LncRNA H19通過PI3K/Akt通路對海人酸致癲癇大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響

李華曉，麥浩堅，宋同均，王士強(qiáng)，黎志迪，陳小鳳

癲癇是由大腦某特定區(qū)域神經(jīng)元過度放電引發(fā)的一種常見慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其典型臨床特征是反復(fù)的局部或全身性肌肉痙攣、抽搐和意識障礙，影響著全球數(shù)千萬人的健康和生活質(zhì)量[1-2]。盡管已有大量關(guān)于癲癇發(fā)生機(jī)制的研究，但其詳細(xì)發(fā)生機(jī)制至今仍未闡明。自噬作為一種高度保守的降解過程已被發(fā)現(xiàn)與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)，高度自噬是大腦神經(jīng)元死亡的一大誘因，而神經(jīng)元死亡是造成癲癇發(fā)生的一個重要因素[3]。因此，抑制神經(jīng)元過度自噬可能對癲癇的治療具有重要意義，有必要對癲癇過程中自噬的發(fā)生及抑制機(jī)制進(jìn)行探究。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，LncRNA)作為一種長度大于200 nt的非編碼核糖核苷酸，可參與調(diào)控基因表達(dá)，近年來有研究發(fā)現(xiàn)其參與癲癇、腦梗死等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[4]。LncRNA H19是最早發(fā)現(xiàn)的LncRNA之一，在癲癇中明顯上調(diào)，并且參與細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)等癲癇發(fā)生的多個方面[5-6]。研究表明，H19過表達(dá)會加劇顳葉癲癇模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，而抑制其表達(dá)可保護(hù)細(xì)胞損傷[7]。磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/serine/threonine protein kinase B，PI3K/Akt)通路參與癲癇的發(fā)生，其激活不僅有助于成人中樞神經(jīng)元的再生[8]，還可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬，從而改善癲癇[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注小鼠腦組織中LncRNA H19表達(dá)上調(diào)，其可通過抑制PI3K/Akt通路增加腦損傷[10]。本研究探討LncRNA H19是否可同樣通過調(diào)控PI3K/Akt通路影響癲癇大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬，以期對癲癇的自噬及治療機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 50只無特定病原體(SPF)級SD大鼠(體質(zhì)量235～280 g)，購自中山大學(xué)(實(shí)驗(yàn)動物中心東校區(qū))，許可證：SCXK(粵)2016-0029，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周(12 h明暗交替)，適應(yīng)期內(nèi)采食、飲水自由，試驗(yàn)前禁食12 h。

1.2 主要試劑 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：AR1180-100、RP1105)購自上海恒斐生物科技有限公司；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑盒(貨號：QPG-050～QPG-052)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；總蛋白提取試劑盒(貨號：SD-001/SN-002)購自英文特生物技術(shù)(北京)有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(貨號：CD-10793-ML)購自武漢純度生物科技有限公司；Goat Anti-Rabbit IgG H&L辣根過氧化物酶(HRP)抗體、兔抗Beclin-1抗體(貨號：ab6721、ab62557、ab51520)購自Abcam；兔抗微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、PI3K、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)抗體(貨號：4108、2118、4228、4257、9272、9271)購自Cell Signaling Technology。

AlphaImager HP凝膠成像系統(tǒng)購自美國ProteinSimple公司；7500/7500 Fast Real-time Quantitative PCR購自AppliedBiosystems/賽默飛。

1.3 方法

1.3.1 分組與癲癇模型構(gòu)建 將50只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、NC組(空載體)、LncRNA H19-shRNA組、LncRNA H19-shRNA+LY294002組(10 μL、1 μg/μL PI3K特異性抑制劑LY294002)[11]，每組10只。癲癇模型大鼠構(gòu)建：大鼠于頸內(nèi)皮下注射10 mg/kg海人酸，若大鼠連續(xù)3次出現(xiàn)Ⅳ級及以上癲癇行為則表明造模成功[12]，對照組注射等量生理鹽水。Racine分級標(biāo)準(zhǔn)：0級為未出現(xiàn)抽搐發(fā)作現(xiàn)象；Ⅰ級為出現(xiàn)面部痙攣(包括咀嚼、立須、眨眼)；Ⅱ級為出現(xiàn)以點(diǎn)頭運(yùn)動為主的頭頸部痙攣；Ⅲ級為出現(xiàn)一側(cè)前肢抽搐；Ⅳ級為出現(xiàn)身體直立伴兩前肢抽搐；Ⅴ級為出現(xiàn)身體跌倒，四肢抽搐。造模成功后進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，消毒后于腦部做正中矢狀切口，于顱骨中線兩側(cè)開適當(dāng)大小骨窗，取微量注射器吸取5 μL LncRNA H19-shRNA及空載體、10 μL LY294002對各組大鼠海馬CA1區(qū)進(jìn)行相應(yīng)注射(1 μL/min)，注射結(jié)束后留針5 min，骨蠟封口、縫合傷口，觀察大鼠行為學(xué)變化，1周后頸椎脫臼處死大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 腦電圖觀察大鼠腦電波 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠全部麻醉后固定于腦立體定位儀上以頂部為中心，于中線兩側(cè)旁開2.0 mm，前囟前2.0 mm，前囟后3.8 mm植入皮下針型電極，縫合固定電極后記錄1 h內(nèi)腦電圖(耳為參考電極)，設(shè)置靈敏度500 μV，濾波2 Hz，紙速1.25 mm/s，時間常數(shù)0.2。

1.3.3 qRT-PCR檢測大鼠海馬組織中LncRNA H19表達(dá)水平 將5只大鼠的海馬組織于研缽中研磨后，一部分使用Trizol法提取組織總RNA，檢測濃度及純度后以其為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)qRT-PCR試劑盒以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，GAPDH為內(nèi)參，經(jīng)2-△△Ct分析LncRNA H19表達(dá)水平，另一部分用于蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測腦組織蛋白表達(dá)情況。引物名稱及序列見表1。

表1 引物名稱及序列(5′-3′)

1.3.4 Western Blot檢測大鼠海馬組織Beclin-1、LC3及通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 將腦組織裂解后提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度后取上樣緩沖液，將其與蛋白均勻混合進(jìn)行100 ℃變性5 min后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳(每孔40 μg)，蛋白分離后進(jìn)行低溫轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉(5%)，按1∶1 000添加兔抗Beclin-1、LC3、GAPDH、p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt一抗孵育過夜(4 ℃)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后再加入HRP標(biāo)記的免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶3 000)孵育2 h，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)化學(xué)發(fā)光試劑顯色，蛋白凝膠成像儀掃描觀察，Quantity One(version 4.6)軟件分析圖像，對Beclin-1、LC3、p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt蛋白含量進(jìn)行分析(n=5)。

1.3.5 HE及Nissl染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況 另取5只大鼠的海馬組織于4%多聚甲醛固定后(24 h)經(jīng)脫水、浸蠟包埋進(jìn)行連續(xù)冠狀切片(3 μm)，浸入二甲苯脫蠟、乙醇處理水化后，分別行HE染色與Nissl染色，然后脫水、封片、顯微鏡觀察(n=5)，隨機(jī)選取Nissl染色切片上CA1區(qū)5個視野進(jìn)行神經(jīng)元計數(shù)(n=5)。

1.3.6 透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元自噬情況 取大鼠海馬組織于戊二醛中固定12 h后進(jìn)行鋨酸固定，丙酮脫水、包埋、切片(50 nm)、枸櫞酸鉛染色后使用透射電鏡觀察自噬情況。

1.3.7 免疫組化法檢測大鼠海馬組織Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)情況 取石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后添加H2O2孵育20 min清除內(nèi)源性過氧化物酶，高壓修復(fù)抗原后添加Beclin-1、LC3Ⅱ一抗(1∶200)孵育過夜，加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體60 min后進(jìn)行PBS清洗、免疫組化(SP)法染色后，脫水、干燥、封片觀察到棕黃色為陽性染色。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦電圖及行為學(xué)觀察 對照組大鼠腦電圖波形正常、無癲癇發(fā)作；與對照組比較，模型組及NC組大鼠腦電圖出現(xiàn)高幅高頻波形，癲癇發(fā)作Ⅳ級以上；NC組大鼠腦電圖波形及癲癇發(fā)作程度與模型組比較無明顯差異；與模型組及NC組比較，LncRNA H19-shRNA組大鼠腦電圖波形呈低頻率及低幅波形，癲癇發(fā)作明顯減輕；與LncRNA H19-shRNA組比較LncRNA H19-shRNA+LY294002組大鼠腦電圖波形頻率增加，癲癇發(fā)作明顯加重。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦電圖(A為對照組；B為模型組；C為NC組；D為LncRNA H19-shRNA組；E為LncRNA H19-shRNA+LY294002組)

2.2 各組大鼠海馬組織LncRNA H19表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬組織LncRNA H19表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；NC組大鼠海馬組織LncRNA H19表達(dá)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，LncRNA H19-shRNA組大鼠海馬組織LncRNA H19表達(dá)水平明顯低于模型組、NC組(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠海馬組織LncRNA H19表達(dá)水平比較(±s)

2.3 各組大鼠海馬組織中Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，NC組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與對照組、模型組比較，LncRNA H19-shRNA組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與LncRNA H19-shRNA組比較，LncRNA H19-shRNA+LY294002組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。詳見表3、圖2。

表3 各組大鼠海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)比較(±s)

圖2 各組大鼠海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)條帶圖(A為對照組；B為模型組；C為NC組；D為LncRNA H19-shRNA組；E為LncRNA H19-shRNA+LY294002組)

2.4 各組大鼠海馬組織中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；NC組大鼠海馬組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達(dá)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，LncRNA H19-shRNA組大鼠海馬組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達(dá)水平較模型組、NC組明顯增加(P<0.05)；與LncRNA H19-shRNA組比較，LncRNA H19-shRNA+LY294002組大鼠海馬組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見表4、圖3。

表4 各組大鼠海馬組織中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較(±s)

圖3 各組大鼠海馬組織中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖(A為對照組；B為模型組；C為NC組；D為LncRNA H19-shRNA組；E為LncRNA H19-shRNA+LY294002組)

2.5 各組大鼠神經(jīng)元損傷 對照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列緊湊整齊、形態(tài)清晰完整，胞漿內(nèi)存在大量尼氏小體；模型組和NC組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列松散紊亂、邊界模糊、細(xì)胞核固縮、神經(jīng)元數(shù)目明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，LncRNA H19-shRNA組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列較為整齊緊湊，形態(tài)較為完整，核固縮現(xiàn)象減輕，尼氏小體數(shù)量增加，神經(jīng)元數(shù)目明顯增加(P<0.05)；與LncRNA H19-shRNA組比較，LncRNA H19-shRNA+LY294002組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷加重，數(shù)目明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4、圖5、表5。

圖4 HE染色觀察各組大鼠神經(jīng)元損傷情況(×400)

圖5 Nissl染色觀察各組大鼠神經(jīng)元存活數(shù)目情況(×400)

表5 各組大鼠神經(jīng)元存活數(shù)目情況比較(±s) 單位：個

2.6 透射電鏡觀察海馬組織神經(jīng)元自噬情況 對照組大鼠海馬神經(jīng)元存在少量溶酶體、未見自噬體；模型組和NC組大鼠海馬神經(jīng)元中出現(xiàn)大量自噬溶酶體；與模型組比較，LncRNA H19-shRNA組海馬神經(jīng)元中自噬溶酶體數(shù)目明顯減少；與LncRNA H19-shRNA組比較，LncRNA H19-shRNA+LY294002組海馬神經(jīng)元中自噬體數(shù)目明顯增加。詳見圖6。

圖6 透射電鏡觀察海馬組織神經(jīng)元自噬情況(×25 000)

2.7 免疫組化法檢測各組大鼠海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)情況 Beclin-1與LC3Ⅱ廣泛存在于神經(jīng)元胞漿中，與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ陽性表達(dá)明顯增加；與模型組比較，NC組Beclin-1、LC3Ⅱ陽性表達(dá)無差異，LncRNA H19-shRNA組Beclin-1、LC3Ⅱ陽性表達(dá)明顯降低；與LncRNA H19-shRNA組比較，LncRNA H19-shRNA+LY294002組Beclin-1、LC3Ⅱ陽性表達(dá)明顯增加。詳見圖7。

圖7 免疫組化法檢測各組大鼠海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)情況(×200)

3 討 論

癲癇是由神經(jīng)元的異常興奮誘發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其持續(xù)狀態(tài)可造成神經(jīng)系統(tǒng)和海馬神經(jīng)元急性或持久性的損傷[13]。癲癇病人存在一種或多種行為或認(rèn)知障礙，其死亡風(fēng)險高出正常人群2～3倍，是全球疾病相關(guān)死亡的主要原因[14]。自噬是一種保守的細(xì)胞降解途徑，正常生理狀態(tài)下處于低水平，通過降解受損、衰老蛋白質(zhì)及細(xì)胞器來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但過度自噬則會導(dǎo)致細(xì)胞損傷[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬與癲癇之間存在緊密聯(lián)系，過度的自噬可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，造成腦組織損傷，因此，自噬可能是治療癲癇的一個新的突破口，有必要對其進(jìn)行詳細(xì)探究[14-15]。

LncRNA作為一類無編碼蛋白質(zhì)功能的轉(zhuǎn)錄本，通過調(diào)控基因表達(dá)參與細(xì)胞增殖、分化、自噬等生物學(xué)過程，參與癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[16]。LncRNA H19被認(rèn)為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，與缺血性腦卒中及癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關(guān)，LncRNA H19在癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元中表達(dá)水平明顯增加[5，17]。在癲癇潛伏期LncRNA H19處于高表達(dá)狀態(tài)，LncRNA H19通過靶向抑制let-7b表達(dá)促進(jìn)海馬神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)癲癇發(fā)作[18]。有研究表明，LncRNA H19通過抑制MAP磷酸酶雙特異性磷酸酶5(DUSP5)-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)軸激活自噬，誘導(dǎo)腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦電圖出現(xiàn)高幅高頻波形，癲癇發(fā)作，LncRNA H19表達(dá)水平、神經(jīng)元損傷程度明顯增加，神經(jīng)元存活數(shù)目降低，而LncRNA H19表達(dá)沉默可減輕大鼠癲癇發(fā)作程度、神經(jīng)元損傷程度，增加神經(jīng)元存活數(shù)目，該結(jié)果與其他研究結(jié)果[18]相一致，表明LncRNA H19參與癲癇的發(fā)生，其水平增加可促進(jìn)大鼠神經(jīng)元損傷，誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，提示LncRNA H19可作為癲癇的一個潛在的治療靶點(diǎn)。LC3參與自噬體的形成，LC3Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ可促進(jìn)自噬的發(fā)生，而Beclin1表達(dá)水平增加則會誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[20]。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ表達(dá)水平明顯增加，而LncRNA H19表達(dá)沉默可降低Beclin-1、LC3Ⅱ表達(dá)水平，表明LncRNA H19表達(dá)增加對神經(jīng)元的損傷可能與其促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。

PI3K/Akt在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有廣泛的表達(dá)，是細(xì)胞存活及增殖的有效調(diào)節(jié)劑[21]。PI3K/Akt通路激活可抑制神經(jīng)元凋亡并減輕癲癇模型大鼠癲癇發(fā)作程度[21]。LncRNA 母系表達(dá)基因3(materally expressed gene 3，MEG3)通過激活PI3K/Akt/雷帕霉素受體蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路，抑制顳葉癲癇大鼠海馬神經(jīng)元炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡率，增加細(xì)胞活力[4]。LncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄物 1(MALAT1)表達(dá)沉默可通過激活PI3K/Akt信號通路抑制癲癇大鼠海馬神經(jīng)元自噬和細(xì)胞凋亡[22]。LncRNA H19低表達(dá)可通過促進(jìn)PI3K/Akt通路來抑制氧糖剝奪再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達(dá)水平明顯降低，LncRNA H19表達(dá)沉默可明顯增加p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達(dá)水平，表明PI3K/Akt通路參與癲癇的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt通路抑制劑可逆轉(zhuǎn)LncRNA H19表達(dá)沉默對大鼠癲癇、自噬的抑制作用，表明LncRNA H19沉默對癲癇大鼠神經(jīng)元自噬的抑制及神經(jīng)元損傷的改善可能與其激活PI3K/Akt通路有關(guān)。

綜上所述，LncRNA H19表達(dá)沉默可能通過促進(jìn)PI3K/Akt通路激活來抑制癲癇大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬，以此達(dá)到改善癲癇的作用。本研究不僅為癲癇自噬機(jī)制的研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)，還對癲癇的治療提供一個新的方向，但在未來的研究中還需對其下游機(jī)制進(jìn)行深入探究。