益氣瀉肺湯對(duì)慢性心力衰竭大鼠心臟及認(rèn)知功能的影響

黑穆榮，朱海燕，2，張心愛(ài)，竇晉芳，高瑜倩，張洪嘉，王志淼，彭嘉冉，趙 勇

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)作為多種慢性心臟疾病的晚期危重階段，其發(fā)病率逐年快速增長(zhǎng)并不斷攀升[1]。根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，住院CHF病人中，有將近50%的病人存在不同程度的認(rèn)知功能紊亂，其中，很大一部分會(huì)逐漸發(fā)展為癡呆[2-3]。而認(rèn)知障礙的出現(xiàn)將直接導(dǎo)致CHF病人自我監(jiān)測(cè)與自我護(hù)理能力降低，致使病情進(jìn)一步加重甚至死亡風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增高，社會(huì)醫(yī)療衛(wèi)生資源消耗增加[4]。這迫使人們將更多目光聚集到心臟和大腦的相互關(guān)系方面。中醫(yī)認(rèn)為“心主血脈”“心主神明”，心腦之間聯(lián)系密切，從心論治CHF認(rèn)知障礙具有重要研究?jī)r(jià)值。益氣瀉肺湯是由我國(guó)首都國(guó)醫(yī)名師郭維琴教授自主研制的一種治療心力衰竭的基礎(chǔ)方，臨床上通過(guò)辨證論治進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，多增加遠(yuǎn)志、石菖蒲等安神益智、祛痰開(kāi)竅之品來(lái)治療CHF伴認(rèn)知功能障礙，且療效顯著[5]。本研究觀察益氣瀉肺湯對(duì)CHF大鼠心臟和認(rèn)知功能的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療CHF同時(shí)改善認(rèn)知功能提供新的治療方法和思路。

1 材料與方法

1.1 主要藥物 益氣瀉肺湯主要成分為人參、生黃芪、車(chē)前子、茯苓、桑白皮、葶藶子、遠(yuǎn)志、石菖蒲等，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院中藥房提供顆粒劑。

1.2 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD雄性大鼠24只，12周齡，體質(zhì)量(210±10)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006，于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院SPFⅡ級(jí)動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度(25±2)℃，濕度(60±10)%，每籠5只，喂養(yǎng)大鼠合成飼料，自由飲水，室內(nèi)24 h光線照明，全自動(dòng)通風(fēng)系統(tǒng)。

1.3 主要試劑 血清血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(AMEKO，貨號(hào)AE90173Ra)；戊巴比妥鈉(上海艾研生物有限公司，批號(hào)：081130251)；注射用青霉素鈉(中諾藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H13021632)。

1.4 主要儀器 ALC-V8小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，心電圖機(jī)(CardiMax，F(xiàn)X-7202)，超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(FujiFilm Visual Sonics)，Morris水迷宮系統(tǒng)(上海移數(shù)科技有限公司，MD-021)，低溫高速離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司，BY-R320)，電子天平(上海菁海儀器有限公司，JA2003N)，Thermo酶標(biāo)儀，恒溫箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，GHX9160 B-2)，相機(jī)(Canon EOS Kiss X7i)等。

1.5 方法

1.5.1 模型制作 術(shù)前給予大鼠1%戊巴比妥鈉并按100 g體質(zhì)量0.5 mL腹腔注射以有效麻醉大鼠，固定大鼠四肢及頭部，胸部術(shù)區(qū)備皮，碘伏常規(guī)消毒，在無(wú)影燈直視下行氣管插管，呼吸機(jī)設(shè)定頻率80次/min，吸呼比1∶2，潮氣量按100 g體質(zhì)量3～4 mL，在心臟搏動(dòng)最明顯處，胸骨左緣約1 cm處切開(kāi)皮膚及肌層，順第3肋或第4肋間隙方向分開(kāi)肋骨，暴露心臟，在左心耳邊緣下2 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，閉胸后消毒切口，術(shù)后腹腔注射少量青霉素以預(yù)防感染。 若術(shù)后第 2 天心電圖顯示病理性 Q 波至少分布于Ⅰ、aVL、V3～V6導(dǎo)聯(lián)，可兼有V1、V2導(dǎo)聯(lián)，且病理性Q波大于7個(gè)，則判斷為造模成功[6]。

1.5.2 動(dòng)物分組及給藥劑量 將實(shí)驗(yàn)大鼠分為模型組、假手術(shù)組、益氣瀉肺湯組，每組8只，模型組與益氣瀉肺湯組大鼠根據(jù)心電圖Q波數(shù)量分層隨機(jī)分組。于術(shù)后第2天開(kāi)始給藥，益氣瀉肺湯組予益氣瀉肺湯13 g/(kg·d)灌胃，假手術(shù)組及模型組按100 g體質(zhì)量1 mL純凈水灌胃，共給藥8周。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 大鼠心功能檢測(cè) 取材前所有實(shí)驗(yàn)大鼠行彩色多普勒超聲心動(dòng)圖檢查，分別取左室乳頭肌短軸切面、左室長(zhǎng)軸切面，測(cè)定大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)，每只大鼠測(cè)量 3 次，以平均值為最終結(jié)果。

1.6.2 心肌組織病理變化 沿著心臟最大橫徑位置進(jìn)行橫切，選擇部分組織先用4%多聚甲醛固定，24 h后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。經(jīng)脫蠟、染色、脫水、透明和封片等蘇木精-伊紅(HE)染色標(biāo)準(zhǔn)流程后通過(guò)顯微鏡拍攝并分析圖像，觀察心肌組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6.3 舌象 取材前進(jìn)行舌象采集：采集前用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，解剖板固定大鼠四肢，用鑷子輕輕夾起大鼠舌頭，暴露舌腹面，于每日同一時(shí)間、相同光源下用相機(jī)拍攝大鼠舌腹面，采集大鼠舌象。

1.6.4 大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 假手術(shù)組、模型組、益氣瀉肺湯組大鼠給藥8周后行水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括定向航行實(shí)驗(yàn)(place navigation performance，PNP)以及空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe performance，SPP)，目的是通過(guò)分析大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期以及穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)變化，觀察大鼠尋找平臺(tái)路程，從而測(cè)試大鼠對(duì)平臺(tái)位置的記憶能力和空間學(xué)習(xí)能力。

1.6.5 血清AngⅡ檢測(cè) 經(jīng)腹主動(dòng)脈采集大鼠血液后，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，4 ℃溫度下離心10 min，取血清，采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清AngⅡ水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，益氣瀉肺湯組LVEF、LVFS水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表1。3組大鼠心臟超聲收縮期圖像見(jiàn)圖1。

表1 3組大鼠LVEF、LVFS水平比較(±s) 單位：%

圖1 3組大鼠心臟超聲收縮期圖像 (A為假手術(shù)組；B為模型組；C為益氣瀉肺湯組。箭頭標(biāo)示為3組大鼠心臟收縮期圖像)

2.2 3組大鼠心肌組織病理結(jié)果比較 假手術(shù)組大鼠心肌組織形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞排列整齊致密，胞核尺寸均一；模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)水腫、變性、壞死，胞核固縮，細(xì)胞間隙增大，可觀察到大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；益氣瀉肺湯組大鼠的心肌結(jié)構(gòu)較模型組有不同程度的改善，心肌纖維較完整，排列較整齊，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞染色相對(duì)較均勻。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理結(jié)果比較(HE，×200)(箭頭標(biāo)示為肥大的心肌細(xì)胞，且可以看到胞核固縮)

2.3 3組大鼠舌象觀察 通過(guò)觀察采集到的大鼠舌象，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠舌腹面舌色較假手術(shù)組紫暗，而益氣瀉肺湯組大鼠舌質(zhì)瘀滯程度較模型組改善。詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠舌象

2.4 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 3組大鼠逃避潛伏期比較 水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組比較，益氣瀉肺湯組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4。

圖4 3組大鼠逃避潛伏期比較

2.4.2 3組空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠穿越平臺(tái)次區(qū)域數(shù)明顯減少(P<0.05)，與模型組比較，益氣瀉肺湯組穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)顯著增多(P<0.05)。詳見(jiàn)表2及圖5。

表2 3組大鼠穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)比較(±s) 單位：次

圖5 3組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)軌跡圖比較

2.5 3組大鼠血清AngⅡ濃度比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清AngⅡ濃度明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，益氣瀉肺湯組大鼠血清AngⅡ濃度明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 3組大鼠血清AngⅡ濃度比較(±s) 單位：ng/L

3 討 論

CHF病人認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率與日俱增，并且CHF確診人群中40%～50%在6個(gè)月內(nèi)會(huì)再次入院，而部分病人再入院可能與其認(rèn)知功能障礙有關(guān)[7]。因此，心臟功能受損和認(rèn)知水平下降之間的惡性循環(huán)，仍是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題[8]。深入研究心與腦的關(guān)系對(duì)于提高CHF病人生活質(zhì)量、降低再入院率及死亡率具有重要意義。目前針對(duì)CHF伴認(rèn)知功能障礙的治療有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)等藥物療法，心臟移植和再同步治療手術(shù)途徑以及聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知訓(xùn)練、理療等多種方案[9]，但在人群普適度、藥物不良反應(yīng)等方面依舊存在一定的限制性，與此同時(shí)，中醫(yī)藥治療CHF并改善認(rèn)知功能的臨床療效具有明顯優(yōu)勢(shì)。

中醫(yī)認(rèn)為心腦之間的關(guān)系密不可分，近代醫(yī)學(xué)家張錫純很早提出“心腦共主神明”，心的精氣流注于腦，神得到充養(yǎng)而使腦主宰人體生命活動(dòng)，產(chǎn)生思維意識(shí)，支配相應(yīng)行為[10]，心腦通過(guò)臟腑經(jīng)絡(luò)在結(jié)構(gòu)上相互連接，功能上相互協(xié)調(diào)，共同統(tǒng)攝人體精神及軀體活動(dòng)。CHF屬中醫(yī)“心水”“心悸”“喘證”等范疇，該病病位在心，以氣短、喘憋、心慌為主要表現(xiàn)。郭維琴教授認(rèn)為氣虛血瘀、陽(yáng)虛水泛型心力衰竭在臨床最為常見(jiàn)，以外感風(fēng)邪、情志內(nèi)傷、勞逸失節(jié)等為誘因，耗傷心氣，氣虛可致陽(yáng)虛，血液失其溫煦，津液運(yùn)行停滯，則水停擾肺[11-12]，若心氣虛則推動(dòng)無(wú)力、瘀血痰濁阻閉心竅，日漸腎精虧虛，可致神失所養(yǎng)，髓減腦消，神機(jī)失用，發(fā)為癡呆[13]。因此，郭維琴教授認(rèn)為在臨床治療CHF伴認(rèn)知障礙時(shí)應(yīng)注意攻補(bǔ)兼施，堅(jiān)持益氣活血為主，兼顧溫陽(yáng)利水的基本法則。益氣瀉肺湯方中人參、生黃芪補(bǔ)元?dú)?，溫通心?yáng)，桑白皮、葶藶子瀉肺氣，消痰平喘，車(chē)前子、茯苓健脾氣，利水滲濕，配遠(yuǎn)志以安神益智，佐菖蒲以開(kāi)竅豁痰，同川芎、郁金達(dá)活血理氣通絡(luò)之效[14]。已有臨床試驗(yàn)證實(shí)，與單純西藥治療比較，聯(lián)合中醫(yī)益氣瀉肺治法能夠大幅提高病人LVEF，減低病人血清氨基末端B型尿鈉肽前體(NT-proBNP)水平，明顯改善病人心力衰竭癥狀，提高生活質(zhì)量[15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)益氣瀉肺湯干預(yù)后，CHF大鼠超聲心動(dòng)圖可見(jiàn)心肌收縮能力較模型組提高，LVEF、LVFS水平較模型組提高，證實(shí)益氣瀉肺湯可以改善CHF大鼠心臟泵血功能；HE染色病理結(jié)果顯示，益氣瀉肺湯組大鼠心肌細(xì)胞相對(duì)于模型組排列整齊，且細(xì)胞水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均減輕，提示益氣瀉肺湯能夠在一定程度上改善心肌纖維化，延緩心室重構(gòu)。結(jié)合大鼠舌象，模型組大鼠舌象較假手術(shù)組紫暗，符合氣虛血瘀型CHF證型特點(diǎn)，益氣瀉肺湯組大鼠舌腹面舌色瘀暗程度較模型組明顯改善，提示大鼠氣虛血瘀的程度得到緩解。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠較假手術(shù)組逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)減少，說(shuō)明CHF大鼠確已存在空間學(xué)習(xí)以及記憶能力下降，而益氣瀉肺湯組逃避潛伏期較模型組明顯縮短，穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)較模型組增多，證實(shí)益氣瀉肺湯能夠提高CHF大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

目前關(guān)于CHF導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的機(jī)制尚不統(tǒng)一，許多研究者認(rèn)為CHF認(rèn)知功能障礙與大腦低灌注相關(guān)[16]。然而，在射血分?jǐn)?shù)保留的CHF病人中，認(rèn)知障礙的出現(xiàn)也同樣常見(jiàn)，說(shuō)明心力衰竭引起的癡呆不完全是腦的低灌注所致[17]。在心力衰竭病人血壓偏低的情況下繼續(xù)給予 ACEI類(lèi)藥物治療，仍能夠使認(rèn)知障礙得到極大的改善，提示 ACEI 對(duì)于認(rèn)知功能的改善獨(dú)立于其降壓作用[18]。有研究表明，CHF病人腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統(tǒng)激活，釋放過(guò)多的神經(jīng)遞質(zhì)與積聚的Aβ淀粉樣蛋白具有神經(jīng)元細(xì)胞毒性，進(jìn)而導(dǎo)致記憶力減退、執(zhí)行能力下降等認(rèn)知功能損傷[19-20]。另有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證實(shí)，AngⅡ促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)釋放增加，催化炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞腫脹、壞死、凋亡，促進(jìn)認(rèn)知功能障礙發(fā)生發(fā)展[21]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清AngⅡ濃度較假手術(shù)組明顯升高，益氣瀉肺湯組大鼠血清AngⅡ濃度較模型組顯著減少，提示益氣瀉肺湯改善CHF認(rèn)知功能障礙可能與下調(diào)AngⅡ水平有關(guān)。

綜上所述，益氣瀉肺湯能夠改善CHF大鼠心臟泵血功能，延緩心肌重塑進(jìn)程，整體改善心臟功能，并且通過(guò)降低CHF大鼠血清AngⅡ濃度，抑制RAAS系統(tǒng)，對(duì)改善大鼠認(rèn)知水平起到積極作用。