基于層次分析法的正交試驗(yàn)優(yōu)選坐浴安散提取工藝*

覃 翔 ，李婉銘 ，韋金彩 ，廖 強(qiáng)

（1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011； 2. 廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530011； 3. 廣西壯族自治區(qū)南寧市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530004）

坐浴安散是廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院研發(fā)的中藥制劑（桂藥制字Z20050001），由大黃、功勞木、苦參、五倍子、兩面針等中藥組方，具有清熱解毒、消腫止痛功效，用于治療內(nèi)外痔發(fā)炎、痔瘺術(shù)后肛瘺腫痛，臨床療效顯著。方中，大黃、功勞木清熱解毒、活血化瘀，苦參清熱燥濕、殺蟲止癢，五倍子、白礬、芒硝、冰片收斂消腫、止血止癢，配以兩面針消腫止痛效果更佳［1-2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃含有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、有機(jī)酸類等化合物［3］。其中，主要藥效成分為蒽醌類化合物，包括結(jié)合型和游離型，結(jié)合型蒽醌可溶于熱水，幾乎不溶于冷水，游離型蒽醌難溶于水，均易溶于丙酮、甲醇、乙醇。功勞木主要含有小檗堿、巴馬汀、氧化小檗堿、尖刺堿、阿莫靈等生物堿類化合物［4］?？鄥⒅饕猩飰A類、黃酮類、氧雜蒽酮類、醌類、三萜糖苷、脂肪酸和揮發(fā)油［5］。五倍子的主要成分為鞣酸［6］。兩面針主要含有生物堿類、木脂素類有效成分［7］。根據(jù)處方中需提取的5味藥材有效成分的理化性質(zhì)，本研究中采取醇水雙提法，先用乙醇提取大黃，再將醇提后的藥渣與另外4味藥材（功勞木、苦參、五倍子、兩面針）一同用水進(jìn)行提取，最大限度地富集有效成分。采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定6 種指標(biāo)成分的含量，以醇提物中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量與醇提干膏得率為醇提工藝的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，以水提物中苦參堿、氧化苦參堿、鹽酸小檗堿的含量與水提干膏得率為水提工藝的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過層次分析（AHP）法建立指標(biāo)回歸模型，確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，以正交試驗(yàn)優(yōu)選醇提及水提工藝，為坐浴安散的提取工藝確立提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030（Plus）型高效液相色譜儀，配有真空脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外（UV）檢測(cè)器（日本島津公司）；VGT - 2227QTD 型超聲波清洗機(jī)（廣東固特超聲股份有限公司，功率為600 W，頻率為40 kHz）；xs205du型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；101-38型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱（上海滬越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；GM - 0.33A 型隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

大黃（批號(hào)為20210406），功勞木（批號(hào)為20201030），苦參（批號(hào)為20210316），五倍子（批號(hào)為20210316），均購自廣西柳州百草堂中藥飲片廠有限責(zé)任公司；兩面針（廣西德潤堂中藥科技有限公司，批號(hào)為20200901）。以上中藥飲片經(jīng)廣西壯族自治區(qū)南寧市食品藥品檢驗(yàn)所副主任藥師廖強(qiáng)鑒定均符合2020 年版《中國藥典（一部）》規(guī)定。大黃酸對(duì)照品（批號(hào)為110757-201607，含量為99.3%），大黃素對(duì)照品（批號(hào)為110756-201913，含量為96.0%），大黃酚對(duì)照品（批號(hào)為110796- 201922，含量為99.4%），鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為110713 -202015，含量為85.9%），苦參堿對(duì)照品（批號(hào)為110805-202010，含量為98.7%），氧化苦參堿對(duì)照品（批號(hào)為110780 - 201909，含量為92.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司），其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 多指標(biāo)含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Shim-pack GIST C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

醇提物大黃酸、大黃素、大黃酚：甲醇為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～5 min 時(shí)70%A，5～8 min 時(shí) 70%A → 85%A，8～20 min 時(shí)85%A，20～25 min 時(shí) 85%A → 70%A，25～30 min 時(shí)70%A）；檢測(cè)波長為254 nm。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。

水提物苦參堿、氧化苦參堿：乙腈為流動(dòng)相A，0.025 moL/ L 磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～10 min 時(shí) 2%A → 8%A，10～15 min 時(shí) 8%A，15～20 min 時(shí) 8%A → 2%A，20～25 min 時(shí) 2%A）；檢測(cè)波長為220 nm。理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。

水提物鹽酸小檗堿［8］：乙腈為流動(dòng)相A，0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液（加0.2%三乙胺，用磷酸調(diào)pH 至3）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～8 min 時(shí)22%A → 30%A，8～12 min 時(shí) 30%A → 50%A，12～18 min 時(shí) 50%A，18～22 min 時(shí) 50%A → 30%A，22～25 min 時(shí) 30%A →22%A，25～30 min 時(shí)22%A）；檢測(cè)波長為345 nm。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)應(yīng)不低于5 000。

2.1.2 溶液制備

分別取大黃酸、大黃素、大黃酚、苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為 26.18，24.24，26.18 μg/ mL 的大黃酸、大黃素、大黃酚混合對(duì)照品溶液Ⅰ及質(zhì)量濃度分別為58.14，158.75μg/mL 的苦參堿、氧化苦參堿混合對(duì)照品溶液Ⅱ。取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加鹽酸 - 甲醇溶液（1∶100，V/V）溶解，制成質(zhì)量濃度為11.38μg/mL的對(duì)照品溶液Ⅲ。

取坐浴安散醇提物干膏粉末（過4 號(hào)篩）0.03 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為600 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理（功率為600 W，頻率為40 kHz）2 min，加二氯甲烷10 mL，加熱回流1.0 h，放冷，置分液漏斗中，用少量二氯甲烷洗滌容器，置分液漏斗中，分取二氯甲烷層，酸液用二氯甲烷提取3 次，每次10 mL，合并二氯甲烷液，減壓干燥至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，0.45μm 微孔濾膜濾過，即得醇提物大黃酸、大黃素、大黃酚供試品溶液［9］。

取坐浴安散水提物干膏粉末（過4 號(hào)篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液2 mL，精密加入二氯甲烷50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為600 W，頻率為40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用二氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，0.45μm 微孔濾膜濾過，即得水提物苦參堿、氧化苦參堿供試品溶液［10］。

取坐浴安散水提物干膏粉末（過4 號(hào)篩）0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸- 甲醇溶液（1∶100，V/V）50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為600 W，頻率為40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用鹽酸 - 甲醇溶液（1∶100，V/V）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)欲}酸 - 甲醇溶液（1∶100，V/V）溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加鹽酸 - 甲醇溶液（1∶100，V/V）定容，搖勻，0.45μm 微孔濾膜濾過，即得水提物鹽酸小檗堿供試品溶液。

分別按處方比例稱取除苦參外的其他藥材和除功勞木外的其他藥材各1份，以及各自水提后得到的干膏粉末（過4 號(hào)篩），精密稱定，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：吸取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液Ⅰ，Ⅱ，對(duì)照品溶液Ⅲ和供試品溶液各適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中，大黃酸、大黃素、大黃酚、苦參堿、氧化苦參堿、鹽酸小檗堿與各雜質(zhì)峰分離度均較好，各待測(cè)成分的理論板數(shù)均符合要求。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液Ⅰ，Ⅱ和對(duì)照品溶液Ⅲ各1，2，4，6，8，9 mL，置10 mL容量瓶中，2 種混合對(duì)照品溶液用甲醇稀釋并定容，對(duì)照品溶液Ⅲ用鹽酸-甲醇溶液（1∶100，V/V）稀釋并定容，搖勻，即各得6 個(gè)梯度對(duì)照品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為（X，μg/mL）橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1，表明所測(cè)成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.1.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液Ⅰ，Ⅱ和對(duì)照品溶液Ⅲ各適量，以各自配制所用溶劑稀釋2 倍，作為混合對(duì)照品溶液a、混合對(duì)照品溶液b 和對(duì)照品溶液c。取上述3 種溶液各適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果見表1，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別取同一批坐浴安散醇提物和水提物干膏粉末各適量，精密稱定，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算平均含量。結(jié)果見表1，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下供試品溶液各適量，分別于室溫下放置 0，2，4，6，8，10 h 時(shí)按 2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果見表1，表明供試品溶液在室溫下10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知大黃酸、大黃素、大黃酚含量的坐浴安散醇提物干膏粉末6份，每份0.01 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加混合對(duì)照品溶液Ⅰ（大黃酸、大黃素、大黃酚質(zhì)量濃度分別為 26.18，24.24，26.18 μg/ mL）10 mL，加甲醇定容，按2.1.2項(xiàng)下“醇提物大黃酸、大黃素、大黃酚”中自“稱定質(zhì)量”起制備6 份加樣供試品溶液；取已知苦參堿、氧化苦參堿含量的坐浴安散水提物干膏粉末6 份，每份0.2 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加混合對(duì)照品溶液Ⅱ（苦參堿、氧化苦參堿質(zhì)量濃度分別為58.14，158.75 μg/ mL）2 mL，加二氯甲烷定容，按2.1.2項(xiàng)下“水提物苦參堿、氧化苦參堿”中自“稱定質(zhì)量”起制備6 份加樣供試品溶液；取已知鹽酸小檗堿含量的坐浴安散水提物干膏粉末6 份，每份0.05 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加對(duì)照品溶液Ⅲ（鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度為11.38μg/mL）2 mL，加鹽酸-甲醇溶液（1∶100，V/V）定容，按2.1.2 項(xiàng)下“水提物鹽酸小檗堿”中自“稱定質(zhì)量”起制備6 份加樣供試品溶液。上述加樣供試品溶液分別按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表1 方法學(xué)考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the methodological investigation（n=6）

2.1.4 含量計(jì)算

醇提物中大黃酸、大黃素、大黃酚含量按以下公式計(jì)算其含量。含量（mg/g）=［供試品溶液中待測(cè)成分質(zhì)量濃度（μg/mL）×供試品溶液總體積（mL）×25］/［供試品取樣量（g）×5×1 000］。

水提物中苦參堿、氧化苦參堿、鹽酸小檗堿含量按以下公式計(jì)算其含量。含量（mg/g）=［供試品溶液中待測(cè)成分質(zhì)量濃度（μg/mL）×供試品溶液總體積（mL）］/［供試品取樣量（g）×1 000］。

2.2 提取物干膏得率計(jì)算［11］

精密吸取坐浴安散醇/水提取液適量，置干燥的恒定質(zhì)量蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘箱中干燥3.0 h，取出，干燥器中冷卻20 min，迅速稱定質(zhì)量，按以下公式計(jì)算干膏得率。干膏得率（%）=（干膏質(zhì)量×樣品總體積）/（飲片質(zhì)量×取樣體積）×100%。

2.3 AHP 法確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)

根據(jù)中藥復(fù)方君臣佐使配伍關(guān)系及各成分藥理作用強(qiáng)弱，參考文獻(xiàn)［12］，確定醇提工藝各指標(biāo)的優(yōu)先順序?yàn)榇簏S酸含量=大黃素含量=大黃酚含量>醇提干膏得率，水提工藝各指標(biāo)的優(yōu)先順序?yàn)辂}酸小檗堿含量> 苦參堿含量= 氧化苦參堿含量> 水提干膏得率。本研究中結(jié)合正交試驗(yàn)將評(píng)價(jià)系統(tǒng)設(shè)計(jì)為3層，繪制優(yōu)化層次結(jié)構(gòu)模型（圖2）。采用1～9 標(biāo)度法對(duì)4 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較評(píng)判重要性，按幾何平均法計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)。各指標(biāo)兩兩比較的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2，醇提/水提工藝優(yōu)先矩陣判斷見表3和表4。

圖2 坐浴安散工藝優(yōu)化層次結(jié)構(gòu)模型Fig.2 Hierarchical structure model for process optimization of Zuoyu” an Powder

表2 各指標(biāo)兩兩比較評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Scoring criteria for pairwise comparison of various indexes

表3 醇提工藝指標(biāo)成對(duì)比較的優(yōu)先矩陣判斷Tab.3 Precedence matrix judgment of pairwise comparison of various indexes in the alcohol extraction process

表4 水提工藝指標(biāo)成對(duì)比較的優(yōu)先矩陣判斷Tab.4 Precedence matrix judgment of pairwise comparison of various indexes in the water extraction process

使用AHP 分析V1.82_10.82 版軟件（南京邁實(shí)軟件有限公司）計(jì)算，求得大黃酸、大黃素、大黃酚含量和醇提干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.312 5，0.312 5，0.312 5，0.062 5，矩陣的最大特征值（λmax）=4，一致性指標(biāo)（CI）=0；鹽酸小檗堿、苦參堿、氧化苦參堿含量和水提干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.520 5，0.201 0，0.201 0，0.077 6，矩陣的λmax=4.043 38，CI=0.014 460 5。隨機(jī)一致性比率（CR）是衡量所得權(quán)重系數(shù)是否合理的重要指標(biāo)，CR=CI/RI，當(dāng)CR<0.1 時(shí)可判斷矩陣具有滿意的一致性及權(quán)重計(jì)算正確性。本研究中醇提和水提工藝的CR分別為0 和0.016 244 7，均小于0.1，表明4 項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)先比較矩陣滿足一致性要求，權(quán)重系數(shù)合理、有效，可用于坐浴安散醇提和水提工藝的綜合評(píng)分［13-14］。

2.4 提取工藝綜合評(píng)分

分別計(jì)算各指標(biāo)成分的含量及醇提/水提工藝的干膏得率，結(jié)合2.3項(xiàng)下確定的權(quán)重系數(shù)計(jì)算提取工藝綜合評(píng)分。醇提工藝綜合評(píng)分=［（大黃酸含量/大黃酸含量最大值）×0.312 5+（大黃素含量/大黃素含量最大值）×0.312 5+（大黃酚含量/大黃酚含量最大值）×0.312 5 +（醇提干膏得率/ 醇提干膏得率最大值）×0.062 5］×100；水提工藝綜合評(píng)分=［（鹽酸小檗堿含量/鹽酸小檗堿含量最大值）×0.520 5+（苦參堿含量/苦參堿含量最大值）×0.201 0+（氧化苦參堿含量/氧化苦參堿含量最大值）×0.201 0+（水提干膏得率/水提干膏得率最大值）×0.077 6］×100。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

2.5.1 醇提工藝單因素考察

乙醇體積分?jǐn)?shù)：稱取等量醇提藥材飲片5 份，每份各加相當(dāng)于飲片8 倍量的50%，60%，70%，80%，90%乙醇，分別提取1 次，每次40 min，計(jì)算5 份提取物的綜合評(píng)分。結(jié)果見圖3 A，表明固定其他條件不變，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，70%，80% 時(shí)提取物的綜合評(píng)分較高。

溶劑用量：稱取等量醇提藥材飲片5 份，每份各加相當(dāng)于飲片4，6，8，10，12倍的70%乙醇，分別提取1次，每次40 min，計(jì)算5份提取物的綜合評(píng)分。結(jié)果見圖3 B，表明固定其他條件不變，溶劑用量在8，10，12倍時(shí)提取物的綜合評(píng)分較高。

提取時(shí)間：稱取等量醇提藥材飲片5 份，每份各加相當(dāng)于飲片8 倍量的70%乙醇，分別提取1 次，分別提取10，20，40，60，90 min，計(jì)算5 份提取物的綜合評(píng)分。結(jié)果見圖3 C，表明固定其他條件不變，提取時(shí)間為20，40，60 min時(shí)提取物的綜合評(píng)分較高。

圖3 醇提工藝單因素多水平考察結(jié)果Fig.3 Results of single - factor and multi - level investigation of alcohol extraction process

提取次數(shù)：稱取等量醇提藥材飲片4 份，每份各加相當(dāng)于飲片 8 倍量的 70% 乙醇，分別提取 1，2，3，4 次，每次40 min，計(jì)算4份提取物的綜合評(píng)分。結(jié)果見圖3 D，表明固定其他條件不變，提取物綜合評(píng)分隨提取次數(shù)的增加而增加，但提取3 次后增長幅度很小，已接近提取完全，故選擇提取次數(shù)為1，2，3次。

2.5.2 水提工藝單因素考察

加水量：按處方比例稱取等量水提藥材飲片5 份，每份各加相當(dāng)于飲片4，6，8，10，12 倍的水，分別提取1 次，每次1.0 h，計(jì)算5 份提取物的綜合評(píng)分。結(jié)果見圖4 A，表明固定其他條件不變，加水量為8，10，12倍時(shí)提取物的綜合評(píng)分較高。

提取時(shí)間：按處方比例稱取等量水提藥材飲片5份，每份各加相當(dāng)于飲片10 倍量的水提取1 次，分別提取0.5，1.0，2.0，2.5 h，計(jì)算5 份提取物的綜合評(píng)分。結(jié)果見圖4 B，表明固定其他條件不變，提取時(shí)間為1.0，1.5，2.0 h時(shí)提取物的綜合評(píng)分較高。

提取次數(shù)：按處方比例稱取等量水提藥材飲片4份，每份各加相當(dāng)于飲片10 倍量的水，分別提取1，2，3，4 次，每次1.0 h，計(jì)算4 份提取物的綜合評(píng)分。結(jié)果見圖4 C，表明固定其他條件不變，提取物綜合評(píng)分在提取次數(shù)為1，2，3次時(shí)呈明顯增長趨勢(shì)，但提取次數(shù)為3，4 次時(shí)基本持平，已接近提取完全，故選擇提取次數(shù)為1，2，3次。

圖4 水提工藝單因素多水平考察結(jié)果Fig.4 Results of single-factor and multi-level investigation of water extraction process

2.5.3 因素與水平

醇提/水提工藝因素與水平分別見表5和表6。

表5 醇提工藝因素與水平Tab.5 Factors and their levels of alcohol extraction process

表6 水提工藝因素與水平Tab.6 Factors and their levels of water extraction process

2.5.4 正交試驗(yàn)與方差分析結(jié)果

醇提工藝：采用L（934）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果見表8。由表7 極差分析結(jié)果可知，4 個(gè)因素對(duì)醇提工藝的影響大小依次為A>C>D>B，因素不同水平對(duì)醇提工藝結(jié)果的綜合評(píng)分影響順序?yàn)锳2>A1>A3，B3> B2> B1，C2> C1> C3，D3> D2> D1，但影響因素 B的K1，K2，K3相差不大。通過綜合評(píng)分可知，最佳醇提工藝為A2B1C2D3。由表8 方差分析結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）和提取時(shí)間（C）對(duì)醇提工藝的影響均顯著（P<0.05），而溶劑用量（B）和提取次數(shù)（D）對(duì)醇提工藝的影響的不顯著（P>0.05）。為適應(yīng)醫(yī)院制劑的實(shí)際生產(chǎn)需要，最終確定最優(yōu)醇提工藝為A2B1C2D3，即加8 倍量70%乙醇，提取3次，每次40 min。

表7 醇提工藝L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of the L9（34） orthogonal test of alcohol extraction process

表8 醇提工藝綜合評(píng)分方差分析結(jié)果Tab.8 Results of ANOVA of comprehensive score of alcohol extraction process

水提工藝：采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表9，方差分析結(jié)果見表10。由表9 極差分析結(jié)果可知，3 個(gè)因素對(duì)水提工藝的影響大小依次為C>A>B，因素不同水平對(duì)水提工藝結(jié)果的綜合評(píng)分影響順序?yàn)锳3> A2>A1，B2>B1>B3，C3>C2>C1，但影響因素 B 的K1和K2相差不大。通過綜合評(píng)分可知，最佳水提工藝為A3B1C3。由表10方差分析結(jié)果可知，提取次數(shù)（C）對(duì)水提工藝的影響顯著（P<0.05），而加水量（A）和提取時(shí)間（B）對(duì)水提工藝的影響不顯著（P>0.05）。為適應(yīng)醫(yī)院制劑的實(shí)際生產(chǎn)需要，最終確定最優(yōu)水提工藝為A3B1C3，即加12倍量水，提取3次，每次1.0 h。

表9 水提工藝L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.9 Results of the L9（34） orthogonal test of water extraction process

表10 水提工藝綜合評(píng)分方差分析結(jié)果Tab.10 Results of ANOVA of comprehensive score of water extraction process

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

取10倍處方量的同一批藥材3份，按2.5項(xiàng)下優(yōu)選的醇提/水提工藝條件分別進(jìn)行提取，醇提物/水提物按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，并按正交試驗(yàn)中的綜合評(píng)分法（各指標(biāo)最大值按正交試驗(yàn)中的最大值計(jì)）對(duì)最終結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果見表11 和表12，表明該醇提/水提工藝有較好的穩(wěn)定性及重復(fù)性，可用于坐浴安散的工業(yè)化生產(chǎn)。

表11 醇提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.11 Results of the verification test of alcohol extraction process（n=3）

表12 水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.12 Results of the verification test of water extraction process（n=3）

根據(jù)此驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，最終擬訂坐浴安散的提取工藝為按處方比例稱取大黃，加入8 倍量的70%乙醇，提取3 次，每次40 min，合并乙醇液濃縮至少量；醇提后的藥渣與按處方比例稱取的另外4 味藥材（功勞木、苦參、五倍子、兩面針）一同進(jìn)行水提，加入12 倍量的水，提取3 次，每次1.0 h，合并提取液，濃縮至少量。

3 討論

3.1 HPLC 法含量測(cè)定中提取溶劑篩選

三氯甲烷為傳統(tǒng)有機(jī)溶劑，毒性高，對(duì)人體傷害大，應(yīng)慎用，而二氯甲烷的毒性較低，適合實(shí)驗(yàn)室提取（萃?。┕に嚥僮鳎?5］。故本研究中選用二氯甲烷替代三氯甲烷作為大黃和苦參制備供試品溶液的提取（萃?。┤軇?，結(jié)果可行。

3.2 工藝優(yōu)選指標(biāo)及權(quán)重確定

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，療效是多種有效成分共同作用的結(jié)果。本研究中依據(jù)君臣佐使的配伍原則，參照坐浴安散藥理作用的整體性，兼顧其多成分、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)，根據(jù)各指標(biāo)間的重要性差異，運(yùn)用AHP 法確定各指標(biāo)權(quán)重。AHP 法是一種定性和定量相結(jié)合的決策分析方法，通過數(shù)理運(yùn)算將主觀對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的重視程度與各項(xiàng)指標(biāo)間的相互聯(lián)系轉(zhuǎn)變?yōu)榭闪炕臋?quán)重系數(shù)，對(duì)權(quán)重進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，以判斷矩陣的可接受性，實(shí)現(xiàn)定性到定量的轉(zhuǎn)化，用于存在多種有效成分的中藥復(fù)方制劑提取工藝研究的綜合評(píng)價(jià)具有一定的科學(xué)性與合理性［16-17］。本研究中采用正交試驗(yàn)結(jié)合多指標(biāo)綜合評(píng)分法，以方中的君臣藥大黃、功勞木、苦參中有效成分大黃酸、大黃素、大黃酚、鹽酸小檗堿、苦參堿、氧化苦參堿的含量及干膏得率為考察指標(biāo)，對(duì)坐浴安散的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可靠，有效成分提取完全，為該制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.3 工藝優(yōu)化結(jié)果比較

坐浴安散優(yōu)化前的提取工藝為大黃、功勞木、苦參、五倍子、兩面針5味藥材加水煎煮2次，第1次2.0 h，第2次1.5 h，合并煎液。根據(jù)文獻(xiàn)［18-19］報(bào)道及2020年版《中國藥典（一部）》中所載復(fù)方制劑的制法工藝，大黃在復(fù)方制劑中的提取工藝多為醇提。故后續(xù)試驗(yàn)中取等量的同一批藥材2份，采用舊工藝與本研究中優(yōu)化工藝分別提取，測(cè)定并比較提取物，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的工藝中，君藥大黃的各項(xiàng)指標(biāo)提升明顯，方法確切有效，具有可操作性，可用于坐浴安散的實(shí)際生產(chǎn)，進(jìn)一步提升了該制劑的質(zhì)量。