藥用膠塞常用抗氧劑及可提取硫含量測定方法

成婕，張羅紅，江燕，邱怡婷，任錕

藥用膠塞常用抗氧劑及可提取硫含量測定方法

成婕，張羅紅，江燕，邱怡婷，任錕

（四川省藥品檢驗研究院，成都 610000）

建立一種高效液相色譜法，以同時檢測藥用膠塞中多種抗氧劑和可提取硫。采用二氯甲烷作為提取溶劑，微波萃取藥用膠塞中的目標化合物，用高效液相色譜法測定目標物的含量。色譜柱為Waters Symmetry RP 18，流動相為乙腈甲醇水，梯度洗脫，檢測波長為277 nm。該方法能高效地分離目標化合物，各化合物分離度良好。在0.2～20 μg/mL內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)≥0.999 3，檢測限為0.03～0.09 μg/mL，回收率為86.73%～108.91%，相對標準偏差RSD為0.47%～5.68%。通過該種方法測定不同廠家不同批次藥用膠塞，結(jié)果檢出了抗氧劑BHT及其降解物BHT–CHO、BHT–Q，抗氧劑1076和1010及其降解物1310，以及可提取硫。文中建立的高效液相方法準確、簡便、靈敏度較高，能夠高效快速地測定藥用膠塞中常用抗氧劑及其降解產(chǎn)物與可提取硫的含量。

高效液相色譜法；抗氧劑；抗氧劑降解產(chǎn)物；可提取硫；二氯甲烷；微波萃取

在注射劑用藥品包裝密封系統(tǒng)中，彈性體（藥用膠塞）是最重要的組件之一。為了提高藥用膠塞的性能，膠塞配方中加入了多種配合劑，按配合劑用途分類，主要有防老劑（抗氧劑）、防膠劑、填充劑、活性劑、硫化劑及硫化促進劑等[1-5]。文中主要對藥用膠塞中的抗氧劑與硫化劑進行研究與討論。常用抗氧劑按結(jié)構(gòu)分為受阻胺類、受阻酚類、亞磷酸酯類等[6]。由于受阻胺類抗氧劑降解后可能產(chǎn)生亞硝胺等毒性較大的產(chǎn)物，因此，藥用膠塞中較少加入該類抗氧劑。膠塞中較為常用的抗氧劑主要有受阻酚類的BHT、1070、1010、330、3114以及亞磷酸酯類的168[7-9]。由于藥用膠塞與藥品直接接觸，在長期運輸和貯存中，抗氧劑可能會遷移至藥物中，影響藥品質(zhì)量，危害人體健康，因此，對抗氧劑種類的選擇及含量的控制至關(guān)重要[10-12]。

藥用膠塞中加入可提取硫后，能夠提高其物理性能與化學性能[13-15]，但該化合物易析出并附著于膠塞表面，從而遷移至被包裝藥物中，影響藥物質(zhì)量，因此控制可提取硫的添加量是非常必要的[16]。

文中收集了多個廠家多個批次的藥用膠塞，旨在全面分析藥用膠塞中常用抗氧劑與可提取硫。同時，參考相關(guān)文獻[6-18]，建立一種高效液相色譜分析方法，能一次性分離12種常用抗氧劑和可提取硫。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

主要儀器：LC–20A液相色譜儀（日本島津公司）、MARS微波消解儀（美國CEM公司）、AL–204–IC電子天平（賽多利斯公司）、AS5150A超聲儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

主要試劑：甲醇、乙腈，色譜純，F(xiàn)isher Chemical；冰醋酸，色譜純，CNW GmbH公司；BHT–OH、BHT–COOH、1310、3114、330、1076，BEIJING MANHAGE BIO–TECH公司；BHT–CHO、BHT–Q，Adamas Reagent公司；2,4–DBP，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；BHT，ANPEL公司；1010，SIGMA–ALDRICH；游離硫，Shanghai Titan Scientific公司。各對照品具體信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

以Waters Symmetry RP 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱；流動相A為純乙腈，流動相B為純甲醇，流動相C為體積分數(shù)為1%的醋酸–水溶液；柱溫為35 ℃；檢測波長為277 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL，流動相梯度洗脫程序見表2。

1.2.2 溶液的制備

1）供試品溶液的制備。將待測膠塞剪碎成5 mm×5 mm左右的小顆粒，稱取碎膠塞約0.5 g，裝入微波消解罐中，加入10 mL二氯甲烷，在40 ℃條件下微波消解45 min，冷卻至室溫。用玻璃漏斗過濾，除去膠塞，將濾液抽真空旋蒸，除去二氯甲烷溶劑。然后用5 mL甲醇復溶，將復溶后的液體轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，甲醇定容，即得。

表1 對照品信息

Tab.1 Information on reference substances

表2 梯度洗脫程序

Tab.2 Gradient elution program

2）對照品儲備液的制備。精密稱取標準品BHT–OH、BHT–COOH、BHT–CHO、BHT–Q、2,4–DBP、BHT、3114、1010、330、1076、1310、168及可提取硫各50.0 mg，置于50 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，配置成質(zhì)量濃度約為1 000 μg/mL的混合對照品標準儲備液。

1.2.3 線性關(guān)系考察

取上述對照品溶液適量，制成系列線性關(guān)系工作溶液，回歸方程與線性范圍見表3，各化合物在0.2～20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 3～0.999 9。

表3 回歸方程、線性范圍、檢測限和定量限

Tab.3 Regression equation, linear range, limits of detection and limits of quantification

1.2.4 檢測限與定量限考察

取上述照品溶液適量，稀釋成所需濃度，以信噪比/=3時為儀器的檢測限，以信噪比/=10時為儀器的定量限，結(jié)果見表3，儀器檢測限為0.03～0.09 μg/mL，儀器定量限為0.10～0.32 μg/mL。

1.2.5 精密度試驗

取質(zhì)量濃度約為5 μg/mL 的對照品溶液，分別進樣6次，各化合物峰面積的RSD為0.23%～3.11%，=6，結(jié)果見表4，結(jié)果表明，儀器進樣精密度良好。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗

取質(zhì)量濃度約為5 μg/mL的對照品溶液，在室溫分別放置0、4、7、15、48、66 h。各化合物峰面積的RSD為0.62%～3.81%，=6，結(jié)果見表4，表明對照品溶液放置66 h后穩(wěn)定。

1.2.7 回收率試驗

精密稱取剪碎的膠塞0.5 g，裝入微波消解管中，加入上述對照品溶液，照“1.2.2節(jié)”方法制樣。結(jié)果表明，13種目標物的平均加標回收率為86.73%～108.91%，相對標準偏差RSD為0.47%～5.68%，見表4。表明該方法具有良好的準確度，能滿足實際測試要求。

1.2.8 膠塞含量測定

取待測膠塞適量，按照“1.2.2節(jié)”方法制樣，測定結(jié)果見表5。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

本次研究對所檢測的化合物進行紫外吸收波長的考察，各化合物的紫外吸收波長為256～290 nm，為了兼顧各化合物的靈敏度，選擇了各化合物均有較強吸收的波長（277 nm），作為檢測波長。

2.2 流動相的選擇

本次研究選擇梯度洗脫，確保各化合物能夠達到良好的分離效果。根據(jù)多篇文獻研究比較其使用的流動相體系，大多數(shù)文獻使用甲醇–水為梯度洗脫溶劑，針對本次研究的化合物，用該體系作為流動相分離度較差。通過多次試驗比較，發(fā)現(xiàn)甲醇–乙腈–1%醋酸水溶液的流動相體系適用于本次化合物的分離，見圖1。使用1%醋酸–水溶液能防止拖尾，使各化合物的峰形更好，因此，選擇用甲醇–乙腈–1%醋酸水溶液作為流動相體系，在該流動相體系下，各化合物的保留時間適中，分離度與峰形較好，基線更平穩(wěn)。

2.3 膠塞提取方法的確定

2.3.1 提取溶劑的選擇

與加熱回流提取膠塞相比，在相同溶劑和相同時間的情況下，微波萃取效率更高，因此，選擇微波萃取的方法。在微波提取試驗中，選用不同溶劑（二氯甲烷、異丙醇、正己烷），在溶劑的沸點溫度（二氯甲烷為40 ℃、異丙醇為80 ℃、正己烷為69 ℃）下，以相同的時間（45 min）對膠塞進行提取，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，3種溶劑在沸點溫度的提取結(jié)果并無顯著差異。但是，相比其他2種溶劑，二氯甲烷沸點最低，所用溫度最低，后處理更簡單方便，故選用二氯甲烷為提取溶劑。

表4 精密度、穩(wěn)定性與加標回收率

Tab.4 Precision, stabilization and recovery

表5 不同廠家的藥用膠塞中抗氧劑及可提取硫的含量測定

Tab.5 Content of antioxidants and sulfur in medicinal rubber stopper from different manufacturers

1.抗氧劑BHT，降解物BHT–OH（Degradation Product-BHT-OH）；2.抗氧劑BHT，降解物BHT–COOH（Degradation Product-BHT-COOH）；3.抗氧劑1076、1010，降解物1310（Degradation Product-1310）；4.抗氧劑BHT，降解物BHT–CHO（Degradation Product-BHT-CHO）；5.抗氧劑BHT，降解物BHT–Q (Degradation Product-BHT-Q)；6.抗氧劑168降解物2,4–DBP（Degradation Product-2,4-DBP）；7.抗氧劑BHT（Antioxidant BHT）；8.可提取硫（Sulfur）；9.抗氧劑3114（Antioxidant 3114）；10.抗氧劑1010（Antioxidant 1010）；11.抗氧劑330（Antioxidant 330）；12.抗氧劑1076（Antioxidant 1076）；13.抗氧劑168（Antioxidant 168）。

圖2 不同溶劑的提取結(jié)果比較

2.3.2 提取時間的選擇

為了考察二氯甲烷在不同時長的提取效率，分別在30、45、60 min這3個時間點進行提取，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，在提取時間為30 min時，提取含量相對較低；在提取時間為45 min和60 min時，提取含量無顯著差異，故選用45 min作為提取時間。

2.4 膠塞樣品測定結(jié)果

樣品測定結(jié)果表明（見表5），各廠家在藥用膠塞中最常添加的抗氧劑為BHT、1076、1010。為了提升膠塞的性能，生產(chǎn)廠家可能同時添加多種抗氧劑，如廠家J添加了抗氧劑BHT、1076、1010。大多數(shù)廠家添加1種或2種抗氧劑，如廠家C只添加抗氧劑BHT，廠家E添加了抗氧劑BHT、1010。從檢測結(jié)果看，膠塞中最多添加3種抗氧劑。同時，部分廠家膠塞中有檢出抗氧劑降解物，如廠家C檢出BHT的降解物BHT–Q、BHT–CHO和1076的降解物1310。在檢測的19批藥用膠塞中，只有5批未檢出可提取硫，其余批次均有檢出。

圖3 不同時間的提取結(jié)果比較

2.5 研究意義

通常情況下，藥品注射用膠塞中抗氧劑的添加不能超過3種。由于我國并未對膠塞配方制定統(tǒng)一標準，各廠家原材料來源不同，生產(chǎn)膠塞的配方工藝各異，因此，不同廠家膠塞中添加的抗氧劑各不相同。鑒于以上原因，建立一種有效方法監(jiān)控膠塞中抗氧劑和可提取硫的種類和含量是必要之舉。

3 結(jié)語

綜上，文中所提方法靈敏度高、操作簡便，能快速檢測藥用膠塞中常用抗氧劑和可提取硫的含量，為藥包材與藥品相容性試驗的研究提供一種參考方法。

[1] 馮靖, 蔡心怡, 劉言. 藥用丁基膠塞中抗氧劑—BHT和硫化劑—可提取硫的測定[J]. 藥物分析雜志, 2017, 37(4): 702-706.

FENG Jing, CAI Xin-yi, LIU Yan. Determination of Antioxidant—BHT and Vulcanizing Agent—Extractable Sulphur in Medicinal Butyl Rubber[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2017, 37(4): 702-706.

[2] 張羅紅, 黃婉莎, 張欣, 等. 藥用橡膠塞中17種多環(huán)芳烴測定方法[J]. 包裝工程, 2021, 42(17): 10-19.

ZHANG Luo-hong, HUANG Wan-sha, ZHANG Xin, et al. Determination Methodology of 17 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Pharmaceutical Rubber Stoppers[J]. Packaging Engineering, 2021, 42(17): 10-19.

[3] CORREDOR C C, HABY T A, YOUNG J D, et al. Comprehensive Determination of Extractables from Five Different Brands of Stoppers Used for Injectable Products[J]. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 2009, 63(6): 527-536.

[4] CHEN M, AO N J, ZHANG B. Comparison and Evaluation of the Thermooxidative Stability of Medical Natural Rubber Latex Products Prepared with a Sulfur Vulcanization System and a Peroxide Vulcanization System[J]. Appl Polym Sci, 2005, 98: 591-597.

[5] WANG Wei, ASIMAKOPOULOS A G, ABUALNAJA K O, et al. Synthetic Phenolic Antioxidants and Their Metabolites in Indoor Dust from Homes and Microenvironments[J]. Environmental Science & Technology, 2016, 50(1): 428-434.

[6] 李春煥, 薛維麗, 邢晟, 等. 高效液相色譜法檢測溴化丁基膠塞中11種抗氧劑及游離硫的浸出量及遷移量[J]. 分析試驗室, 2020, 39(1): 91-96.

LI Chun-huan, XUE Wei-li, XING Sheng, et al. Leaching and Migration Studies on 11 Antioxidants and Free Sulfur in Brominated Butyl Rubber Plugs[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2020, 39(1): 91-96.

[7] 余秋玲, 李根容, 龍梅, 等. 高效液相色譜法測定輸液袋中12種抗氧劑的遷移量[J]. 分析試驗室, 2021, 40(9): 1075-1079.

YU Qiu-ling, LI Gen-rong, LONG Mei, et al. Determination of Migration of 12 Antioxidants in the Infusion Bag by HPLC[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2021, 40(9): 1075-1079.

[8] 蔡心怡, 王悅雯, 馮靖, 等. 藥品包裝材料用塑料粒料中8個常用抗氧劑的含量測定[J]. 藥物分析雜志, 2020, 40(3): 523-528.

CAI Xin-yi, WANG Yue-wen, FENG Jing, et al. Determination of Eight Commonly Used Antioxidants in Plastic Pellets for Pharmaceutical Packaging Materials[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2020, 40(3): 523-528.

[9] 朱碧君, 李婷婷, 孫會敏, 等. HPLC法同時測定藥用鹵化丁基膠塞中5種抗氧劑和游離硫的含量[J]. 中國藥房, 2018, 29(18): 2475-2479.

ZHU Bi-jun, LI Ting-ting, SUN Hui-min, et al. Simultaneous Determination of 5 Antioxidants and Free Sulfur in Pharmaceutical Halogenated Butyl Rubber Stopper by HPLC[J]. China Pharmacy, 2018, 29(18): 2475-2479.

[10] 饒艷春, 左軍鳳, 熊馬建, 等. 膠塞中抗氧劑測定及其在藥品中的遷移研究[J]. 中國藥物評價, 2020, 37(5): 380-383.

RAO Yan-chun, ZUO Jun-feng, XIONG Ma-jian, et al. Determination of Antioxidants in Rubber Plugs and Study on the Migration in Drug[J]. Chinese Journal of Drug Evaluation, 2020, 37(5): 380-383.

[11] 陳蓉, 晏菊姣. 藥用丁基膠塞中抗氧劑BHT的UPLC法測定[J]. 中國藥師, 2018, 21(8): 1494-1495.

CHEN Rong, YAN Ju-jiao. Determination of Antioxidant BHT in Medicinal Butyl Rubber Plug by UPLC[J]. China Pharmacist, 2018, 21(8): 1494-1495.

[12] 李委潞, 謝博, 蘇鴻雁, 等. 輸液系統(tǒng)中抗氧劑遷移量測定的方法學研究[J]. 天津科技, 2018, 45(7): 26-28.

LI Wei-lu, XIE Bo, SU Hong-yan, et al. Determination of Antioxidant Migration in Infusion System[J]. Tianjin Science & Technology, 2018, 45(7): 26-28.

[13] 李樾, 楊會英, 王峰, 等. 藥用鹵化丁基橡膠塞中可提取硫的檢測研究[J]. 中國藥事, 2014, 28(11): 1257-1260.

LI Yue, YANG Hui-ying, WANG Feng, et al. Study on Detection of Extractable Sulphur from Medicinal Halogenated Butyl Rubber[J]. Chinese Pharmaceutical Affairs, 2014, 28(11): 1257-1260.

[14] XIANG Ke-wei, WANG Xiao-an, HUANG Guang-su, et al. Thermal Ageing Behavior of Styrene-Butadiene Random Copolymer: A Study on the Ageing Mechanism and Relaxation Properties[J]. Polym. Degrad. Stab. 2012, 97(11): 1704?1715.

[15] 張兆佳, 梁云飛, 黃展文. HPLC法測定注射用血栓通(凍干)中可提取硫的遷移含量[J]. 大眾科技, 2021, 23(4): 51-55.

ZHANG Zhao-jia, LIANG Yun-fei, HUANG. Determination of Migration Content of Extractable Sulphur in Xueshuantong for Injection(Lyophilized) by HPLC[J]. Popular Science & Technology, 2021, 23(4): 51-55.

[16] 郭舜華. 硫化體系及工藝對丁基瓶塞與生理鹽水相容性的影響[J]. 中國橡膠, 2006, 22(3): 26-28.

GUO Shun-hua. The Influence on the Compatibility between Butyl Bottle Cork and Physiological Saline from Vulcanizing System and Technology[J]. China Rubber, 2006, 22(3): 26-28.

[17] FRIES E, PUTTMANN W. Analysis of the Antioxidant Butylated Hydroxytoluene (BHT) in Water by Means of Solid Phase Extraction Combined with GC/MS[J]. Water Research, 2002, 36(9): 2319-2327.

[18] 林黃靜, 吳瑩, 張毅蘭. 三層共擠膜輸液袋中抗氧劑168降解產(chǎn)物DBP的提取和測定[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2014, 45(7): 677-680.

LIN Huang-jing, WU Ying, ZHANG Yi-lan. Extraction and Determination of DBP Degradated from Irgafos 168 in Three-Layer Co-Extrusion Film for Infusion Bag[J]. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 2014, 45(7): 677-680.

Determination of Antioxidants and Extractable Sulfur in Medicinal Rubber Stopper

CHENG Jie, ZHANG Luo-hong, JIANG Yan, QIU Yi-ting, REN Kun

(Sichuan Institute For Drug Control, Chengdu 610000, China)

The work aims to establish ahigh performance liquid chromatography (HPLC) method to detect different antioxidants and extractable sulfur in medicinal rubber plugs simultaneously. Dichloromethane was used as extraction solvent. The target compounds in medicinal rubber plugs were extracted via microwave method. Content of target was tested by the HPLC via gradient elution. Waters Symmetry RP 18 was used as chromatographic column. Acetonitrile, methanol and distilled water were used as mobile phases. The detection wave was set to 277 nm. The target compounds can be separated by HPLC efficiently. The separated products possessed excellent resolution. There was a favourable linearity in the range of 0.2-20 μg/mL with the correlation coefficient≥ 0.999 3. The detection limit of this method was 0.03-0.09 μg/mL, the rate of recovery was 86.73%-108.91% and the relative standard deviation (RSD) was 0.47%-5.68%. Medicinal rubber plugs with different batches from different manufacturers were detected by this method. As a results, antioxidant (BHT) and its degradation products (BHT-CHO, BHT-Q), antioxidants (1076 and 1010) and their degradation product (1310), as well as extractable sulfur were detected.The HPLC method established in this work is accurate, convenient and highly sensitive. It can determine the contents of antioxidants and their degradation products and extractable sulfur in common medicinal rubber plugs rapidly and efficiency.

high performance liquid chromatography; antioxidants; degradation products of antioxidants; extractable sulfur; dichloromethane; microwave-assisted extraction

TB484.9；O657.63

A

1001-3563(2023)03-0080-07

10.19554/j.cnki.1001-3563.2023.03.010

2022?03?06

成婕（1989—），女，碩士，工程師，主要研究方向為藥品包裝材料檢測及相容性。

江燕（1981—），女，碩士，副主任藥師，主要研究方向為藥品包裝材料檢測及相容性。

責任編輯：曾鈺嬋