F81細(xì)胞無(wú)血清懸浮馴化后培養(yǎng)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的研究

張久鑫，邵寶順，朱 輝，賈浩苒，梁 琳，湯新明，崔尚金，梁瑞英*，王龍濤*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100089；3.廣東省華晟生物技術(shù)有限公司，廣東廣州 511300)

貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV)又稱(chēng)貓細(xì)小病毒(Feline parvovirus)、貓瘟病毒、貓傳染性腸炎病毒，屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬成員。該病毒在自然條件可以感染貓科、鼬科和浣熊科等多種動(dòng)物，如豹、虎、浣熊、山貓、野貓、家貓、獅子、猞猁、水貂，體型較小的貓科動(dòng)物以及水貂為主感染對(duì)象，能引起以高熱、白細(xì)胞大量減少、嘔吐以及腸炎為主要臨床特征的病毒性傳染病的病原體[1]。貓細(xì)小病毒的DNA復(fù)制在感染細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，由于FPV存在復(fù)制能力的缺陷，必須依賴(lài)宿主細(xì)胞提供DNA聚合酶以及復(fù)制體系才能開(kāi)始復(fù)制，因此，F(xiàn)PV的復(fù)制過(guò)程在細(xì)胞增殖的S期開(kāi)始。所以，在進(jìn)行細(xì)小病毒的分離培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)時(shí)，需在細(xì)胞剛接種時(shí)或最遲在24 h內(nèi)就進(jìn)行接種病毒，一般采取傳代細(xì)胞同步接毒或40%～50%貼壁時(shí)再接毒的方法，該方法能提高FPV的分離成功率和病毒滴度，而不能等到細(xì)胞長(zhǎng)滿形成單層后才進(jìn)行，否則無(wú)法達(dá)到分離或傳代培養(yǎng)病毒的目的。 貓泛白細(xì)胞減少癥病毒不僅能在心、肺、腸、腎、脾、睪丸、骨骼、腎上腺和淋巴結(jié)等組織細(xì)胞中復(fù)制，也能在多種不同類(lèi)型的細(xì)胞系進(jìn)行復(fù)制增殖，如貓腎細(xì)胞(feline kidney cells,F81)、貓腎細(xì)胞(crandell rese feline kidney cells,CRFK)、FK細(xì)胞、NLFK細(xì)胞、FLF細(xì)胞、犬腎細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney cells, MDCK)和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)等，F(xiàn)81細(xì)胞和CRFK細(xì)胞較為常用。

隨著懸浮培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，利用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)生物制品成為共識(shí)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)發(fā)展迅速，其中國(guó)外發(fā)展歷史較早，現(xiàn)多為人用生物制品研發(fā)[2]，對(duì)于獸用生物制品也有報(bào)道，如利用幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(baby hamster syrian kidney cells, BHK)生產(chǎn)口蹄疫疫苗[3]。國(guó)內(nèi)一線生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)越來(lái)越多，生物反應(yīng)器規(guī)模越來(lái)越大[4]，這為國(guó)內(nèi)生物制品發(fā)展帶來(lái)了極大便利。伴隨著細(xì)胞改造技術(shù)和個(gè)性化培養(yǎng)基技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)生物制品企業(yè)迎來(lái)了新機(jī)遇，現(xiàn)已有BHK懸浮細(xì)胞用于生產(chǎn)口蹄疫疫苗[5]，MDCK懸浮細(xì)胞代替雞胚用于生產(chǎn)禽流感疫苗[6]，豬睪丸細(xì)胞(swine testis cells, ST)懸浮細(xì)胞用于生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗[7]。但用于貓病毒增殖的懸浮細(xì)胞系還鮮有報(bào)道，多停留在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)室微載體培養(yǎng)階段，距離規(guī)?；笊a(chǎn)還有一段距離。

本研究的目的是對(duì)F81細(xì)胞系進(jìn)行無(wú)血清懸浮馴化，在無(wú)血清培養(yǎng)基中可以高密度生長(zhǎng)，并能實(shí)現(xiàn)規(guī)?；囵B(yǎng)。并以此作為細(xì)胞基質(zhì)摸索貓泛白細(xì)胞減少癥病毒懸浮培養(yǎng)工藝，達(dá)到疫苗生產(chǎn)要求。本研究將改善貓泛白細(xì)胞減少癥疫苗培養(yǎng)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量，提升生產(chǎn)效益及核心競(jìng)爭(zhēng)力，為寵物疾病預(yù)防提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、耗材和主要試劑 貓腎細(xì)胞(F81)、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒FPV-BJ05由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所寵物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供，其無(wú)菌檢查、支原體檢查及外源因子檢查均符合《中國(guó)獸藥典》三部(2020 版)相關(guān)規(guī)定；方瓶、搖瓶、凍存管、離心管，Corning公司產(chǎn)品；96孔板、MEM培養(yǎng)液、2.5 mg/mL胰蛋白酶、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基、胎牛血清，廣州市小木蟲(chóng)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；水平搖床，蘇州捷美電子有限公司產(chǎn)品；低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，廣州市明美光電技術(shù)有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

采用逐步降低血清的方法將貼壁F81細(xì)胞血清濃度由100 mL/L降到20 mL/L；然后把血清濃度為20 mL/L的貼壁細(xì)胞經(jīng)消化離心后加入無(wú)血清懸浮培養(yǎng)液培養(yǎng)，血清濃度不變；最后將懸浮細(xì)胞由低血清濃度馴化為無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)狀態(tài)。經(jīng)過(guò)這三個(gè)階段的馴化后，得到了適應(yīng)無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)的F81細(xì)胞，并對(duì)此進(jìn)行了凍存復(fù)蘇、生長(zhǎng)活力測(cè)定等工作，最終建立了可穩(wěn)定傳代的無(wú)血清全懸浮F81細(xì)胞系。以此細(xì)胞系為基礎(chǔ)摸索貓泛白細(xì)胞減少癥病毒繁育方法，采用同步接毒法，測(cè)試不同初始接毒細(xì)胞密度、不同MOI、不同時(shí)間收毒病毒滴度變化，以此確定繁育方法。

1.2.1 貼壁F81細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮罐中取1支40代的貼壁F81在38 ℃水浴鍋中融化，在超凈臺(tái)內(nèi)將凍存管中的液體轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中倒入MEM培養(yǎng)基補(bǔ)到15 mL，1 000 r/min，離心6 min，棄去上清液體，補(bǔ)加胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)濃度為100 mL/L的MEM(minimum essential medium)培養(yǎng)液至10 mL，倒入T25方瓶中，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用2.5 mg/mL胰蛋白酶消化傳代，傳代比例為1∶3。

1.2.2 貼壁F81細(xì)胞懸浮馴化 將復(fù)蘇后的貼壁細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6代～8代，待細(xì)胞形態(tài)正常、穩(wěn)定生長(zhǎng)后開(kāi)始逐漸降低培養(yǎng)液中血清濃度，具體梯度為100、80、50、30、20、10、0 mL/L，每次降低血清濃度之前，需要確認(rèn)在本血清濃度傳代時(shí)細(xì)胞形態(tài)正常、生長(zhǎng)規(guī)律穩(wěn)定，細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后進(jìn)行下一梯度的降血清培養(yǎng)。待上一步得到的低血清貼壁F81細(xì)胞形態(tài)正常，穩(wěn)定生長(zhǎng)，經(jīng)2.5 mg/mL胰酶消化后，加入同血清濃度的懸浮培養(yǎng)液15 mL終止消化，將方瓶?jī)?nèi)液體倒入50 mL離心管內(nèi)，800 r/min，離心6 min，離心后加入少量懸浮培養(yǎng)液倒入125 mL搖瓶中，用吸管吹打，將細(xì)胞盡量吹散，取樣計(jì)數(shù)，加入同等血清濃度懸浮培養(yǎng)液將細(xì)胞密度控制在1×106cells/mL，放到90 r/min的水平搖床上在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。每隔24 h監(jiān)測(cè)一次，記錄細(xì)胞密度、狀態(tài)，傳代周期為48 h。抽取F10、F20、F30代細(xì)胞繪制生長(zhǎng)曲線及活率變化曲線。

1.2.3 建立無(wú)血清懸浮F81細(xì)胞細(xì)胞庫(kù) 低血清懸浮培養(yǎng)F81細(xì)胞連續(xù)調(diào)整至穩(wěn)定生長(zhǎng)后，逐步或直接撤掉血清，得到無(wú)血清懸浮培養(yǎng)F81細(xì)胞。水平搖床轉(zhuǎn)速調(diào)整為130 r/min，待無(wú)血清懸浮培養(yǎng)F81細(xì)胞，在鏡下觀察呈單個(gè)、透亮、細(xì)胞輪廓清晰，透亮度高，生長(zhǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行凍存、復(fù)蘇、生長(zhǎng)曲線繪制及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定。

(1)細(xì)胞凍存：選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好，生長(zhǎng)活力穩(wěn)定的無(wú)血清懸浮F81細(xì)胞25代，經(jīng)800 r/min、 6 min離心處理后將細(xì)胞密度控制在1×107cells/mL，凍存液成分為700 mL/L無(wú)血清懸浮培養(yǎng)液、200 mL/L FBS、100 mL/L二甲基亞砜，按1 mL/管分裝于凍存管內(nèi)，裝入程序降溫凍存盒內(nèi)，先經(jīng)4 ℃暫時(shí)保存，后置-80 ℃冷凍過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)到液氮罐內(nèi)長(zhǎng)期保存，做好標(biāo)記(細(xì)胞名稱(chēng)、培養(yǎng)液名稱(chēng)、血清濃度、代次、日期)。

(2)細(xì)胞復(fù)蘇：在液氮罐內(nèi)取出3支25代無(wú)血清懸浮F81放置于37 ℃水浴鍋內(nèi)快速融化，在生物安全柜內(nèi)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，補(bǔ)加無(wú)血清懸浮培養(yǎng)液至25 mL，1 000 r/min，離心6 min，倒去上清，振蕩離心管，混勻沉淀物，補(bǔ)加無(wú)血清懸浮培養(yǎng)液15 mL，取樣計(jì)數(shù)通過(guò)補(bǔ)液方式將細(xì)胞密度控制在1×106cells/mL，培養(yǎng)體積為30 mL，轉(zhuǎn)移到125 mL搖瓶?jī)?nèi)，放到130 r/min水平搖床上，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

(3)無(wú)血清懸浮F81細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的測(cè)定：對(duì)凍存前后的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用抽樣方式，抽取F10、F20代及復(fù)蘇后的F25代無(wú)血清懸浮培養(yǎng)F81細(xì)胞，初始傳代密度為1×106cells/mL，置體積分?jǐn)?shù)為5%的水培培養(yǎng)箱中37 ℃、130 r/min水平搖床上培養(yǎng)，每隔24 h取樣計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線及測(cè)定最大生長(zhǎng)密度、細(xì)胞活力和倍增時(shí)間。

倍增時(shí)間計(jì)算公式：

t=T/A

(1)

A=log2(Y/X)

(2)

式中:T為培養(yǎng)時(shí)間，h；X為初始接種細(xì)胞數(shù)，mL-1;Y為細(xì)胞最大增值密度前1 d的細(xì)胞數(shù)，mL-1;t為倍增時(shí)間，h；A為最大增值密度，mL-1。

(4)無(wú)菌及支原體檢測(cè):根據(jù)《中國(guó)獸藥典》三部(2020版)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 貓泛白細(xì)胞減少癥病毒培養(yǎng)條件摸索 復(fù)蘇后穩(wěn)定生長(zhǎng)的無(wú)血清懸浮F81用于接毒試驗(yàn)，均采用同步接毒法，接毒細(xì)胞密度設(shè)置8×105cells/mL、10×105cells/mL、15×105cells/mL共3個(gè)組；MOI設(shè)置7×10-3、3.5×10-2、7×10-2共3個(gè)組進(jìn)行接毒試驗(yàn)，置體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱的水培培養(yǎng)箱中37 ℃、130 r/min水平搖床上培養(yǎng)，48 h后間隔12 h留樣檢測(cè)病毒滴度。

2 結(jié)果

2.1 貼壁F81細(xì)胞形態(tài)

復(fù)蘇后F81細(xì)胞形態(tài)(圖1A)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞形態(tài)正常，輪廓清晰，血清濃度降低后，在血清濃度調(diào)整到80、50、30、20 mL/L時(shí)，細(xì)胞形態(tài)會(huì)在2代～3代后隨之變化，細(xì)胞會(huì)有少量脫落，有聚團(tuán)趨勢(shì)，經(jīng)過(guò)3代～5代的調(diào)整后，細(xì)胞均能適應(yīng)生長(zhǎng)，恢復(fù)原來(lái)的形態(tài)，生長(zhǎng)速度稍有放緩。在血清濃度為10 mL/L時(shí)，細(xì)胞貼壁能力明顯變?nèi)?，調(diào)整多代后仍無(wú)效果，遂放棄；血清濃度為0 mL/L時(shí)，細(xì)胞基本不貼壁，停止生長(zhǎng)。所以確定用MEM培養(yǎng)基最低血清濃度為20 mL/L(圖1B和圖1C)，生長(zhǎng)速度與100 mL/L血清濃度時(shí)差別不明顯，可以進(jìn)行下一步懸浮馴化。

2.2 低血清懸浮F81細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞起懸后在F1～F8代時(shí)，細(xì)胞黏團(tuán)較多，細(xì)胞碎片較多，經(jīng)過(guò)吹散離心去團(tuán)多次傳代馴化后，細(xì)胞黏團(tuán)減少，但依然存在，不能完全消除(圖2)。起懸后細(xì)胞生長(zhǎng)速度不穩(wěn)定，由于細(xì)胞聚團(tuán)較多，計(jì)數(shù)結(jié)果不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞生長(zhǎng)情況，不能用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定性分析。

A.血清濃度為100 mL/L時(shí)生長(zhǎng)48 h后細(xì)胞形態(tài)；B.血清濃度初降為20 mL/L時(shí)生長(zhǎng)48 h后細(xì)胞形態(tài)；C.馴化后適應(yīng)血清濃度為20 mL/L時(shí)生長(zhǎng)48 h后細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞傳代至10代以后，細(xì)胞穩(wěn)定規(guī)律生長(zhǎng)，細(xì)胞還有聚團(tuán)現(xiàn)象但多為3個(gè)～6個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，黏團(tuán)減少，多呈單個(gè)生長(zhǎng)，每次傳代初始細(xì)胞濃度為1×106cells/mL，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中130 r/min水平搖床上培養(yǎng)，每隔24 h取樣計(jì)數(shù)，F(xiàn)10、F20、F30代低血清懸浮F81細(xì)胞生長(zhǎng)曲線符合“S”形生長(zhǎng)規(guī)律和細(xì)胞活力(圖3)，其中F10、F20、F30代均在傳代后72 h達(dá)到最大生長(zhǎng)密度，分別為4.8×106、5.07×106、5.35×106cells/mL，倍增時(shí)間為30.95、29.32、30.09 h，到72 h活率均≥93%。

2.3 無(wú)血清懸浮F81細(xì)胞形態(tài)

兩種降血清方法，驟降法效果更好，可直接消除血清對(duì)細(xì)胞聚團(tuán)的影響。由20 mL/L降到10 mL/L再到0 mL/L組與20 mL/L組差別不大，依然有少量聚團(tuán)。20 mL/L直接降到0 mL/L組與20 mL/L組差別較大，細(xì)胞團(tuán)明顯減少、細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快。經(jīng)過(guò)無(wú)血清馴化后，細(xì)胞多呈單個(gè)生長(zhǎng)，細(xì)胞透亮度高，活力好(圖4)。

2.3.1 無(wú)血清懸浮F81細(xì)胞復(fù)蘇成活率 細(xì)胞懸液37 ℃水浴融化后，經(jīng)高速離心，去除凍存液，直接換成無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，死細(xì)胞占5%～10%，細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)速度需要經(jīng)過(guò)3代的調(diào)整后，可以達(dá)到凍存前的水平，沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞黏團(tuán)，證明本次凍存液細(xì)胞可以用于無(wú)血清懸浮F81細(xì)胞的凍存，此凍存方法對(duì)細(xì)胞沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響。

A.低血清懸浮培養(yǎng)初期(F1-F5)48 h后細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，形態(tài)不規(guī)則，有大細(xì)胞黏團(tuán)；B.低血清懸浮培養(yǎng)初期(F6-F8)48 h后細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)趨于圓形，生長(zhǎng)速度快，仍有細(xì)胞黏團(tuán)存在；C.低血清懸浮培養(yǎng)初期(F9-)48 h后細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞單個(gè)透亮，生長(zhǎng)穩(wěn)定，有少量細(xì)胞團(tuán)

2.3.2 無(wú)血清懸浮F81細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及傳代穩(wěn)定性 無(wú)血清培養(yǎng)的F10、F20代及復(fù)蘇后的F25代在初始傳代密度為1×106cells/mL，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的水培培養(yǎng)箱中130 r/min水平搖床上培養(yǎng)，每隔24 h取樣計(jì)數(shù)，F(xiàn)10、F20及復(fù)蘇后F25代無(wú)血清懸浮F81細(xì)胞生長(zhǎng)曲線符合“S”形生長(zhǎng)規(guī)律和細(xì)胞活力(圖3)，其中F10、F20及復(fù)蘇后F25代均在傳代后96 h達(dá)到最大生長(zhǎng)密度，分別為7.55×106、7.98×106、8.25×106cells/mL，倍增時(shí)間為25.27、26.18、26.36 h，到96 h活率均≥88%。

圖3 低血清懸浮F81細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及活率

細(xì)胞單個(gè)圓形透亮，大小均一，生長(zhǎng)穩(wěn)定

通過(guò)對(duì)凍存前后馴化培養(yǎng)數(shù)據(jù)的總結(jié)分析，繪制了凍存前后的生長(zhǎng)曲線(圖5)。

2.4 貓泛白細(xì)胞減少癥病毒增殖方法優(yōu)化

檢測(cè)不同細(xì)胞接毒密度、不同MOI、不同時(shí)間點(diǎn)樣品，結(jié)果顯示(表1)當(dāng)細(xì)胞接毒密度為10×105cells/mL、MOI為3.5×10-2病毒滴度為最大值，病毒滴度為107.25TCID50/0.1 mL，因此確定該培養(yǎng)條件為FPV-BJ05懸浮細(xì)胞培養(yǎng)最適條件。

3 討論

本研究為貓泛白細(xì)胞減少癥病毒相關(guān)生物制品的研發(fā)提供了新思路，打破了傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，成功馴化了無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)F81，生長(zhǎng)迅速且穩(wěn)定，可快速實(shí)現(xiàn)規(guī)?；囵B(yǎng)，同時(shí)避免了動(dòng)物源性成分對(duì)產(chǎn)品的不利因素，可為研究以F81為細(xì)胞基質(zhì)的生物制品提供參考。

圖5 凍存前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及活率

表1 不同細(xì)胞密度和MOI接毒檢測(cè)結(jié)果

F81為貓腎細(xì)胞，貼壁性較強(qiáng)，相比于其他細(xì)胞馴化難度較大，但本團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)低血清貼壁馴化、低血清懸浮馴化、無(wú)血清懸浮馴化三個(gè)階段后，成功使其適應(yīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)，且生長(zhǎng)穩(wěn)定，細(xì)胞凍存復(fù)蘇后，經(jīng)過(guò)3代調(diào)整后，可恢復(fù)至凍存前的生長(zhǎng)狀態(tài)。F81細(xì)胞系可用于增殖犬瘟熱病毒[8]、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒[9]、貓皰疹病毒[10]、貓杯狀病毒[11]、水貂病毒性腸炎病毒[12]等，現(xiàn)常用的生產(chǎn)用細(xì)胞系多為貼壁形式的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，或微載體形式培養(yǎng)，由于培養(yǎng)過(guò)程中需要添加胰酶、血清等，使得原料成本、人工成本居高不下，同時(shí)還會(huì)大大增加外源污染的風(fēng)險(xiǎn)，而本次建立的無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)F81細(xì)胞系，對(duì)相關(guān)病毒的敏感性是否發(fā)生變化還有待于進(jìn)一步進(jìn)行。不需要添加血清，在生物反應(yīng)器中可實(shí)現(xiàn)高密度大規(guī)模培養(yǎng)用于生物制品生產(chǎn)，且人為可精確控制，使得批次間產(chǎn)品幾乎沒(méi)有差異[13]，高密度細(xì)胞或?qū)樯镏破分苽鋷?lái)新思路。

貓泛白細(xì)胞減少癥病毒敏感性試驗(yàn)表明，相較貼壁細(xì)胞，無(wú)血清懸浮細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)，擺脫了血清的限制，接毒工藝方便可控，病毒滴度顯著提高，產(chǎn)物更符合生產(chǎn)要求。對(duì)于懸浮細(xì)胞系與原貼壁細(xì)胞系在生物制品生產(chǎn)中是否存在區(qū)別，國(guó)外已有對(duì)于MDCK細(xì)胞用于生產(chǎn)流感疫苗相關(guān)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)證明懸浮與貼壁在病毒培養(yǎng)過(guò)程中幾乎沒(méi)有差異[14],本細(xì)胞系相關(guān)試驗(yàn)還有待開(kāi)展。

根據(jù)2020年寵物行業(yè)白皮書(shū)報(bào)告，我國(guó)僅城鎮(zhèn)中貓飼養(yǎng)量就已經(jīng)達(dá)到4862萬(wàn)只，比2019年增長(zhǎng)10.2%，在寵物中占46%，而這一數(shù)據(jù)還不包含流浪貓和農(nóng)村地區(qū)飼養(yǎng)的貓的數(shù)量，依此可以看出市場(chǎng)前景廣闊。根據(jù)國(guó)家基礎(chǔ)獸藥庫(kù)顯示，迄今為止我國(guó)還沒(méi)有商品化的用于貓科疾病預(yù)防的生物制品，現(xiàn)還完全依賴(lài)進(jìn)口，受新冠疫情影響，疫苗進(jìn)口數(shù)量銳減，部分地區(qū)出現(xiàn)斷貨情況，本試驗(yàn)得到的無(wú)血清懸浮培養(yǎng)F81可嘗試用于多種病毒培養(yǎng)、抗原制備等工作，有助于填補(bǔ)國(guó)內(nèi)相關(guān)生物制品空白，幫助我們?cè)缛諗[脫現(xiàn)狀。下一步將繼續(xù)測(cè)試該細(xì)胞系對(duì)不同毒株的病毒敏感性和摸索生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件等工作。