多指標綜合評分法結(jié)合正交試驗優(yōu)化黃芪-當(dāng)歸水提物制備工藝

劉文娟，肖 瑩，買占海，張曉松，周 軻，姚萬玲，紀 鵬，華永麗，袁子文，魏彥明

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

為維護我國動物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號明確規(guī)定，自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。在“飼料端禁抗、養(yǎng)殖端限抗”背景下，畜禽高效健康養(yǎng)殖的新型替抗飼料添加劑產(chǎn)品需求日益迫切。中藥作為新型替抗飼料添加劑產(chǎn)品的重要來源之一，應(yīng)用前景廣闊。

黃芪和當(dāng)歸均為甘肅省道地藥材。黃芪為豆科植物莢膜黃芪或蒙古黃芪的根，性微溫，味甘；入肺、脾經(jīng)，主要含有多糖、黃酮類、皂苷類及氨基酸、微量元素等有效成分[1]。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸的干燥根，性溫，味甘、辛；歸肝、心、脾經(jīng)[2]，主要成分為多糖、有機酸和揮發(fā)油等[3]。自古以來有“十方九歸”的說法[4]，可見其應(yīng)用廣泛。查閱古方及大量文獻發(fā)現(xiàn)，符合“氣血同補”理念的黃芪當(dāng)歸配伍在臨床上應(yīng)用廣泛，常用比例包括1∶1、3∶1、1∶5、3∶2、2∶1及5∶1等[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，黃芪-當(dāng)歸(1∶1)配伍對提高小鼠免疫力效果較顯著[6]；且促進造血作用較強[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)黃芪當(dāng)歸按1∶1配伍時，提取物中主要活性成分阿魏酸、黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷等成分的溶出量顯著增加，在小腸中的吸收量也呈增加趨勢[10]。但截至目前關(guān)于黃芪-當(dāng)歸(1∶1)水提物制備工藝優(yōu)化的報道甚少。因此，本研究通過測定黃芪-當(dāng)歸(1∶1)水提物中阿魏酸(Y1)、毛蕊異黃酮(Y2)、粗多糖(Y3)及干浸膏(Y4)含量占比，以此進行綜合評分，在單因素試驗基礎(chǔ)上進行L9(34)正交試驗，優(yōu)選黃芪-當(dāng)歸(1∶1)水提工藝，旨在為黃芪當(dāng)歸提取物作為飼料添加劑進行工業(yè)化生產(chǎn)及質(zhì)量標準控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 中藥材黃芪(批號：HZ20210105)、當(dāng)歸(批號：HZ20210120)均購自蘭州黃河藥材市場，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)學(xué)教研室鑒定分別為豆科植物黃芪、傘形科植物當(dāng)歸的干燥根。

1.1.2 試劑 阿魏酸標準品(批號：F103702 )，阿拉丁公司產(chǎn)品；毛蕊異黃酮標準品(批號：yz170221)，南京源植生物技術(shù)公司產(chǎn)品；D-無水葡萄糖(批號：50-99-7)，上海凜恩科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

1.1.3 主要儀器 JA2003電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Aglient1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；FD-1A-5D型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品；Spectra Max Plus384酶標儀，美谷分子儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 水提工藝 將黃芪、當(dāng)歸飲片粉碎后過60目篩，精確稱量黃芪、當(dāng)歸藥粉各5 g混合均勻，據(jù)設(shè)定的時間、料液比、溫度及提取次數(shù)進行提取，提取液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，收集上清液，在60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、并經(jīng)冷凍干燥后備用。

1.2.2 阿魏酸與毛蕊異黃酮的含量檢測

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱 (250 mm×4.6 mm， 5 μm) ；流動相：乙腈(A)-1 mL/L磷酸水溶液(B)；洗脫梯度：10 min～16 min 20%A；16 min～25 min 20%～32%A；25 min～34 min 32%～34%A。柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量20 μL。

1.2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸和毛蕊異黃酮對照品適量，加入甲醇溶解并定容，制成每1 mL含阿魏酸0.1 mg、毛蕊異黃酮0.035 mg的混合對照品母液。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取“1.2.1”項下提取制備的提取物300 mg，加甲醇溶解，3 500 r/min離心10 min，將上清液移至10 mL容量瓶中加甲醇定容至刻度線，0.45 μm微孔濾膜過濾取其續(xù)濾液。

1.2.2.4 樣品含量測定 按照“1.2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“1.2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄阿魏酸與毛蕊異黃酮的保留時間和峰面積，采用外標法分別計算其含量。

1.2.3 粗多糖的測定

1.2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取D-無水葡萄糖粉末適量,溶解并定容至100 mL容量瓶中，制成每1 mL含0.25 mg的D-無水葡萄糖標準溶液，作為對照品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取“1.2.1”項下提取制備的粉末適量，溶解并定容后制成每1 mL含2 mg樣品的供試品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 樣品含量測定 在“1.2.3.2”項下制備的供試品溶液中，分別加入1 mL 50 mg/mL的苯酚溶液，迅速在試管中加入5 mL濃硫酸，置漩渦混勻器搖勻后于40 ℃水浴保溫加熱15 min，取出后冷水冷卻10 min，然后精密吸取200 μL反應(yīng)液于96孔板中，用酶標儀490 nm處測定OD值并記錄。

1.2.4 干浸膏得率的測定 干浸膏得率(Y4)=干浸膏質(zhì)量(m)/原藥材質(zhì)量(M)×100%。

1.2.5 綜合加權(quán)評分計算 采用綜合加權(quán)評分法評估黃芪-當(dāng)歸(1∶1)提取工藝，根據(jù)其藥理作用及結(jié)合生產(chǎn)實踐方面的利用價值[1,5,11-14]，將阿魏酸占比(Y1)、毛蕊異黃酮占比(Y2)、多糖占比(Y3)及干浸膏得率(Y4)的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.2、0.2、0.3、0.3。綜合評分=(Y1/Y1max)×100×0.2+(Y2/Y2max)×100×0.2+(Y3/Y3max)×100×0.3+(Y4/Y4max)×100×0.3。式中Y1max、Y2max、Y3max、Y4max分別指代提取物阿魏酸最大占比、毛蕊異黃酮最大占比、粗多糖最大占比、干浸膏最大得率。

1.2.6 單因素試驗 精密稱取黃芪當(dāng)歸藥粉各5 g，水浴加熱提取1次，分別考察提取溫度為60、70、80、90、100 ℃，提取時間為30、40、50、60、70 min，料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25對提取工藝的影響。每組試驗重復(fù)3次。各提取物分別按“1.2.2.4”、“1.2.3.3”“1.2.4”項下方法測定，計算阿魏酸、毛蕊異黃酮、多糖含量占比和干浸膏得率，并按照“1.2.5”項下方法進行綜合評分計算。

1.2.7 正交試驗設(shè)計 以單因素試驗初步篩選結(jié)果為基礎(chǔ)，分別以提取溫度、提取時間、料液比為因素，再加入提取次數(shù)因素(1次、2次、3次)，進行4因素3水平的L9(34)正交試驗，優(yōu)選黃芪當(dāng)歸水提物制備工藝(表1)。

表1 正交試驗水平

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸與毛蕊異黃酮的含量檢測

2.1.1 線性關(guān)系考察 將混合對照品母液記為1號瓶，再取4個10 mL容量瓶依次標號為2、3、4、5，從1號瓶中取5 mL混合對照品移至2號瓶中，加甲醇定容至10 mL，搖勻，依次稀釋到3、4、5號瓶中，稀釋倍數(shù)分別為2、4、8、16?；旌蛯φ掌芳包S芪-當(dāng)歸(1∶1)水提物供試品的高效液相色譜圖見圖1。分別從1～5號瓶取20 μL混合對照品溶液，按照“1.2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，以色譜峰面積(y)為縱坐標，濃度(x，mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：阿魏酸y=79 587x-202.18(R2=0.999 1)，毛蕊異黃酮y=79 922x-33.220 8 (R2=0.999 8)。結(jié)果顯示,阿魏酸、毛蕊異黃酮檢測范圍分別在0.006 25 mg/mL～0.1 mg/mL，0.002 187 5 mg/mL～0.035 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，測定并計算得到阿魏酸和毛蕊異黃酮峰面積的RSD值分別為1.01%、1.77%，表明儀器精密度良好。

A.混合對照品；B.黃芪-當(dāng)歸藥對供試品；C.缺少黃芪的陰性對照；D.缺少當(dāng)歸的陰性對照;1號和2號峰分別阿魏酸、毛蕊異黃酮

2.1.3 重復(fù)性試驗 分別精密稱取同一條件制備的黃芪當(dāng)歸(1∶1)提取物粉末6份，按“1.2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定并計算得到阿魏酸和毛蕊異黃酮峰面積的RSD值分別為1.06%、2.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取同一黃芪當(dāng)歸提取物粉末適量，按照“1.2.2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫保存，分別于 0、2、4、6、8、10、24 h 精密吸取20 μL，進樣測定，計算得到阿魏酸酸和毛蕊異黃酮峰面積的RSD值分別為2.53%、2.18%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率 取已知含量提取物粉末6份，分別精密加入混合對照品溶液適量，按“1.2.2.3”項下方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，測定計算得到阿魏酸和毛蕊異黃酮平均加樣回收率分別為103.9%、100.19%，RSD分別為1.61%、2.93%，表明該方法準確度良好。

2.2 粗多糖的測定

2.2.1 線性關(guān)系考察 用移液管分別移取“1.2.3.1”項下制備的對照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于不同的試管之中，加蒸餾水至2.0 mL。后續(xù)操作同“1.2.3.3”項下方法。以濃度(x，mg/mL)為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果表明在0～0.031 25 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，求得出回歸方程為：y=29.178x-0.015 4，R2=0.999 0。

2.2.2 精密度試驗 精確吸取D-無水葡萄糖對照品溶液0.6 mL置試管中，按照標準曲線操作步驟重復(fù)測定6次，測定并計算得到RSD值為0.597%，說明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗 分別精密稱取同一條件制備的黃芪-當(dāng)歸(1∶1)提取物粉末6份，按“1.2.3.2”項下方法制備供試品溶液，測定并計算得到RSD值為2.29%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取完全反應(yīng)后的供試品，每隔20 min測1次OD值，測定并計算OD值的RSD為1.42%，說明在100 min內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 取已知多糖含量的供試液6份各50 μL至離心管中，按低、中、高濃度分別加已知濃度的對照品溶液用“1.2.3.3”項下方法處理，測定并計算OD值，結(jié)果顯示樣品平均回收率為 98.78%，RSD為0.88%，說明試驗準確度良好。

2.3 單因素試驗

結(jié)果顯示，提取溫度在80 ℃時，藥物提取的綜合評分最高。時間在40 min時，藥物提取的綜合評分最高。料液比在1∶15時，藥物提取的綜合評分最高。因此，確定80 ℃為最佳提取溫度，40 min為最佳提取時間，1∶15為最佳料液比(圖2)。

2.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)各指標權(quán)重計算綜合評分，用正交設(shè)計助手軟件進行直觀分析(表2)。

根據(jù)單因素初篩選試驗結(jié)果及正交設(shè)計助手分析結(jié)果，分別確定提取溫度、時間、料液比、提取次數(shù)4個因素，進行方差分析(表3)。

由表2、3可以看出，提取黃芪當(dāng)歸對最優(yōu)工藝為A2B2C2D3，即提取溫度為80 ℃、提取時間為40 min，料液比為1∶15、提取次數(shù)為3次。提取次數(shù)對其綜合評分影響最大，提取溫度對綜合評分影響最小。

2.5 優(yōu)化工藝的驗證

依據(jù)正交試驗數(shù)據(jù)分析所得出的提取工藝，進行3次重復(fù)試驗(表4)。綜合評分分別為98.721、97.888、98.634，RSD值為0.465%。其結(jié)果高于前面試驗的綜合評分，表明此優(yōu)化工藝可行。

A.溫度;B.時間;C.料液比

表2 正交直觀分析

表3 方差分析結(jié)果

表4 工藝優(yōu)化驗證試驗結(jié)果

3 討論

黃芪是重要補氣藥物之一，當(dāng)歸是重要補血藥物之一，二者配伍作為補氣生血的重要藥對，臨床應(yīng)用潛力較大，其主要通過增強動物機體免疫、增強骨髓造血等功能來發(fā)揮藥理作用[7]。二者配伍后的化合物主要包括黃酮類的毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花素、刺芒柄花素苷，有機酸類的阿魏酸、香草酸，以及多糖類等[15]。毛蕊異黃酮是黃芪主要活性成分之一，具有抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、保護臟器、抗黑色素再生成等作用[16]?！吨袊幍洹?020 年版中黃芪雖以毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為指示成分[17]，但在水提過程中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷會因持續(xù)加熱較長時間而易脫去葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槊锂慄S酮。毛蕊異黃酮由于相對分子質(zhì)量小且具有疏水性，相比與它對應(yīng)的糖苷，更易被吸收而發(fā)揮藥效[6]，且大多數(shù)學(xué)者都將其作為黃芪質(zhì)量控制的標志物之一。阿魏酸是《中國藥典》2020年版中當(dāng)歸質(zhì)量控制的唯一指標性成分，具有抗炎、抗氧化、抗血栓、抗輻射及提高機體免疫力等作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[18]。多糖作為黃芪、當(dāng)歸的重要天然活性成分，具有抗氧化、增強免疫、保肝等生理功能，在畜禽生產(chǎn)中作為飼料添加物被廣泛使用[19-21]。另外，文獻報道干浸膏率是影響提取工藝產(chǎn)量優(yōu)化的重要因素[22]。所以，本研究選取阿魏酸、毛蕊異黃酮、多糖3種代表活性成分結(jié)合干浸膏得率為檢驗指標。并根據(jù)其化學(xué)和藥理特性及在優(yōu)化工藝過程中的重要性，設(shè)置不同的權(quán)重系數(shù)，即阿魏酸、毛蕊異黃酮、多糖分別為 0.2、0.2、0.3，干浸膏得率為0.3。

中藥提取工藝的優(yōu)化是保障中藥功效的重要手段。水提工藝優(yōu)化設(shè)計過程中，發(fā)現(xiàn)提取時間、提取次數(shù)、料液比等因素對提取物的活性及得率有較大影響。本研究在單因素試驗過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)其他條件固定時，隨著時間的增加，提取物中阿魏酸占比呈現(xiàn)增加趨勢，干浸膏得率、毛蕊異黃酮及多糖占比先升高后降低；隨著溫度的增高，干浸膏得率、提取物中阿魏酸及多糖占比先升高后降低，毛蕊異黃酮占比持續(xù)降低；隨著料液比的增加，干浸膏得率先增加后基本保持不變，提取物中阿魏酸、毛蕊異黃酮及多糖占比先升高后降低。單因素試驗結(jié)果顯示所選各指標間變化趨勢未達成一致，說明若選用單一活性成分作為考察指標無法客觀反映藥對制備工藝的優(yōu)劣性。本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上，結(jié)合多指標綜合評分法開展正交設(shè)計試驗。多指標綜合評分法可兼顧中藥復(fù)方多靶點多途徑的作用特點，有效避免單一指標評價制備工藝時的片面性，更符合中(獸)醫(yī)用藥的整體觀思維[23]。正交設(shè)計是目前應(yīng)用最為廣泛且發(fā)展成熟的多因素多水平試驗設(shè)計方法之一[24]，其具有高效方便、試驗次數(shù)少、結(jié)果直觀易分析等特點[25]，被廣泛運用于生物醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域來解決多因素多水平問題[26-27]，從而達到提高生產(chǎn)效率和優(yōu)化生產(chǎn)工藝等目的。本研究將以上兩種試驗方法結(jié)合，在較少的試驗次數(shù)中快速確定黃芪-當(dāng)歸(1∶1)水提物最佳制備工藝為：溫度80 ℃、提取時間40 min、料液比1∶15、提取3次。

綜上所述，本研究就黃芪-當(dāng)歸(1∶1)水提物制備工藝的影響因素，應(yīng)用正交試驗設(shè)計法展開工藝性探討，通過對黃芪-當(dāng)歸常用且穩(wěn)定的3種活性成分進行檢測及干浸膏得率的計算，結(jié)合多指標綜合評分法分析在現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)下黃芪當(dāng)歸的發(fā)展。結(jié)果表明，本法簡便、重復(fù)性好，提取工藝穩(wěn)定可行，能有效提高藥物藥效，避免浪費藥材，為其作為畜禽保健型飼料添加劑提供理論依據(jù)。但本研究也存在一定的不足之處，僅選取主要指標成分作為評價指標，無法全面準確地反映復(fù)方中藥的物質(zhì)作用基礎(chǔ)。