SD大鼠灌胃妙茯止痛顆粒單次給藥毒性試驗(yàn)

薛 蕊 楊國(guó)卉 李萬(wàn)芳 楊春燕 魯碧楠 周文斌 許嘉鵬*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500； 2.云南省彝醫(yī)醫(yī)院/云南省彝族醫(yī)藥研究所，云南 楚雄 675000； 3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，北京 100050； 4.民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中央民族大學(xué))/中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081

隨著人們生活水平的進(jìn)步，飲食結(jié)構(gòu)的改變，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的患病率也在不斷增長(zhǎng)，并呈年輕化趨勢(shì)發(fā)展。西醫(yī)治療此病的主要方法為急性期消炎鎮(zhèn)痛，間歇期降尿酸，但常伴隨消化道、肝腎損傷等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的治療信心。與之相比，傳統(tǒng)醫(yī)藥不僅能明顯改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者的癥狀，又具有毒副作用低、可減少?gòu)?fù)發(fā)、價(jià)格實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)。中藥的毒性有廣義與狹義的區(qū)分。廣義的“毒”為藥物的偏性和治療作用，狹義的“毒”為與治療無(wú)關(guān)的作用[1]?！端貑?wèn)》有言：“毒藥治其內(nèi)，針石治其外?！薄吨T病源候論》記載：“凡藥云有毒及大毒者，皆能變亂，于人為害，亦能殺人?！币虼藢?duì)中藥的毒性進(jìn)行深入探究，也是為臨床安全用藥提供有力保障。在臨床應(yīng)用中，通過(guò)中藥的配伍和(或)炮制的方法，來(lái)降低(消除)藥物的毒性作用，增強(qiáng)藥效，提升治療作用，從而保證患者的安全。

妙茯止痛顆粒是云南省楚雄州中醫(yī)醫(yī)院名老彝醫(yī)張之道和余惠祥專(zhuān)家的臨床經(jīng)驗(yàn)方，并以協(xié)定處方的形式在院內(nèi)使用，療效肯定。該方由土茯苓(洪賒牛)、紅萆薢(土澀)各30 g，醋莪術(shù)、炒蒼術(shù)、百合、車(chē)前子(自然熬)、大追風(fēng)(乃替力)各20 g，葉下花(帕陶唯)、威靈仙、黃柏各15 g組成，具有清熱除濕，化瘀散結(jié)等功效，對(duì)于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期濕熱閉阻證有良好的治療效果[2]。制成顆粒劑也更方便患者直接沖服，具有易于儲(chǔ)存、方便攜帶、干凈衛(wèi)生等優(yōu)點(diǎn)[3]。為進(jìn)一步探究該組方的安全性，以《中藥、天然藥物急性毒性研究指導(dǎo)原則》[4]《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[5]等為根據(jù)，本試驗(yàn)對(duì)大鼠采取單次最大給藥量，觀察用藥后大鼠的毒性反應(yīng)，為臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境 SD大鼠40只，SPF級(jí)，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)201-0006，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：110011201100703。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施持續(xù)保持屏障環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，主要環(huán)境指標(biāo)的控制范圍：室溫20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。最小換氣次數(shù)15次/h，光照明∶暗=12 h∶12 h。

動(dòng)物飼養(yǎng)于聚丙烯大鼠群養(yǎng)盒中：籠具視格為:545 mm×395 mm×200 mm，每盒5只，其飼養(yǎng)空間符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010中關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所需最小空間的規(guī)定，自由飲食和進(jìn)水。新領(lǐng)到的動(dòng)物檢疫期6 d，動(dòng)物反應(yīng)靈敏、攝食和健康狀況良好且無(wú)異常分泌物，大鼠皮毛光滑、確認(rèn)健康無(wú)病，可以用于試驗(yàn)。

1.2 藥品 妙茯止痛顆粒(批號(hào)：19110561，云南省彝醫(yī)醫(yī)院)，性狀:棕色顆粒。15～25 ℃遮光干燥保存。

1.3 儀器 賽多利斯電子天平。

2 方法

2.1 劑量設(shè)計(jì)及動(dòng)物分組大鼠單次給藥 臨床擬用劑量：642.86 mg/kg；給藥途徑：口服；臨床擬用療程：5 d；臨床主要適應(yīng)癥：痛風(fēng)性關(guān)節(jié)急性期濕熱痹阻證。劑量與分組：本試驗(yàn)采用最大給藥量法，每天給藥2次，1次給藥劑量20 g/kg。給藥濃度40 g/kg，給藥體積為10 mL/kg，給藥劑量相當(dāng)于臨床劑量的62倍。試驗(yàn)共設(shè)2組，每組20只大鼠，雌雄各半。具體見(jiàn)表1。

表1 SD大鼠灌胃妙茯止痛顆粒單次給藥毒性試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)

2.2 供試品制劑配制 稱(chēng)取一定量的供試品于研缽中，加入適量蒸餾水研磨，轉(zhuǎn)入量筒，再加蒸餾水沖洗研缽后轉(zhuǎn)入量筒，再加蒸餾水至所需體積；轉(zhuǎn)至棕色試劑瓶中，再用攪拌器混勻后使用，共配制2次(上下午各一次)并保證現(xiàn)用現(xiàn)配。取用供試品的數(shù)量、日期、使用人員、使用目的等均登記記錄，每次給藥后剩余的供試品制劑直接進(jìn)行廢棄處理并記錄。

2.3 動(dòng)物給藥及藥后觀察 采用灌胃給藥，給藥前禁食12～16 h，給藥2次(間隔4 h)，每次給藥體積為10 mL/kg；第二次給藥后3～4 h給予飼料。每次給藥后4 h內(nèi)籠旁觀察，嚴(yán)密觀察動(dòng)物對(duì)供試品的反應(yīng)，連續(xù)觀察14 d。主要觀察動(dòng)物外觀、行為活動(dòng)情況、呼吸狀態(tài)、分泌物、排泄物等。分別于接收時(shí)、分組時(shí)、給藥當(dāng)天、給藥后第1天、第4天、第7天、第11天、第14天動(dòng)物稱(chēng)重，且保持相同時(shí)間。觀察期結(jié)束時(shí)，將存活動(dòng)物安樂(lè)死，并進(jìn)行解剖檢查，觀察心、肝、腎、脾、肺、胃腸等臟器的變化。

3 統(tǒng)計(jì)與分析

4 結(jié)果

4.1 動(dòng)物以一般狀況觀察 第一次給藥后給藥組所有動(dòng)物均未見(jiàn)明顯異常；第二次給藥后給藥組部分動(dòng)物在藥后可見(jiàn)活動(dòng)減少、豎毛，且4 h內(nèi)未恢復(fù)。給藥后第1天雌鼠No.23出現(xiàn)肛周污穢，雄鼠No.31～35出現(xiàn)肛周污穢；給藥后第2天雌鼠No.23出現(xiàn)肛周污穢，雄鼠No.34出現(xiàn)肛周污穢；給藥后第3～14天，所有動(dòng)物外觀、行為活動(dòng)情況、呼吸狀態(tài)、分泌物、排泄物等均未見(jiàn)異常。給藥途中未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。

4.2 剖檢結(jié)果 14 d觀察期結(jié)束后對(duì)全部動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死，對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行尸解及大體觀察，所有動(dòng)物心、肝、腎、脾、肺、胃腸等臟器均未見(jiàn)明顯異常。

4.3 動(dòng)物體重 試驗(yàn)期間，給藥組雌雄鼠各階段體重與溶媒對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 SD大鼠灌胃妙茯止痛顆粒單次給藥毒性試驗(yàn)雌鼠體重表

表3 SD大鼠灌胃妙茯止痛顆粒單次給藥毒性試驗(yàn)雄鼠體重

5 討論

急性毒性試驗(yàn)是指單次或多次給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某種受試藥物后，觀察受試藥物在短時(shí)間內(nèi)對(duì)動(dòng)物所產(chǎn)生毒性反應(yīng)的一種試驗(yàn)方法[6]。用蒸餾水溶解并確定妙茯止痛顆粒單次最大給藥量實(shí)驗(yàn)濃度為2 g/mL，24 h內(nèi)灌胃兩次。此濃度為妙茯止痛顆粒能溶且可順利通過(guò)灌胃針頭的最大濃度；灌胃的最大給藥體積是10 mL/kg，故SD大鼠一天內(nèi)最大給藥量為40 g/kg，妙茯止痛顆粒臨床擬用劑量為642.86 mg/kg(成人)，使用下述計(jì)算公式：40(g/kg)÷642.86(mg/kg)≈62。SD大鼠24 h內(nèi)2次灌胃妙茯止痛顆粒的給藥劑量相當(dāng)于臨床劑量的62倍，在試驗(yàn)過(guò)程中第二次給藥時(shí)個(gè)別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)肛周污穢，活動(dòng)減少的情況，但停藥后未出現(xiàn)臟器的異常變化及死亡。故妙茯止痛顆粒臨床擬用劑量較為安全。

土茯苓(洪賒牛)是臨床上治療痛風(fēng)的常用藥。研究[7-8]表明，單味土茯苓、萆薢土茯苓合二妙散加減、土茯苓飲等諸多方劑均對(duì)治療痛風(fēng)的療效明顯，且毒副作用小。其中紅萆薢(土澀)的萆薢總皂苷[9]對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有防治作用，可影響NALP3炎性體信號(hào)通路。劉敏等[10]研究發(fā)現(xiàn)由黃柏和蒼術(shù)組成的二妙散是清熱燥濕藥的基礎(chǔ)名方，其水提液的最大耐受量為130.65 g/kg，在臨床上對(duì)于關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等具有良好的治療作用，可通過(guò)抑制 IL-1β、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生從而減輕炎癥的發(fā)生與發(fā)展。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，威靈仙中毒的報(bào)道也有一定的記載，威靈仙中所含的白頭翁素和原白頭翁素的主要功效是祛風(fēng)濕、止痹痛，也是產(chǎn)生毒副作用的主要來(lái)源，當(dāng)大量或過(guò)量的外敷內(nèi)服時(shí)，易產(chǎn)生過(guò)敏性皮炎、惡心嘔吐、心律失常等不良反應(yīng)[11-12]。但是原白頭翁素、白頭翁素具有一定的揮發(fā)性，增加煎煮時(shí)間，則可以降低其毒性[11-12]。于舒雁等[13]實(shí)驗(yàn)證明威靈仙提取液可通過(guò)降低血清炎癥因子的水平來(lái)緩解大鼠足趾的腫脹和屈伸不利的癥狀，降低痛閾，有良好的消腫止痛的作用。另外仝小林院士[14]以三味小方治療高尿酸血癥，方中土茯苓為15～60 g,威靈仙為9～30 g,萆薢為15～30 g。另外，一般威靈仙單次水煎劑量以15～30 g為宜[15]。李君玲等[16]通過(guò)對(duì)門(mén)診140例患者的回顧性分析，證實(shí)了該方能顯著降低尿酸水平，比西藥治療更加安全，可整體調(diào)節(jié)患者的癥狀。

大追風(fēng)(乃替力)是彝醫(yī)治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的常用藥物[17]，具有通利關(guān)節(jié)的作用。楊本燕等[18]研究表明將透骨草、大追風(fēng)、飛龍斬血等藥用制成酊劑，對(duì)關(guān)節(jié)炎患處濕敷，并配合TDP治療，總有效率為 93.33%。李紅銳等[19]統(tǒng)計(jì)研究表明，葉下花對(duì)風(fēng)濕痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛和風(fēng)濕骨痛有一定的治療效果，是彝族特色藥物之一。莪術(shù)的行氣破血和消積止痛的功效顯著。馮洪山等[20]運(yùn)用苓皮除濕宣痹方加減治療關(guān)節(jié)炎癥，有良好的治療效果。喬文豪等[21]研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)具有抗血小板聚集的作用，所含有的莪術(shù)二酮影響凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化和聚集的標(biāo)志物、信號(hào)通路。百合是藥食同源的植物，藥膳百合赤豆湯，百合粥等均有緩解痛風(fēng)的效果[22-23]，另外百合車(chē)前草湯[24]臨床實(shí)踐證明能很好地改善患者因痛風(fēng)導(dǎo)致的關(guān)節(jié)紅腫熱痛。陳紅梅等[25]研究發(fā)現(xiàn)葎草百合湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎聯(lián)合秋水仙堿比單用西藥秋水仙堿臨床治療效果更佳，有效率為86.6%。費(fèi)洪新等[26]研究表明車(chē)前子對(duì)尿酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)腫脹作用效果明顯。車(chē)前子配方顆粒[27]通過(guò)抑制IL-12水平來(lái)改善小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的癥狀，并且對(duì)機(jī)體的副作用較小。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)中藥成方的臨床療效方面研究較多，中藥顆粒劑的毒性研究、湯劑與顆粒劑的效果對(duì)比研究也較少，部分藥物的毒性劑量研究尚不精確，有待日后進(jìn)一步探究。