反相高效液相色譜法測定加味四妙勇安湯中綠原酸和梓醇的含量Δ

李慧紅，李 敏，關紅亞，韓鵬黎，劉 嘉，成 龍，曹 巍，周麗娟#

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院轉化醫(yī)學中心，鄭州 450007； 2.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院藥學部，鄭州 450007； 3.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所分析研究中心，北京 100094)

四妙勇安湯首見于《華佗神醫(yī)秘傳》，主要由金銀花、玄參、當歸和甘草組成，其比例為3∶ 3∶ 2∶ 1[1-3]。本課題組前期采用數(shù)據(jù)挖掘技術針對糖尿病視網膜病變初期，在四妙勇安湯方的基礎上篩選優(yōu)化出加味四妙勇安湯(金銀花、玄參、地黃、當歸、丹參和甘草)，應用動物模型初步評價其對db/db小鼠具有降糖作用。四妙勇安湯主清熱解毒、活血止痛，加味四妙勇安湯方中增加了丹參和地黃，增強了滋陰清熱之功，同時有祛瘀通絡之效。四妙勇安湯作為治療熱毒性脫疽的經典古方，研究結果表明，其抗炎作用與金銀花中的綠原酸相關[4]。現(xiàn)代藥理學研究結果顯示，綠原酸為金銀花主要水溶性成分[5-6]。相關研究結果證實，從血管內皮保護的角度，綠原酸具有改善糖尿病視網膜病變的作用[7]。梓醇作為地黃的最主要的活性成分，具有降血糖、利尿、緩和瀉下等作用[8]。本研究按照提取工藝對加味四妙勇安湯的藥材進行水提，采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對方中君藥金銀花的主要成分綠原酸和臣藥地黃的主要成分梓醇的含量進行測定，為加味四妙勇安湯提取物的提取工藝及質量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型Agilent HPLC儀(美國Agilent公司)；TQX-150AH超聲波清洗器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；ML303E電子分析天平(梅特勒托利多儀器上海有限公司，精度為十萬分之一)。

1.2 藥品與試劑

加味四妙勇安湯：金銀花(河南，批號為20200201)、玄參(浙江，批號為210518)、生地黃(河南，批號為210710)、當歸(甘肅，批號為201010)、丹參(山東，批號為210810)和甘草(新疆，批號為210302)，均購自國藥控股股份有限公司。綠原酸對照品(批號為110753-202018，含量為96.1%)、梓醇對照品(批號為110808-202112，含量為98.8%)購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜級，其余試劑均為分析純，miliQ超純水。

2 方法與結果

2.1 加味四妙勇安湯提取物的制備

通過L9(34)正交試驗優(yōu)選制備工藝[9]，以浸膏量及綠原酸的含量為綜合評價指標，選定最佳提取工藝為：加8倍量水，密封煎煮3次，每次1 h。提取液濾過，濾液合并，濃縮至1 g浸膏約相當于1.35 g原藥材，同法制備3批樣品(批號為20211117、20211119和20211121)。

2.2 綠原酸的測定

2.2.1 色譜條件：色譜柱為Merck Purospher? STARLP RP-18 endcapped柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.4%磷酸(V∶V=11∶ 89)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為327 nm；柱溫為35 ℃；進樣體積為5 μL[10-11]。

2.2.2 溶液制備：(1)對照品溶液的制備。稱取綠原酸對照品，精密稱定質量為4.60 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含綠原酸442.0 μg/mL的儲備液。精密量取適量，加50%甲醇稀釋成44.20 μg/mL的綠原酸對照品溶液。(2)供試品溶液的制備。精密稱取加味四妙勇安湯提取物(批號為20211117)1.149 01 g，置于錐形瓶中，加入50%甲醇30 mL，超聲(頻率100 Hz)30 min，冷卻，轉入50 mL容量瓶中，定容，經微孔濾膜(0.22 μm)濾過，續(xù)濾液即為供試品溶液。(3)陰性樣品溶液的制備。取除去金銀花的加味四妙勇安湯組方，按“2.1”法提取后，按“2.2.2(2)”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.3 方法學考察：(1)系統(tǒng)適用性試驗。精密量取“2.2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按“2.2.1”項下方法進樣測定。結果綠原酸峰理論塔板數(shù)為11 098，與前后雜質的分離度為12.79和2.73，見圖1。

A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性樣品溶液；1.綠原酸(tR=11.219 min)

(2)線性關系考察。精密量取“2.2.2(1)”項下綠原酸儲備液適量，加50%甲醇溶液依次稀釋，分別制成含綠原酸質量濃度為442.0、176.8、44.20、22.10、8.840和4.420 μg/mL的對照品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以橫坐標為對照品溶液質量濃度(C，μg/mL)，縱坐標為峰面積(Y)繪制標準曲線，得回歸方程Y=16.224C-38.659，r=0.999 8(n=6)。結果表明，綠原酸在4.420～442.0 μg/mL范圍內質量濃度與峰面積成良好的線性關系。

(3)最低檢測限和定量限。精密量取44.20 μg/mL對照品溶液，加50%甲醇依次稀釋進樣測定，當S/N≥3時，最低檢測限度為0.40 ng；當S/N≥10時，定量限為1.20 ng。

(4)精密度試驗。取44.20 μg/mL綠原酸對照品溶液，按“2.2.1”項下方法連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結果顯示，綠原酸峰面積的RSD為0.71%(n=6)，表明儀器精密度良好。

(5)穩(wěn)定性試驗。取供試品溶液，分別在0、1、2、4、8和12 h各測定1次。結果顯示，綠原酸峰面積的RSD為0.92%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

(6)重現(xiàn)性試驗。稱取加味四妙勇安湯提取物(批號為20211117)適量，精密稱定，按“2.2.2(2)”項下方法制成供試品溶液6份，分別進樣測定，記錄色譜圖，計算綠原酸的含量。結果顯示，綠原酸平均含量為(2.35±0.03)mg/g，RSD為1.19%。

(7)加樣回收試驗。取樣品(批號為20211117，綠原酸含量為2.35 mg/g)約1 g，共9份，各精密稱定，按“2.2.2(2)”項下方法制備。各精密量取2 mL，分別置于5 mL容量瓶中，精密加入442.0 μg/mL綠原酸對照品溶液160、200和240 μL各3份，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2.1”項下方法進樣測定，計算回收率，結果見表1。

表1 綠原酸加樣回收試驗結果(n=9)

2.3 梓醇的測定

2.3.1 色譜條件：色譜柱為Merck Purospher? STARLP RP-18 endcapped柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～15 min，0.8%A；15～60 min，2%A)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為210 nm；柱溫為35 ℃；進樣體積為20 μL[12-13]。

2.3.2 溶液的制備：(1)對照品溶液的制備。稱取梓醇對照品，精密稱定質量為4.94 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%磷酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含梓醇488.0 μg/mL的儲備液。精密量取適量，加0.1%磷酸稀釋成48.80 μg/mL的梓醇對照品溶液。(2)供試品溶液的制備。精密稱取加味四妙勇安湯提取物(批號為20211117)1.211 86 g，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲(頻率100 Hz)處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液10 mL置于錐形瓶中，濃縮，殘渣加0.1%磷酸溶解，轉至10 mL容量瓶中，加0.1%磷酸至刻度，搖勻，經微孔濾膜(0.22 μm)濾過，續(xù)濾液即為供試品溶液。(3)陰性樣品溶液的制備。取除去地黃的加味四妙勇安湯組方，按“2.1”項下方法提取后，按“2.3.2(2)”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3.3 方法學考察：(1)系統(tǒng)適應性試驗：精密吸取“2.3.2”項下制備的對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按“2.3.1”項下方法進樣測定。結果顯示，梓醇峰理論塔板數(shù)為10 372，與前后雜質的分離度為1.51和3.68，見圖2。

A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性樣品溶液；1.梓醇(tR=10.125 min)

(2)線性關系考察。精密量取“2.3.2(1)”項下梓醇儲備液適量，加0.1%磷酸依次稀釋，分別制成含梓醇質量濃度為488.0、244.0、97.60、48.80、24.40和9.760 μg/mL的對照品溶液。按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以橫坐標為對照品溶液質量濃度(C，μg/mL)，縱坐標為峰面積(Y)繪制標準曲線，得回歸方程Y=4.920 3C+6.484 3，r=0.999 9(n=6)。結果表明，梓醇在9.760～488.0 μg/mL范圍內質量濃度與峰面積成良好的線性關系。

(3)最低檢測限和定量限。精密量取48.80 μg/mL梓醇對照品溶液，加0.1%磷酸依次稀釋進樣測定，當S/N≥3時，最低檢測限度為0.82 ng；當S/N≥10時，定量限為2.44 ng。

(4)精密度試驗。取48.80 μg/mL梓醇對照品溶液，按“2.3.1”項下方法連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結果顯示，梓醇峰面積的RSD為0.45%(n=6)，表明儀器精密度良好。

(5)穩(wěn)定性試驗。取供試品溶液，分別在0、1、2、4、8和12 h各測定1次。結果顯示，梓醇峰面積的RSD為0.88%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

(6)重現(xiàn)性試驗。取加味四妙勇安湯提取物(批號為20211117)適量，按“2.3.2(2)”項下方法制成供試品溶液6份，分別進樣測定，記錄色譜圖，計算梓醇含量。結果顯示，梓醇平均含量為(0.872 1±0.012 6)mg/g，RSD為1.44%。

(7)加樣回收試驗。取樣品(批號為20211117，梓醇含量為0.872 1 mg/g)約1 g，共9份，各精密稱定，按照“2.3.2(2)”項下方法制備。各精密量取2 mL，分別置于5 mL容量瓶中，精密加入488.0 μg/mL梓醇對照品溶液160、200和240 μL各3份，加0.1%磷酸稀釋至刻度，搖勻，按“2.3.1”項下方法進樣測定，計算回收率，結果見表2。

表2 梓醇加樣回收試驗結果(n=9)

2.4 樣品測定

取3批樣品，分別按“2.2.1”和“2.3.1”項下色譜條件進樣測定綠原酸和梓醇的含量，結果見表3。

表3 樣品中綠原酸和梓醇的含量檢測結果(n=3)

3 討論

3.1 洗脫條件的選擇

檢測綠原酸時[14-16]，實驗前期分別考察了不同流動相體系(甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.4%磷酸溶液)對色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)色譜峰的峰形效果較好時流動相為乙腈-0.4%磷酸。當采用乙腈-0.4%磷酸(V∶V=13∶ 87)為流動相時，tR=8.046 min，但供試品溶液色譜圖中綠原酸與其相鄰成分無法分離；減少乙腈比例，即乙腈-0.4%磷酸(V∶V=10∶ 90)，發(fā)現(xiàn)供試品色譜圖中綠原酸與相鄰峰分離很好，但tR=13.675 min，保留時間較長。最終確定乙腈-0.4%磷酸(V∶V=11∶ 89)為流動相時，供試品色譜圖中綠原酸與相鄰峰達到有效分離，保留時間適宜(tR=11.220 min)，方法學試驗結果良好。檢測梓醇時[17-18]，實驗前期比較了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.4%、0.1%磷酸等不同流動相體系，發(fā)現(xiàn)色譜峰的分離效果較好時流動相為乙腈-0.1%磷酸。當調節(jié)流動相乙腈-0.1%磷酸的比例為V∶V=0.8∶ 99.2，結果梓醇的tR=10.125 min，與前后雜質峰分離良好，但供試品中雜質峰較多，洗脫時間較長，故等度洗脫15 min后，改為梯度洗脫，增加乙腈比例，供試品溶液中多種成分被洗脫干凈。

3.2 供試品溶液制備超聲時間的選擇

參考文獻[14-16]，綠原酸超聲溶劑選擇50%甲醇30 mL，分別超聲處理15、30和45 min，測定結果發(fā)現(xiàn)超聲30 min即可將有效成分溶解完全，滿足樣品的分析。而在梓醇測定時發(fā)現(xiàn)[17-18]，取“2.3.2”項下供試品溶液超聲30 min可將有效成分完全溶解，因此，均選定超聲時間為30 min。

3.3 結果分析

加味四妙勇安湯方中金銀花味甘，性寒，歸肺、心、胃經，為清熱解毒之良藥，為方中君藥；玄參、地黃，甘潤之品，瀉火解毒，養(yǎng)陰涼血，一可加強君藥清熱解毒之力，二可涼血養(yǎng)陰，二者共為臣藥；再配伍活血散淤之當歸、丹參，能活血通絡、化瘀止痛，共為方中佐藥。另外，綠原酸具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、降血糖和免疫調節(jié)等作用[19-20]；梓醇是中藥地黃的有效成分，具有降血糖、調血脂及神經細胞保護等多方面的藥理作用[8]。因此，結合方解及主要成分的藥理作用，將方中君藥金銀花中的主要成分綠原酸和臣藥地黃中主要成分梓醇作為質量控制的指標。本實驗制備的加味四妙勇安湯的3批提取物中，綠原酸的平均含量為(2.37±0.04)mg/g，RSD為1.48%；梓醇的平均含量為(0.891 3±0.010 3)mg/g，RSD為1.15%。且研究結果表明，采用RP-HPLC法測定加味四妙勇安湯中綠原酸和梓醇的含量，方法穩(wěn)定，重復性好，結果可靠，該方法可用于控制加味四妙勇安湯提取工藝及提取物的質量。