表達(dá)O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重組塞內(nèi)卡病毒的構(gòu)建與鑒定

黃 凱，王 豪，牛晨霞，農(nóng)作榮，莫勇芳，劉文波，陳 櫻，歐陽(yáng)康，黃偉堅(jiān)，韋祖樟

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530005)

A型塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A，SVA)原名塞內(nèi)卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)，于2015年正式更名為Senecavirus A(SVA)，并劃分至小RNA病毒科的一個(gè)新屬——塞內(nèi)卡病毒屬，到目前為止，SVA是該屬的唯一成員[1]。SVA基因組為單股正鏈RNA，包含5’UTR、編碼一個(gè)多聚蛋白的開放閱讀框(ORF)和3’UTR，大小約7 200 nt[2]。SVA原型毒株沒有致病性，但近年來(lái)許多研究報(bào)道提示，SVA與豬特發(fā)性水皰病和新生仔豬死亡率升高密切相關(guān)[3-5]。SVA可感染不同年齡段豬，新生仔豬感染后死亡率較高，育肥豬和母豬感染后發(fā)病率和病死率相對(duì)較低[6]。豬感染SVA后以體溫升高、口鼻附近和蹄冠部形成水皰、潰瘍?yōu)橹?，伴隨著食欲下降、精神沉郁、嗜睡、肌肉無(wú)力、跛行、腹瀉和神經(jīng)癥狀等為主[7]，與其他致水皰病相關(guān)病原，如口蹄疫病毒、豬傳染性水皰病病毒、水皰性口炎病毒等，所致癥狀在臨床上無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分。目前在國(guó)內(nèi)外尚無(wú)商品化SVA疫苗，如何有效防控SVA成為了一個(gè)新的難題。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus， FMDV)引起的一種急性、烈性、高度接觸傳染性動(dòng)物疫病，在我國(guó)被歸屬于一類動(dòng)物疫病，F(xiàn)MDV感染廣，傳播快，它可以感染70多種野生動(dòng)物[8]，其中豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物最為易感。FMDV有A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3共7種血清型，且各血清型之間不存在交叉保護(hù)性[9]。血清型A、O、Asia1感染在我國(guó)發(fā)病率最高，其中又以O(shè)型流行最為廣泛[10]。FMDV在翻譯病毒蛋白過(guò)程中，可形成VP1、VP2、VP3、VP4共4種結(jié)構(gòu)蛋白和L蛋白、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D共8種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP1蛋白的G-H 環(huán)(141 aa-160 aa)和 C 末端(200 aa-213 aa)存在兩個(gè)線性抗原表位，是決定FMDV抗原性、刺激宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答和中和性抗體的主要抗原蛋白[11]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有學(xué)者通過(guò)反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建RNA病毒的全長(zhǎng)cDNA感染性克隆，在cDNA水平對(duì)病毒基因組進(jìn)行操作，將外源基因插入病毒基因組，構(gòu)建重組病毒進(jìn)行目的蛋白表達(dá)[12]。SVA 2A蛋白的C端具有小RNA病毒科的保守基序NPG↓P[3]，研究表明，小RNA病毒科的多種病毒都可在該位置引入外源基因。Sharma B等[13]在2019年成功拯救了1株重組SVA，并對(duì)其免疫原性及安全性進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示重組病毒對(duì)豬沒有明顯致病性，重組病毒毒力減弱，但依然具有良好的免疫原性，提示SVA可能是一種理想的活病毒載體，對(duì)于研發(fā)以SVA為載體的基因工程疫苗提供了重要參考。另外，有研究在SVA全長(zhǎng)基因組中插入了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因，并且表達(dá)出增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，所拯救的含有EGFP基因的重組SVA毒株具有良好的遺傳穩(wěn)定性以及與親本毒株相似的生物學(xué)特性[14-15]。

廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室(以下簡(jiǎn)稱本實(shí)驗(yàn)室)前期以分離得到的毒株SVA CH-GX-01-2018(GenBank：MK039162.1)[16]為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建了SVA全長(zhǎng)感染性克隆pSVA-GX01，并在SVA 2A與2B基因之間插入了綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因，且成功表達(dá)。本研究在上述研究基礎(chǔ)上，將綠色熒光蛋白基因替換為O型口蹄疫病毒VP1蛋白基因，以期獲得表達(dá)豬O型FMDV VP1蛋白的重組SVA，并對(duì)拯救所得的重組SVA進(jìn)行鑒定與體外生長(zhǎng)增殖特性以及遺傳穩(wěn)定性分析，為研發(fā)一種新型的基因工程活載體疫苗用于塞內(nèi)卡病毒和口蹄疫病毒的免疫保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞 以本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的毒株SVA CH-GX-01-2018(GenBank：MK039162.1)[16]為基礎(chǔ)，將SVA CH-GX-01-2018株全長(zhǎng)基因組分段克隆至pBluescript載體，并在其5′端引入CMV啟動(dòng)子，3′末端引入丁型肝炎病毒(HDV)核酶與牛生長(zhǎng)激素(BGH)信號(hào)序列，構(gòu)建的SVA全長(zhǎng)感染性克隆pSVA-GX01(數(shù)據(jù)未發(fā)表)；含有GFP基因的SVA重組質(zhì)粒pSVA-GX01-GFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保存；含有豬O型FMDV VP1蛋白基因的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)重組質(zhì)粒pGXAM-12BS-FMDV-VP1-O由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保存；倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 高保真DNA聚合酶PrimeSTAR?MAX DNA Polymerase、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000，TaKaRa Bio公司產(chǎn)品；高保真限制性核酸內(nèi)切酶SpeⅠ-HF、BamHⅠ-HF、T4 DNA連接酶，New England Bio Labs公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、反應(yīng)液回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，Omega Bio-Tek公司產(chǎn)品；大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體(Lipofectamine) 2 000，Invitrogen公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)和FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(H+L)，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SVA VP1蛋白多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備與保存[17]；O型FMDV VP1蛋白多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備與保存等。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀，ProFlex公司產(chǎn)品；微量移液器、小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠核酸電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；精密恒溫培養(yǎng)箱和振蕩箱、二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋，邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品；顯微鏡、倒置熒光顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考O型口蹄疫病毒MYA/3/2010株的VP1基因序列(GenBank：JQ070319.1)，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引入SpeⅠ、下游引入BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的引物，引物序列為：FMDV-VP1-O-F：5′-acgACTAGTaccacttcgacaggcgagtc-3′(下劃線部分為SpeⅠ識(shí)別位點(diǎn))；FMDV-VP1-O-R：5′-cgtGGATCCcaaggactgcttcacaggtgcca-3′(下劃線部分為BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn))；參考楊彩娟等[18]設(shè)計(jì)1對(duì)SVA檢測(cè)引物，序列為：SVA-2682-F：5′-TTCCACTCCACCGACAACG-3′；SVA-3224-R：5′-GATACCTTCCCACCCTTGC-3′；參考SVA CH-GX-01-2018(GenBank：MK039162.1)[16]的基因序列在插入位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)1對(duì)引物用于鑒定重組病毒及測(cè)序，引物序列為：SVA-F：5′-GACTGGGGGACCATTTACGCCTTC-3′；SVA-R：5′-TTGCATCTTGAACAACTTTCGGA-3′，上述引物由北京擎科生物科技有限公司南寧合成部合成。

1.2.2 O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆 將質(zhì)粒pGXAM-12BS-FMDV-VP1-O稀釋1 000倍后以其為模板，使用PrimeSTAR MIX高保真DNA聚合酶和引物對(duì)FMDV-VP1-O-F、FMDV-VP1-O-R擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μL體系：PrimeSTAR MIX 12.5 μL，上、下游引物分別0.5 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O補(bǔ)全至25 μL，配制兩管共50 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，共32個(gè)循環(huán)；繼續(xù)延伸72 ℃ 10 min后經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的條帶使用Omega Bio-Tek公司膠回收試劑盒純化回收。

1.2.3 表達(dá)O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重組SVA質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用SpeⅠ-HF和BamHⅠ-HF同時(shí)酶切pSVA-GX01-GFP和O型FMDV VP1回收產(chǎn)物，分別配制50 μL體系：SpeⅠ-HF 1 μL，BamHⅠ-HF 1 μL，Cutsmart buffer 5 μL，模板質(zhì)粒pSVA-GFP/FMDV VP1回收產(chǎn)物15 μL，ddH2O補(bǔ)全至50 μL，37 ℃作用6 h以上，pSVA-GFP酶切產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收SVA全長(zhǎng)目的片段。O型FMDV VP1酶切產(chǎn)物直接純化回收。二者回收產(chǎn)物通過(guò)T4連接酶16 ℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含氨芐青霉素抗性LA平板培養(yǎng),并挑取單克隆菌落搖菌培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽(yáng)性克隆大量擴(kuò)繁后，菌液用Omega Bio-Tek公司質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切與廣州華大生物科技有限公司測(cè)序進(jìn)一步鑒定，正確的質(zhì)粒命名為pSVA-FMDV-VP1-O。

1.2.4 表達(dá)O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重組SVA的拯救與鑒定

1.2.4.1 重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O的拯救 將BHK-21細(xì)胞傳至6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)，用脂質(zhì)體2 000介導(dǎo)將pSVA-FMDV-VP1-O重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立親本對(duì)照(pSVA-GX01)、脂質(zhì)體對(duì)照和陰性細(xì)胞對(duì)照，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞病變情況，48 h后收取上清，重新感染新鋪板的BHK-21細(xì)胞，直到能夠穩(wěn)定產(chǎn)生CPE，如細(xì)胞出現(xiàn)拉絲、變圓、脫落或空泡狀等病變現(xiàn)象。將得到的重組病毒命名為rSVA-FMDV-VP1-O。

1.2.4.2 間接免疫熒光(IFA)鑒定SVA VP1抗原 當(dāng)6孔板中的BHK-21細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)，將P3代rSVA-FMDV-VP1-O以0.1 MOI接種，置于含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立親本病毒rSVA-GX01對(duì)照和陰性細(xì)胞對(duì)照。12 h～24 h棄上清，PBS洗滌3遍后用冰甲醇4 ℃固定30 min；PBS洗滌3次后用10 mg/mL BSA室溫封閉30 min；PBS洗滌3次后SVA VP1兔多克隆抗體(1∶100稀釋)，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌5次(微量振蕩器，每次5 min)后加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶500稀釋)，室溫避光孵育1 h，完成后用PBS洗滌5次(微量振蕩器，每次5 min，注意避光)，結(jié)束后用熒光倒置顯微鏡在暗環(huán)境下觀察結(jié)果。

1.2.4.3 間接免疫熒光(IFA)鑒定FMDV VP1表達(dá) 操作步驟同1.2.4.2，一抗改用實(shí)驗(yàn)室制備的O型FMDV VP1小鼠多克隆抗體，二抗為FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG。

1.2.4.4 重組病毒RT-PCR鑒定 收取P3代病毒上清液，用AxyPrep DNA/RNA小量提取試劑盒提取重組病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用SVA特異性檢測(cè)引物對(duì)SVA-2682-F和SVA-3224-R以及O型FMDV VP1特異性引物對(duì)FMDV-VP1-O-F和FMDV-VP1-O-R進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.5 重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O滴度測(cè)定 待96孔板中BHK-21細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)，取P3代rSVA-FMDV-VP1-O和親本毒株rSVA-GX01病毒液連續(xù)倍比稀釋(10-1～10-12)后100 μL/孔接種，每個(gè)稀釋梯度8個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置兩列20 mL/L FBS DMEM作為陰性對(duì)照。將加好樣的96孔板置于含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，密切觀察96孔細(xì)胞板中的細(xì)胞病變情況，記錄出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔，連續(xù)觀察數(shù)天直至不再有新的細(xì)胞病變出現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)每個(gè)稀釋梯度出現(xiàn)病變的孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)取平均值。

1.2.6 重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O體外生長(zhǎng)特性測(cè)定 以0.1 MOI的感染劑量將拯救病毒rSVA-FMDV-VP1-O和親本病毒rSVA-GX01接種于鋪有密度約80% BHK-21細(xì)胞的6孔板中，每種病毒設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在接種后6、12、24、36、48、72 h分別收取細(xì)胞上清并測(cè)定其TCID50，具體操作步驟同1.2.5，根據(jù)所得結(jié)果繪制病毒的體外生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O遺傳穩(wěn)定性鑒定 將重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳至第10代，收集感染細(xì)胞上清保存?zhèn)溆?。用AxyPrep DNA/RNA小量提取試劑盒提取傳代3代、6代、9代的重組病毒上清的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，使用FMDV VP1插入位置的SVA基因特異的上、下游引物SVA-F和SVA-R擴(kuò)增插入的外源基因進(jìn)行PCR鑒定，目的條帶經(jīng)Omega Bio-Tek公司膠回收試劑盒純化回收后，送廣州華大生物科技有限公司進(jìn)一步測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)O型口蹄疫VP1蛋白的重組SVA質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以質(zhì)粒pGXAM-12BS-FMDV-VP1-O為模板，用設(shè)計(jì)的引物FMDV-VP1-O-F和FMDV-VP1-O-R擴(kuò)增FMDV的VP1基因，通過(guò)SpeⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增的FMDV VP1基因基因替換GFP基因至SVA全長(zhǎng)感染性克隆2A與2B基因之間，重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如圖1。將得到的重組質(zhì)粒命名為pSVA-FMDV-VP1-O，并使用SpeⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定及送廣州華大生物科技有限公司進(jìn)一步測(cè)序測(cè)定(結(jié)果未顯示)，結(jié)果顯示獲得了正確的重組質(zhì)粒。

圖1 攜帶FMDV VP1 的SVA重組克隆構(gòu)建策略

2.2 表達(dá)O型口蹄疫VP1蛋白的重組SVA病毒的拯救與鑒定

將重組質(zhì)粒pSVA-FMDV-VP1-O和親本質(zhì)粒pSVA-GX01轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，48 h后收取上清，重新感染新鋪板的BHK-21細(xì)胞，直到細(xì)胞穩(wěn)定出現(xiàn)CPE，陰性對(duì)照無(wú)明顯變化(圖2A)。將得到的重組病毒命名為rSVA-FMDV-VP1-O。為鑒定拯救的重組病毒，用SVA VP1多克隆抗體做間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果如圖2B所示，接種重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O和親本毒株rSVA-GX01的樣本都可觀察到特異性熒光，而陰性對(duì)照無(wú)熒光產(chǎn)生，說(shuō)明重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O可表達(dá)SVA VP1蛋白。用O型FMDV VP1多克隆抗體做間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果如圖2C，接種重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O的樣本能觀察到特異性熒光，而接種親本毒株rSVA-GX01的樣本和陰性對(duì)照無(wú)熒光產(chǎn)生，說(shuō)明重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O可表達(dá)FMDV VP1蛋白。最后，進(jìn)一步對(duì)其用SVA特異性檢測(cè)引物和O型FMDV VP1引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖3。用SVA特異性檢測(cè)引物以rSVA-GX01和rSVA-FMDV-VP1-O感染細(xì)胞上清制備的模板均能擴(kuò)增出符合預(yù)期大小的特異性條帶，而用O型FMDV VP1引物僅能以rSVA-FMDV-VP1-O感染細(xì)胞上清制備的模板擴(kuò)增出符合預(yù)期大小的特異性條帶。結(jié)果說(shuō)明成功拯救到重組病毒，并且O型FMDV VP1可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

圖2 重組病毒感染細(xì)胞病變(A)和IFA鑒定SVA VP1蛋白(B)以及FMDV VP1蛋白(C)(20×)

2.3 重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O體外生長(zhǎng)特性測(cè)定

通過(guò)對(duì)重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O與親本毒株rSVA-GX01進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的繪制(圖4)，可以看出重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O滴度略低于親本毒株rSVA-GX01，但差異不顯著，2種病毒均在36 h左右達(dá)到峰值，說(shuō)明重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O與親本毒株rSVA-GX01在BHK-21細(xì)胞中具有相似的生長(zhǎng)復(fù)制特性。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.rSVA-FMDV-VP1-O；2.rSVA-GX01 M.DNA Marker DL 2 000；1.rSVA-FMDV-VP1-O；2.rSVA-GX01

圖4 rSVA-FMDV-VP1-O和rSVA-GX01生長(zhǎng)曲線

2.4 重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O遺傳穩(wěn)定性鑒定

分別抽提P3、P6、P9代重組病毒感染細(xì)胞上清液的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后使用FMDV VP1插入位置的SVA基因特異的上、下游引物進(jìn)行PCR鑒定，并用重組質(zhì)粒pSVA-FMDV-VP1-O為對(duì)照(圖5)，P3和P6代rSVA-FMDV-VP1-O感染細(xì)胞上清均能檢測(cè)到符合預(yù)期大小的與重組質(zhì)粒pSVA-FMDV-VP1-O一致的特異性條帶，但以第9代病毒上清制備的模板能擴(kuò)增出兩個(gè)主要的特異性條帶，一個(gè)條帶與預(yù)期大小吻合，另外一個(gè)小于預(yù)期大小，將較小的特異性條帶回收后送廣州華大生物科技有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示FMDV VP1基因缺失約480 bp(結(jié)果未顯示)，說(shuō)明第9代重組病毒中外源基因已經(jīng)開始缺失，重組病毒rSVA-FMDV-VP1-O可在BHK-21細(xì)胞上穩(wěn)定存在6代。

3 討論

SVA是一種新發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物病原。2015年，我國(guó)廣東省首次發(fā)現(xiàn)SVA感染病例[19]，其后陸續(xù)在其他省份都有報(bào)道[20-21]。有研究表明，除了豬是SVA易感動(dòng)物外，多種動(dòng)物都可感染SVA，如牛、鼠等，甚至在人體血清內(nèi)也檢測(cè)到過(guò)SVA中和抗體[22]，這說(shuō)明SVA可潛在感染多種動(dòng)物和人，已經(jīng)成為臨床上一種重要的傳染病病原。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.P3代rSVA-FMDV-VP1-O；2.P6代rSVA-FMDV-VP1-O；3.P9代rSVA-FMDV-VP1-O；4.pSVA-FMDV-VP1-O對(duì)照；5.rSVA-GX01對(duì)照；6.陰性對(duì)照

SVA 2A蛋白的C端具有小RNA病毒科的保守基序NPG↓P，其可能與核糖體跳躍機(jī)制相關(guān)，是一個(gè)理想的外源基因插入位點(diǎn)。有研究通過(guò)SVA反向遺傳操作系統(tǒng)，將外源綠色增強(qiáng)熒光蛋白EGFP、熒光素酶等基因插入SVA基因組的2A與2B基因之間，構(gòu)建的重組病毒均能成功表達(dá)出有活性的報(bào)告蛋白[14-15]，含有外源EGFP的重組SVA可在細(xì)胞上至少穩(wěn)定傳10代仍可表達(dá)綠色熒光[23]，這對(duì)于以SVA為載體表達(dá)其他病毒的外源基因提供了參考。

本研究將FMDV的主要中和性抗原蛋白VP1基因克隆進(jìn)入SVA全長(zhǎng)感染性克隆質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pSVA-FMDV-VP1-O，并通過(guò)病毒拯救得到了1株可表達(dá)O型FMDV VP1蛋白的重組塞內(nèi)卡病毒rSVA-FMDV-VP1-O。對(duì)該重組病毒進(jìn)行鑒定與體外生長(zhǎng)增殖特性以及遺傳穩(wěn)定性分析，O型FMDV的VP1蛋白在該重組病毒上成功表達(dá)，且插入的O型FMDV VP1蛋白基因可以在BHK-21細(xì)胞上穩(wěn)定遺傳6代，該重組病毒和親本毒株具有相似的生長(zhǎng)復(fù)制特性。O型FMDV VP1蛋白以SVA為載體的成功表達(dá)，進(jìn)一步為SVA可在2A與2B基因之間插入外源基因提供了有力論證，也為其他傳染病病原如豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬瘟病毒(CSFV)等重要抗原基因的插入提供了一定的參考，為今后研發(fā)一種新型的基因工程活載體疫苗用于同時(shí)防控塞內(nèi)卡病毒和口蹄疫病毒甚至其他多種病毒的免疫保護(hù)奠定了基礎(chǔ)。