非洲豬瘟病毒防污染雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立

卞志標(biāo)，郭怡德，席振軍，柯海意，蔡汝健，孫銘飛，勾紅潮，李春玲

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東廣州 510640)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。ASFV屬非洲豬瘟相關(guān)病毒科非洲豬瘟病毒屬，是一種有囊膜的雙股線(xiàn)狀DNA病毒，具有24個(gè)基因型[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)將其列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[2-3]。2018年8月3日，我國(guó)確診首例非洲豬瘟疫情，至今在全國(guó)各地均有報(bào)道，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]?？焖贉?zhǔn)確的診斷方法對(duì)于非洲豬瘟的及時(shí)發(fā)現(xiàn)和綜合防控至關(guān)重要[5-6]，該病常用的檢測(cè)診斷方法主要包括病毒分離、間接免疫熒光試驗(yàn)、ELISA、PCR等。病毒分離和間接免疫熒光試驗(yàn)雖屬標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，但操作繁瑣，很難在條件一般的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展[7]。探針?lè)晒舛烤酆厦告湻磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、敏感性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)[8]，目前針對(duì)P72基因已開(kāi)發(fā)出多種檢測(cè)試劑盒，在ASFV檢測(cè)方面得到廣泛應(yīng)用。

ASFV的C962R基因全長(zhǎng)約2.54 kb，編輯DNA引物酶，在ASFV中具有較強(qiáng)的保守性，可作為P72基因之外新的檢測(cè)靶標(biāo)[9]。另外，臨床已發(fā)現(xiàn)MGF基因缺失的變異株流行[10]，并表現(xiàn)出新的流行特點(diǎn)，加大了非洲豬瘟的診斷和防控難度。MGF-505-2R基因組全長(zhǎng)約1.5 kb，屬于MGF-505基因簇的一員。MGF-505基因簇與ASFV宿主范圍特異性、宿主先天反應(yīng)阻斷和病毒毒力有關(guān)[11]，因此可作為區(qū)分ASFV野毒株和MGF基因缺失變異株的靶基因。

本研究基于GenBank中已公布的ASFV高度保守C962R基因和毒力相關(guān)基因MGF-505-2R分別設(shè)計(jì)引物和探針，建立了ASFV雙重qPCR檢測(cè)方法，解決了ASFV核酸檢測(cè)靶標(biāo)基因過(guò)分單一的問(wèn)題，預(yù)期為ASFV野毒株和MGF基因缺失變異株的鑒別檢測(cè)提供技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌、病毒、試驗(yàn)用動(dòng)物及病料 豬丹毒絲菌 (Erysipelothrixrhusiopathiae)、副豬嗜血桿菌(Hoemophilusparasuis，HPS)、鏈球菌(Streptococcussuis，SS)、豬傳染性胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所豬病研究室分離、鑒定并保存；MGF-505-2R和C962R基因質(zhì)粒，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；SPF級(jí)西藏小型豬購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；病料我從不同地區(qū)采集的194份豬臨床組織樣品，其中心臟40份，肝臟30份，脾臟30份，肺臟40份，腎臟28份，腦組織12份和淋巴結(jié)14份。

1.1.2 主要試劑 2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2qPCR試劑,南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；核酸提取試劑盒(HP Tissue DNA Maxi Kit D5196)，美國(guó)Omega公司產(chǎn)品；ASFV抗原檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：Q03-001-211101)，北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 LightCycler96實(shí)時(shí)qPCR儀，美國(guó)Roche公司產(chǎn)品；Beckman Microfa 離心機(jī)，德國(guó)貝克曼公司產(chǎn)品；ESCO AC2-481超凈工作臺(tái)，新加坡藝思高科技有限公司產(chǎn)品；PCR-0108-LP-RT-WqPCR管，美國(guó)Axygen公司產(chǎn)品；TDZ5-WS(多管自動(dòng))離心機(jī)，湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物與探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中ASFV Georgia 2007/1株的MGF-505-2R序列(Gene ID:41902793)，通過(guò)Primer5軟件設(shè)計(jì)合成檢測(cè)MGF-505-2R基因的引物和探針(表1)。另根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中ASFV Georgia 2007/1株的C962R基因序列(Gene ID:41902841)，使用軟件進(jìn)行比對(duì)，篩選出C962R基因的保守序列，并通過(guò)Primer5軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)C962R基因的引物和探針(表2)。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備MGF-505-2R基因和C962R基因的質(zhì)粒，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，將MGF-505-2R基因質(zhì)粒、C962R基因質(zhì)粒和這2種質(zhì)粒1∶1比例混合物進(jìn)行濃度梯度稀釋作為qPCR標(biāo)準(zhǔn)品。

表1 引物設(shè)計(jì)所用的ASFV參考毒株

表2 基于C962R基因和MGF-505-2R基因設(shè)計(jì)的引物及探針

1.2.3MGF-505-2R基因和C962R基因熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)條件的優(yōu)化 使用矩陣法分別對(duì)MGF-505-2R基因和C962R基因的引物、探針以及退火溫度進(jìn)行梯度優(yōu)化試驗(yàn)。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果中Ct值和熒光信號(hào)的綜合分析，優(yōu)化出2個(gè)基因的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 以濃度為1×105、1×104、1×103、1×102、1×101，1 copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行探針?lè)p重qPCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其敏感性。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 分別提取Ery、HPS、SS、APP、PCV2、PRV的DNA，用所建立的ASFV探針?lè)p重qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(1×105～1×102copies/μL)進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)檢測(cè)，每個(gè)樣品分別設(shè)3次批內(nèi)和批間重復(fù)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行變異系數(shù)分析。

1.2.7 防污染試驗(yàn) 為了驗(yàn)證ASFV的防污染雙重qPCR檢測(cè)方法能夠有效減少氣溶膠導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，試驗(yàn)將濃度為1×103copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，使用ASFV的防污染雙重qPCR進(jìn)行擴(kuò)增后，將產(chǎn)物進(jìn)行濃度梯度稀釋。進(jìn)一步，將稀釋的產(chǎn)物作為模板，分別使用含尿嘧啶-N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase，UNG)和不含UNG酶的兩個(gè)體系同時(shí)進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.8 非洲豬瘟病毒探針?lè)p重?zé)晒舛烤酆厦告湻磻?yīng)的臨床樣本檢測(cè) 為了初步評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用效果，采集SPF級(jí)西藏小型豬的扁桃體、淋巴結(jié)和脾臟等免疫器官，將扁桃體、淋巴結(jié)和脾臟的研磨液分別與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行混合制備樣品(200 μL)，每個(gè)器官分別設(shè)置1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和陰性對(duì)照組，其對(duì)應(yīng)質(zhì)?？截悵舛纫来螢?×104、1×103、1×102、0 copies(表3)，對(duì)制備的各組樣品進(jìn)行基因組DNA提取，然后用建立的ASFV探針?lè)p重qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，每組樣品做3個(gè)重復(fù)。通過(guò)對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，分析ASFV探針?lè)p重qPCR在檢測(cè)方面的初步應(yīng)用。另外使用本檢測(cè)方法對(duì)不同地區(qū)采集的194份豬臨床組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與商品化非洲豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較，計(jì)算結(jié)果的符合率。

表3 檢測(cè)方法初步應(yīng)用實(shí)驗(yàn)用樣品的制備

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品制備

C962R基因質(zhì)粒與MGF-505-2R基因質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，將2種質(zhì)粒分別稀釋至拷貝數(shù)為1×1010copies/μL作為原液，取10 μLMGF-505-2R基因質(zhì)粒和10 μLC962R基因質(zhì)粒原液混合加入80 μL ddH2O稀釋?zhuān)缓筇荻认♂尀?×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1 copies/μL，即為ASFV探針?lè)p重qPCR的標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 非洲豬瘟病毒探針?lè)p重?zé)晒舛縋CR條件的優(yōu)化

對(duì)MGF-505-2R基因和C962R基因的引物及探針的濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定ASFV探針?lè)p重qPCR的最佳反應(yīng)體系為：MGF-505-2R基因和C962R基因的上、下游引物終濃度均為0.2 μmol/L，探針濃度為0.1 μmol/L，標(biāo)準(zhǔn)品模板1 μL，Vazyme Probe Mix(諾唯贊探針?lè)A(yù)混液)10 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。最佳反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)；40 ℃冷卻1 min。

2.3 敏感性試驗(yàn)

以濃度梯度濃度稀釋為1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1 copies/μL的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增曲線(xiàn)(圖1)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為1×101copies/μL時(shí)，仍有S型擴(kuò)增曲線(xiàn)，結(jié)果表明，該檢測(cè)方法最低可檢測(cè)到1×101copies/μL。將濃度值與Ct值代入公式:

2.4 特異性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的ASFV探針?lè)p重qPCR對(duì)1×104copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品模板、Ery、HPS、SS、APP、PCV2和PRV的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，僅標(biāo)準(zhǔn)品模板有特異性曲線(xiàn)，而Ery、HPS、SS、APP、PCV2和PRV均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)(圖2)，說(shuō)明該檢測(cè)方法具有良好的特異性。

ROX：R1.1×105 copies/μL；R2.1×104 copies/μL；R3.1×103 copies/μL；R4.1×102 copies/μL；R5.1×101 copies/μL；R6.1 copies/μL；R7.0 copies/μL。

ROX：R.1×105 copies/μL；FAM：F.1×105 copies/μL

2.5 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表4和表5可知，取1×105、1×104、1×103、1×102copies/μL 4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)3次，結(jié)果顯示各濃度Ct值變異系數(shù)為0.07%～1.75%，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的ASFV探針?lè)p重qPCR檢測(cè)方法在批內(nèi)具有良好的重復(fù)性。

2.6 批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表6和表7可知，取1×105，1×103，1×102，1×101copies/μL 4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在同一條件下進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果顯示各濃度Ct值變異系數(shù)為0.14%～1.20%，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的ASFV探針?lè)p重qPCR檢測(cè)方法在批間具有良好的重復(fù)性。

表4 ASFV探針?lè)p重qPCR的FAM通道批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

表5 ASFV探針?lè)p重qPCR的ROX通道批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 防污染試驗(yàn)結(jié)果

使用1×103copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到的產(chǎn)物通過(guò)膠回收純化，得到的樣品濃度為76 ng/μL，將樣品進(jìn)行濃度梯度稀釋為7.6×101、7.6、7.6×10-1、7.6×10-2、7.6×10-3、7.6×10-4、7.6×10-5fg/μL，進(jìn)一步對(duì)以上樣品進(jìn)行qPCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3A和圖3B所示，在不含UNG酶的情況下，所有測(cè)試樣品都產(chǎn)生了陽(yáng)性結(jié)果，特別是從這些DNA水平無(wú)法檢測(cè)的樣本中產(chǎn)生的陽(yáng)性結(jié)果，被認(rèn)為是假陽(yáng)性。然而，如圖3C和圖3D所示，在含有UNG酶的情況下，F(xiàn)AM通道反應(yīng)能夠消除小于7.6×10-2fg/μL的假陽(yáng)性擴(kuò)增，ROX通道能夠消除小于7.6×10-1fg/μL的假陽(yáng)性擴(kuò)增，結(jié)果表明，本研究建立的ASFV的防污染雙重qPCR檢測(cè)方法可以有效地消除低劑量污染產(chǎn)生的假陽(yáng)性擴(kuò)增。

表6 ASFV探針?lè)p重qPCR的FAM通道批間重復(fù)性試驗(yàn)

表7 ASFV探針?lè)p重qPCR的ROX通道批間重復(fù)性試驗(yàn)

A.不含UNG酶反應(yīng)體系的FAM通道檢測(cè)結(jié)果；B.不含UNG酶反應(yīng)體系的ROX通道檢測(cè)結(jié)果；C.含UNG酶反應(yīng)體系的FAM通道檢測(cè)結(jié)果；D.含UNG酶反應(yīng)體系的ROX通道檢測(cè)結(jié)果；曲線(xiàn)1～8分別表示PCR產(chǎn)物(7.6×101、7.6、7.6×10-1、7.6×10-2、7.6×10-3、7.6×10-4、7.6×10-5、0 f g/μL)

2.8 非洲豬瘟病毒探針?lè)p重?zé)晒舛縋CR的初步應(yīng)用及臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

由表8和表9可知，對(duì)扁桃體1號(hào)、扁桃體2號(hào)、扁桃體3號(hào)、扁桃體陰性、淋巴結(jié)1號(hào)、淋巴結(jié)2號(hào)、淋巴結(jié)3號(hào)、淋巴結(jié)陰性、脾臟1號(hào)、脾臟2號(hào)、脾臟3號(hào)、脾臟陰性共12個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果顯示，對(duì)于100 copies～10 000 copies的樣本進(jìn)行核酸提取并檢測(cè)，檢出率為100%。與敏感性結(jié)果比較，相同數(shù)量拷貝的樣本Ct無(wú)明顯差異。與特異性結(jié)果比較，豬淋巴結(jié)等免疫器官的基因組不發(fā)生非特異性反應(yīng)。另外，對(duì)于194份臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，與商品化非洲豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相比較，符合率為100%。綜合以上結(jié)果，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的ASFV探針?lè)p重qPCR檢測(cè)方法效果良好，能夠從復(fù)雜的組織樣品中特異的檢測(cè)出C962R基因和MGF-505-2R基因，與商品化非洲豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒比較，檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%。

表8 ASFV探針?lè)p重qPCR的FAM通道初步應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果

表9 ASFV探針?lè)p重qPCR的ROX通道初步應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前針對(duì)非洲豬瘟的防控，精準(zhǔn)快速的診斷技術(shù)配合科學(xué)的生物安全措施是最有效的處理方法。在眾多的檢測(cè)方法中，qPCR具有操作簡(jiǎn)單、敏感性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前ASFV檢測(cè)應(yīng)用最廣的方法之一[12]。但是，目前市面上ASFV的檢測(cè)只針對(duì)P72基因。由于qPCR的高敏感，即使有少量的氣溶膠污染，也會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，因此實(shí)驗(yàn)室一旦發(fā)生P72基因氣溶膠污染，將無(wú)法準(zhǔn)確判定待測(cè)樣本的陰性或陽(yáng)性。另外，近日臨床上已發(fā)現(xiàn)MGF基因缺失的變異株，并出現(xiàn)新的流行特點(diǎn)，加大了非洲豬瘟的診斷和防控難度，目前針對(duì)P72基因的檢測(cè)方法將無(wú)法區(qū)分野毒株與變異株。為解決以上難題，本研究基于C962R基因和MGF-505-2R基因分別設(shè)計(jì)引物和探針，構(gòu)建了ASFV防污染雙重qPCR檢測(cè)方法。

常用的qPCR檢測(cè)方法包括SYBR Green qPCR和TaqMan探針qPCR檢測(cè)方法等，其中SYBR Green qPCR方法是通過(guò)熒光染料與雙鏈DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合顯示熒光，即體系中任何雙鏈DNA結(jié)構(gòu)存在都會(huì)顯示熒光，故容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[13]。另外，目前對(duì)于DNA的測(cè)定，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定方法采用紫外吸收法[14]，但紫外吸收法的對(duì)樣品的純度有較高的要求，一般要求核酸濃度大于0.25 μg/mL[15],對(duì)于氣溶膠等無(wú)法進(jìn)行DNA測(cè)定的低劑量環(huán)境污染樣本，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[16]。本研究建立的雙重qPCR檢測(cè)方法是根據(jù)TagMan探針qPCR原理設(shè)計(jì)，由于TagMan探針能與病毒基因特異性結(jié)合，可以有效避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生。另外，本研究通過(guò)在反應(yīng)體系中加入dUTP和UNG酶 ，可有效防止氣溶膠等低劑量污染導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生[17]。該檢測(cè)方法具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，C962R基因與MGF-505-2R基因的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)分別為0.997 6和0.998 3。敏感性與Wang A P和Jia R等[18]建立的ASFV實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)方法高10倍，比WOAH推薦的qPCR方法高100倍，并且與多種病癥相似的豬疫病病原(Ery、HPS、SS、APP、PCV2和PRV)均無(wú)交叉反應(yīng)。批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于1.75%，表明本研究建立的檢測(cè)方法重復(fù)性良好。對(duì)于該檢測(cè)方法初步應(yīng)用的模擬試驗(yàn)說(shuō)明，該檢測(cè)方法可以從復(fù)雜樣品特異的檢測(cè)出C962R基因和MGF-505-2R基因，可用于野毒株與MGF變異株的鑒別診斷，對(duì)于194個(gè)臨床組織樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該檢測(cè)方法與商品化試劑盒的陰性符合率為100%。

綜上所述，本研究建立的檢測(cè)方法擴(kuò)增效率高，敏感性、特異性和重復(fù)性良好，一方面解決了市面上針對(duì)P72基因檢測(cè)單一性的問(wèn)題，另一方面解決了類(lèi)似氣溶膠低劑量污染產(chǎn)生假陽(yáng)性的難題。該方法可用于野毒株與MGF-505-2R基因變異株的鑒別診斷，可為深入開(kāi)展分子流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)儲(chǔ)備。