xì)菌素對乳房炎源金黃色葡萄球菌發(fā)揮抑制生長作用的菌株。

本研究以金黃色葡萄球菌為指示菌，從奶酪中分離得到一株產(chǎn)細(xì)菌素菌株LS-1，通過16S rRNA序列對比分析，鑒定菌株LS-1為L.saniviri。LS-1所產(chǎn)細(xì)菌素對奶牛乳房炎主要病原菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、化膿隱秘桿菌）均具有良好抑菌活性。此外LS-1所產(chǎn)細(xì)菌素具有良好的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。菌株LS-1豐富了產(chǎn)細(xì)菌素菌株資源，為研究防治金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的新型藥物奠定了基礎(chǔ)，有著廣闊的應(yīng)用前景。