肩關(guān)節(jié)軸向拔伸法對(duì)兔肩周炎模型炎癥因子表達(dá)的影響*

周 進(jìn)，范 蕓，段必雙，李盈盈，李英菁，涂添添，喻 俊

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿康復(fù)學(xué)院，云南 昆明 650504)

肩周炎是臨床常見病多發(fā)病，好發(fā)于50歲左右的女性，主要病因?yàn)閯趽p、受風(fēng)寒濕邪侵襲、制動(dòng)等導(dǎo)致肩關(guān)節(jié)周圍的肌肉、韌帶、滑膜等軟組織出現(xiàn)慢性炎癥，進(jìn)而局部軟組織黏連，臨床多表現(xiàn)為肩部疼痛，夜間痛甚，肩部活動(dòng)功能漸進(jìn)性受限。肩周炎在治療時(shí)因?yàn)榫植拷M織黏連會(huì)導(dǎo)致療程長(zhǎng)、效果差，手法剝離黏連時(shí)，患者疼痛加劇，難以忍受，心理負(fù)擔(dān)較重，這些問題都是肩周炎治療過程中面臨的困難[1]。通過臨床觀察，肩關(guān)節(jié)軸向拔伸法對(duì)黏連期肩周炎有明顯療效，它可以減輕局部疼痛，松解局部黏連，使肩部活動(dòng)功能得以改善[2]，該手法臨床效果明顯，但一直缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)通過肩關(guān)節(jié)軸向拔伸法干預(yù)兔肩周炎模型耳緣靜脈血清TNF-α、IL-6及患肩滑膜及肌肉組織中PGE-2、TGF-β1的表達(dá)，探討肩關(guān)節(jié)軸向拔伸法治療肩周炎的療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物分組 選體重在1.6～2.3 kg成年實(shí)驗(yàn)家兔，共40只，由昆明市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(艾尼莫公司)提供，由云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室喂養(yǎng)，室溫18℃～24℃，濕度35%～55%，實(shí)驗(yàn)環(huán)境保持干凈衛(wèi)生。先進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，1周以后隨機(jī)分成4組，每組10只：空白組、模型組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均按照科技部〔2006〕398號(hào)文件執(zhí)行[3]，嚴(yán)格實(shí)施，以動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)定善待動(dòng)物，對(duì)其處置均符合要求。

1.2 主要儀器設(shè)備 廠家及名稱：安徽中科中佳公司提供低溫高速離心機(jī)，型號(hào)：SC-3610；中科美菱公司提供低溫冰箱(-80℃)；美國(guó)eppendorf公司提供微量加樣器(10μl)、多通道移液器(300ul)；美國(guó)伯樂公司提供全自動(dòng)酶標(biāo)儀，型號(hào)：Model 550；美國(guó)Millipore公司提供Milli-Q純水器；常熟市學(xué)科電器有限公司提供制冰機(jī)；北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司提供旋渦混合器；江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠提供ZD-9556水平搖床。

1.3 主要試劑 廠家及名稱：北京晶美生物工程公司提供TNF-α、IL-6酶免試劑盒；北京綠源伯德生物公司提供PGE-2酶免試劑盒；武漢賽培生物公司提供TGF-β1酶免試劑盒；昆明制藥廠提供碘伏消毒劑、75%乙醇、0.9%氯化鈉注射液；北京化學(xué)試劑廠提供水合氯醛。

1.4 模型兔制作 采用模擬風(fēng)寒濕邪環(huán)境加持續(xù)勞損法[4]制作兔肩周炎模型。以家兔右肩峰端為中心，在直徑約7 cm的面積用Na2S脫毛。先將家兔仰臥在操作臺(tái)上，然后固定左前肢和雙后肢，松緊適度，右前肢遠(yuǎn)端和電動(dòng)振蕩器固定，使肩關(guān)節(jié)搖動(dòng)，其余關(guān)節(jié)可以固定，盡量不要搖動(dòng)，270次/min的頻率，1.5 cm的振幅，連續(xù)3 d，每天至少8 h不間斷。專人固定查看搖動(dòng)情況，注意右前肢不要松動(dòng)和脫落。然后將家兔右前肢固定在兔籠上，用冷凍后的小號(hào)藍(lán)冰袋外敷家兔右肩部，及時(shí)更換融化后的藍(lán)冰袋，連續(xù)3 d，每天至少外敷8 h。調(diào)電吹風(fēng)為冷風(fēng)模式，在搖動(dòng)和冰敷期間，持續(xù)吹家兔右肩。3 d后觀察家兔情況，發(fā)現(xiàn)其右前肢外翻，活動(dòng)功能受限，爬行朝右側(cè)偏斜，表明家兔右肩有疼痛反應(yīng)。通過肉眼觀察家兔右肩軟組織腫脹，局部有充血或瘀斑，提示造模成功[5]。造模后正常喂養(yǎng)3 d開始實(shí)驗(yàn)干預(yù)。

1.5 干預(yù)方法 空白組常規(guī)飼養(yǎng)，不造模不予手法治療；模型組常規(guī)飼養(yǎng)，造模但不予手法治療；對(duì)照組采用推拿常規(guī)手法治療，每日上午10∶00～12∶00時(shí)由推拿專業(yè)研究生專人固定操作，每次干預(yù)時(shí)間為20 min；實(shí)驗(yàn)組予肩關(guān)節(jié)軸向拔伸手法，也是每日上午10～12時(shí)由推拿專業(yè)研究生專人固定操作，每次干預(yù)時(shí)間為20 min；對(duì)照組和模型組均連續(xù)手法治療20 d。

1.5.1 常規(guī)推拿手法[6]將模型兔仰臥在操作臺(tái)上，左前肢及雙后肢固定，用按揉法及彈撥法在右前肢肩部施術(shù)，松解肩部緊張的肌肉、肌腱等軟組織，以及肩胛骨周圍；再?gòu)棑芗缜昂缶o張的肌筋膜，共8 min。接著，點(diǎn)壓肩周穴位，如肩井、肩髃、肩貞等，在黏連處施彈撥法，共5 min。然后，一手扶住家兔右前肢肩部，另一手扶肘部，由小到大的幅度環(huán)轉(zhuǎn)搖動(dòng)肩部，共5 min。最后再內(nèi)收、外展、后伸右前肢，內(nèi)外旋轉(zhuǎn)肩關(guān)節(jié)，共2 min，結(jié)束治療。

1.5.2 肩關(guān)節(jié)軸向拔伸手法 將模型兔仰臥在操作臺(tái)上，左前肢及雙后肢固定，用按揉法及彈撥法在右前肢肩部施術(shù)，松解肩部緊張的肌肉、肌腱等軟組織，以及肩胛骨周圍；再?gòu)棑芗缜昂缶o張的肌筋膜，共5 min。接著，點(diǎn)壓肩周穴位，如肩井、肩髃、肩貞等，在黏連處施彈撥法，共4 min。充分放松肩部軟組織，再用肩關(guān)節(jié)軸向拔伸法治療，步驟為：(1)外展患肢，外展?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行拔伸，持續(xù)用力，力量由輕到重，再由重到輕，在拔伸的同時(shí)進(jìn)行內(nèi)外旋轉(zhuǎn)肩關(guān)節(jié)。(2)上舉患肢，上舉狀態(tài)下進(jìn)行拔伸，持續(xù)用力，輕重交替，在拔伸同時(shí)進(jìn)行內(nèi)外旋轉(zhuǎn)肩關(guān)節(jié)。(3)后伸患肢，后伸狀態(tài)下進(jìn)行拔伸，持續(xù)用力，內(nèi)外旋轉(zhuǎn)肩關(guān)節(jié)。上述手法反復(fù)施術(shù)，直到黏連之患肩有所松動(dòng)，共10 min。最后，在患肩周圍按揉，手法輕柔滲透，來回搓動(dòng)患側(cè)肩部及上肢，共1 min，結(jié)束治療。

1.6 標(biāo)本采集 所有動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 d取材。首先在各組模型兔的耳緣靜脈取血各5 mL，以備檢測(cè)血清TNF-α、IL-6的含量；然后以10%水合氯醛、2 mL/kg體重比例，注射入耳緣靜脈，待麻醉完全后快速取材，在肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊等部位取大小相同的組織塊放置在平整的冰面上，用0.9NS%漂洗表面血水，干凈后放入離心管，送至實(shí)驗(yàn)室以-5℃低溫保存待測(cè)。最后以注射空氣法，在耳緣靜脈注入10 mL左右空氣，處死家兔。在實(shí)驗(yàn)過程中因腸道感染死亡8只兔，分別為空白組1只、模型組2只，對(duì)照組2只，實(shí)驗(yàn)組3只。

1.7 指標(biāo)檢測(cè) 備好無抗凝劑的真空采血管，將各組抽取的耳緣靜脈血(5 mL)置于采血管中，室溫下自然凝固約15 min，在4℃條件下以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心20 min，再分離血清，取上清液，貯存在零下70℃冰箱里待測(cè)。備好勻漿介質(zhì)(成分：ph7.4、0.01 mol/L Tris-HC1、0.0001 mol/L EDTA 0.01 mol/L蔗糖、PMSF 0.1 mmol/L、BSA 0.1%)，將取好的組織塊放入冰水中，按10%比例放入勻漿介質(zhì)，用手術(shù)剪剪碎組織塊，超聲勻漿30 s，在4℃條件下以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心20 min，取上清液，存放在零下70℃冰箱中待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，嚴(yán)格按試劑盒操作步驟檢測(cè)TNF-α、IL-6、PGE-2、TGF-β1。

2 結(jié)果

2.1 4組局部組織肉眼觀察結(jié)果 空白組從外觀上觀察，局部形態(tài)正常，皮膚顏色透亮，肌腱組織收縮有彈性；肌肉組織飽滿、收縮有韌性、顏色紅潤(rùn)；滑膜組織薄亮，收縮有緊致感。模型組肩部形態(tài)腫脹，可見肌腱組織充血腫脹，彈性差；肌肉組織色深紅或瘀斑，收縮韌性差，關(guān)節(jié)腔中有少量淡黃色液體滲出；滑膜組織稍厚，顏色較暗，收縮乏力。對(duì)照組的肌腱組織顏色白亮，收縮時(shí)柔韌性稍好；肌肉組織色暗，光澤度較差，關(guān)節(jié)腔中有少量微黃色液體滲出；滑膜組織較薄。實(shí)驗(yàn)組肩部肌腱組織光亮，柔韌性好；肌肉組織色鮮紅，收縮彈性好，關(guān)節(jié)腔滑液顏色清澈；滑膜組織外觀薄亮，收縮有緊致感。

2.2 4組實(shí)驗(yàn)兔肩關(guān)節(jié)腫脹程度比較 4組兔干預(yù)前后肩關(guān)節(jié)周長(zhǎng)變化為：對(duì)造模后的三組家兔肩關(guān)節(jié)周長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)均顯著增大(P<0.01)；干預(yù)后，測(cè)量對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組肩關(guān)節(jié)周長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)均顯著減小(P<0.01)；測(cè)量干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組肩關(guān)節(jié)周長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)較對(duì)照組顯著減小(P<0.01)，見表1。

表1 各組兔干預(yù)前后肩關(guān)節(jié)周長(zhǎng)比較

2.3 4組實(shí)驗(yàn)兔血清TNF-α、IL-6水平比較 模型組與空白組比較，血清TNF-α、IL-6表達(dá)均顯著增加(P<0.01)；對(duì)照組與模型組比較，血清TNF-α、IL-6表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，血清TNF-α、IL-6表達(dá)均顯著降低(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，血清TNF-α、IL-6表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組兔血清TNF-α、IL-6水平變化比較

2.4 4組兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中PGE-2含量比較 空白組實(shí)驗(yàn)兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中PGE-2有少量表達(dá)，模型組中PCE-2含量較空白組顯著升高(P<0.01)；對(duì)照組中PCE-2含量較模型組下降明顯(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組中PCE-2含量較模型組顯著下降(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組中PCE-2含量較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中PGE-2含量變化比較

2.5 四組兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中TGF-β1含量比較 空白組實(shí)驗(yàn)兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中TGF-β1有少量表達(dá)，模型組中TGF-β1含量較空白組顯著升高(P<0.01)；對(duì)照組中肱二頭肌、岡上肌、滑膜囊中TGF-β1含量較模型組下降明顯(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組中TGF-β1含量較模型組顯著下降，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組肱二頭肌、岡下肌中TGF-β1含量較對(duì)照組顯著下降(P<0.01)。詳見表4。

表4 各組兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中TGF-β1含量變化比較

3 討論

迄今為止，許多學(xué)者對(duì)肩周炎進(jìn)行了大量研究，但其病因病理仍不清楚，因此有很多病因病理學(xué)說存在。有研究發(fā)現(xiàn)，肩周炎的發(fā)生和許多因素都有相關(guān)性，如糖代謝異常、甲狀腺疾病、器質(zhì)性心臟病等[7]。糖尿病的病理過程可以導(dǎo)致繼發(fā)性肩周炎[8]，病理改變主要是引起細(xì)小血管硬化、內(nèi)分泌失調(diào)等，從而導(dǎo)致肌肉肌腱等軟組織病變，這些病理變化可以加重肩關(guān)節(jié)纖維化，引起許多炎癥因子釋放，進(jìn)一步導(dǎo)致肩部關(guān)節(jié)滑膜和韌帶復(fù)合體的炎性反應(yīng)和纖維變性[9-10]。王正和等[11]臨床研究表明，患者不斷受到風(fēng)寒侵襲，肩部的血液循環(huán)受阻和代謝異常，肩關(guān)節(jié)及其周圍會(huì)出現(xiàn)無菌性炎性反應(yīng)和黏連，最終導(dǎo)致肩部疼痛、活動(dòng)受限。王緒輝[12]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察到模型兔肩部細(xì)小血管充血，炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，包括局部組織缺血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、變性等病理變化，這都和人類肩周炎病理過程類似。

近年來許多學(xué)者對(duì)肩周炎的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了臨床及基礎(chǔ)研究。褚立希等[13]發(fā)現(xiàn)肩周炎患者肩部毛細(xì)血管擴(kuò)張，炎性反應(yīng)較重，組織液滲出導(dǎo)致水腫和壞死，影響了局部代謝，引起痛性物質(zhì)釋放導(dǎo)致疼痛。Neviaser[14]通過手術(shù)活檢患者的攣縮關(guān)節(jié)囊，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)囊炎變。

Deplma通過手術(shù)發(fā)現(xiàn)患者肩部也有炎癥反應(yīng)，這和關(guān)節(jié)周圍肌腱不斷滑動(dòng)有關(guān)。Ogilvie[15]在關(guān)節(jié)鏡檢查中觀察到患者肩部關(guān)節(jié)囊周圍有纖維化和滑膜炎。Omari[16]認(rèn)為，肩周炎的產(chǎn)生主要是滑膜炎以及各種炎性細(xì)胞、膠原及纖維細(xì)胞異常增殖，導(dǎo)致關(guān)節(jié)囊攣縮。Bunker等[17]對(duì)手術(shù)采集的標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)和免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肩周炎的本質(zhì)是纖維增生。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的大量研究，認(rèn)為炎癥反應(yīng)和局部組織纖維化是肩周炎的病理基礎(chǔ)。一些學(xué)者的研究結(jié)果表明，肩周炎局部炎癥反應(yīng)和修復(fù)過程都是大量炎性細(xì)胞因子參與的結(jié)果[18]。炎性細(xì)胞因子主要包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和前列腺素E-2(PGE-2)。TNF-α是一種多肽細(xì)胞因子，它是由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的。作為重要介質(zhì)參與多種生理反應(yīng)和免疫反應(yīng)，和一些細(xì)胞因子維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，也介導(dǎo)感染、創(chuàng)傷等病理過程。商得俊[19]發(fā)現(xiàn)，TNF-α在肩周炎患者的血清中明顯升高，從而釋放出大量的炎癥介質(zhì)，同時(shí)誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6，IL-8)產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)，參與疼痛的發(fā)生、發(fā)展和結(jié)局。IL-6是多效細(xì)胞因子之一，可把炎癥細(xì)胞聚集在一起，激活和釋放炎癥介質(zhì)，不斷加速炎癥過程。PCE-2是一種由巨噬細(xì)胞合成和釋放的重要炎性致痛物質(zhì)，它可參與一系列炎癥和免疫病理生理過程。我們已知過度勞損會(huì)導(dǎo)致肩周炎。在勞損應(yīng)變過程中，肩部組織的氧化代謝增強(qiáng)，細(xì)胞膜通透性增加，線粒體膨脹，溶酶體釋放大量炎癥性致痛物質(zhì)，如PGE-2、5-羥色胺、緩激肽等，引起肩部周圍軟組織的無菌性炎癥和疼痛[20]。肩周炎局部組織纖維化的過程主要與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)有關(guān)。TGF-β1是一種有巨大生物學(xué)活性的，促進(jìn)傷口愈合的細(xì)胞因子，它在纖維化和瘢痕形成過程中起到關(guān)鍵作用[21-22]。Rodeo SA等[23]研究顯示，原發(fā)性肩周炎和繼發(fā)性肩周炎患者肩關(guān)節(jié)囊中TGF-β1及其受體的表達(dá)明顯升高。李宏云等[24]也發(fā)現(xiàn)肩周炎患者肩袖間隙組織中TGF-β mRNA的表達(dá)水平明顯升高，這說明TGF-β1對(duì)肩周炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，肩周炎的病理過程離不開炎癥因子和炎癥引起的纖維化，這種無菌性炎癥會(huì)導(dǎo)致疼痛和組織黏連，從而導(dǎo)致肩關(guān)節(jié)功能障礙[25]。

肩關(guān)節(jié)軸向拔伸法遵循肩關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)學(xué)原理，對(duì)于不同的黏連病理采用相應(yīng)的體位和松解步驟，具有明確的解剖學(xué)基礎(chǔ)，軸向手法松解力可直達(dá)病灶局部，通過對(duì)病灶的松解剝離，解除病灶局部組織的黏連，起到“松、動(dòng)、通”的作用，從而緩解疼痛，達(dá)到恢復(fù)肌肉組織正常解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的目的。通過和傳統(tǒng)推拿手法治療對(duì)比，肩關(guān)節(jié)軸向拔伸法治療肩部病變的軟組織更為直接和具有針對(duì)性，其粘連組織得到有效松解，炎癥得到消除，腫脹明顯減小，從而恢復(fù)肩關(guān)節(jié)局部正常組織形態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模后兔肩周炎模型TNF-α、IL-6、PGE-2、TGF-β1表達(dá)明顯升高，說明局部炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，符合肩周炎病理過程。肩關(guān)節(jié)軸向拔伸法可顯著改善肩周炎模型兔滑膜及肌肉組織病理學(xué)改變，降低PGE-2、TGF-β1表達(dá)水平，也可以下調(diào)血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平，因此可以推測(cè)，肩關(guān)節(jié)軸向拔伸法的作用機(jī)制為改善肩周炎病變局部組織病理變化，促進(jìn)組織修復(fù)，減少肩關(guān)節(jié)滑膜及肌肉組織中炎癥因子PGE-2、TGF-β1的釋放，減輕肩周炎局部組織炎癥反應(yīng)；還可以調(diào)節(jié)全身免疫，降低血清TNF-α、IL-6水平，通過整體和局部抗炎鎮(zhèn)痛對(duì)肩周炎起到治療作用。而且降低炎癥因子方面優(yōu)于傳統(tǒng)推拿手法，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上，肩關(guān)節(jié)軸向拔伸法能有效改善肩周炎導(dǎo)致的全身和局部癥狀，而且可以抑制炎癥因子的表達(dá)和改善局部病理組織形態(tài)。