SNHG12在乙肝病毒X蛋白誘導(dǎo)肝癌發(fā)生中的作用研究

吳 勇 況 欽 周夢(mèng)瑤 杜 彬 毋 楠 馮 濤

重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(重慶 400016 )

在原發(fā)性肝癌中，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見(jiàn)的一種類(lèi)型，也是全球癌癥死亡的主要之一[1]。全球大約有3.5億的人感染慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，占全球至少50%的HCC病例[2]。而乙肝病毒X蛋白(HBV X protein，HBx)是HBV的核心功能蛋白,它能夠通過(guò)蛋白和蛋白之間的相互作用,引起病毒的復(fù)制，從而更改宿主基因表達(dá)[3]。以至于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞的凋亡、遷移侵襲，以及導(dǎo)致代謝重組，從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生,促使HCC發(fā)展[4]。

大量的研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)在HCC發(fā)生中有著極其重要的作用[5]。lncRNA缺乏編碼蛋白質(zhì)的潛力，是長(zhǎng)度大于200 nt的RNA，但它在肝癌發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用，比如參加基因表達(dá)的調(diào)控，通過(guò)影響表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄、以及轉(zhuǎn)錄后[6], 從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞凋亡等，且與肝癌的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)理和患者的預(yù)后有著緊密的關(guān)系[7- 8]。當(dāng)今，在肝癌發(fā)生發(fā)展中LncRNA在其中的具體機(jī)制研究已經(jīng)得到了重視，這給HCC的早期診斷、病情的控制以及預(yù)后的評(píng)估帶來(lái)了一個(gè)新的方式[9]。研究表明在肝癌患者中，有許多的LncRNA可以穩(wěn)定的表達(dá)，這說(shuō)明LncRNA有希望在肝癌早期的診斷、病情的控制以及預(yù)后的評(píng)估成為一種新的腫瘤標(biāo)志物[9]。SNHG12 (小核仁RNA宿主基因12)是位于染色體1p35.3的腫瘤相關(guān)lncRNA。有報(bào)道稱(chēng)SNHG12在多種腫瘤中失調(diào)，如膠質(zhì)瘤、毛細(xì)管甲狀腺癌和胃癌，肝癌等，其致癌作用已被證。而在肝癌的發(fā)生發(fā)展中Notch信號(hào)通路也發(fā)揮著重要的作用，有研究表明，抑制SNHG12可以下調(diào)Notch1從而對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響[10]。

為了進(jìn)一步研究SNHG12在HBx導(dǎo)致的肝癌過(guò)程中的作用，本課題通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)HBx的小鼠模型，模擬了最自然的感染HBV病毒的情況，檢測(cè)從HBx感染到HCC發(fā)生過(guò)程中，SNHG12以及其靶基因Notch1的動(dòng)態(tài)變化，研究其潛在機(jī)制，為肝癌的早期診斷、藥物治療提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和動(dòng)物 肝前體細(xì)胞14-19、EGFP-14-19、HBx-EGFP-14-19由課題組前期構(gòu)建，昆明(KM)小鼠來(lái)源于重慶醫(yī)科大學(xué)的動(dòng)物中心，代養(yǎng)在無(wú)特殊病原體培養(yǎng)室[16]。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗、SYBR Green mix試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)，SNHG12的小分子RNA抑制劑(萊博斯生物技術(shù)有限公司)，血清(Cell Box)，β-actin、GAPDH和Notch1抗體(Cell Signaling Technology)，HBx抗體(Abcam)，Hes1、Bcl- 2、Bax抗體(上海泊灣生物科技)，CDK2和CyclinE 抗體(萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司)，ECL發(fā)光液、EndoFectinTM-MAX轉(zhuǎn)染試劑(GeneCopoeia)。

1.2 方法

1.2.1 篩選差異基因 用R(4.0.2)版本在GSE93789芯片獲得數(shù)據(jù)，經(jīng)pData函數(shù)獲得分組信息，exprs函數(shù)獲得表達(dá)矩陣并校正，進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，獲取注釋信息，探針轉(zhuǎn)換與基因去重，進(jìn)行差異分析，后續(xù)分析。最后篩選出具備表達(dá)差異的基因。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將課題組前期構(gòu)建好的肝前體細(xì)胞14-19，EGFP-14-19和HBx-EGFP-14-19復(fù)蘇，按血清:培養(yǎng)基=1:9的比例在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中。

1.2.3 小鼠模型構(gòu)建 將一個(gè)月左右的雄性KM小鼠30只，然后隨機(jī)分成3組:正常組-14-19組(n=5)、EGFP-14-19組(n=5)和 HBx-EGFP-14-19組(設(shè)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，共20只)。術(shù)前一天小鼠禁食，使用麻醉后將其固定在板上，用手擋住小鼠口鼻后噴酒精于腹部消毒，然后從腹中線(xiàn)剪開(kāi)至暴露肝臟。找到肝門(mén)靜脈，分別緩慢注入14-19、EGFP-14-19以及HBx- EGFP-14-19細(xì)胞懸液(5×105個(gè)細(xì)胞/200 μL PBS)，注射完成后用棉球止血，最后縫合切口。在30 d、90 d、180 d和360 d 分別將小鼠進(jìn)行安樂(lè)死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的部分新鮮肝組織侵泡在4%的多聚甲醛中，剩下的保存于液氮中。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè) 按照試劑盒操作說(shuō)明提總RNA后轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用無(wú)酶水稀釋10倍。保存于-20 ℃。反應(yīng)體系為10 μL(SYBR Green:正向引物:反向引物:無(wú)酶水:cDNA模板=5:0.5:0.5:2:2)，內(nèi)參為GAPDH，引物序列見(jiàn)表1。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)3次。使用CFX Manager軟件分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 Western blot 檢測(cè) 按照RIPA裂解液操作說(shuō)明( RIPA:PMSF=100:1)提取總蛋白，取小部分用BCA測(cè)蛋白濃度。剩余蛋白加入上樣緩沖液在100 ℃煮沸10～15 min后保留于-80 ℃。SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后TBST洗一次，孵一抗(1:1000)于4 ℃過(guò)夜。第二天用TBST洗3次，每次5 min后放于二抗孵育2 h，最后用ECL發(fā)光液顯影，以GAPDH及β-actin作為內(nèi)參。

1.2.6 SNHG12的si-RNA si-RNA小分子干擾RNA的篩選：鋪板：將實(shí)驗(yàn)分成5組(HBx、NC、si-RNA1-SNHG12、si-RNA2-SNHG12、si-RNA3-SNHG12組)，每組3個(gè)復(fù)孔，加入無(wú)雙抗培養(yǎng)基，每孔加入適量細(xì)胞，周?chē)蝗尤隤BS，放于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染：先換液，每孔加50 μL培養(yǎng)基；用25 μL培養(yǎng)基稀釋siRNA，輕輕地吸吹3～5次混勻；輕輕地顛倒轉(zhuǎn)染試劑，用25 μL培養(yǎng)基稀釋?zhuān)p輕地吸吹3～5次混勻，室溫靜置5 min；混合轉(zhuǎn)染試劑和siRNA稀釋液，輕輕地吸吹3～5次混勻，室溫靜置20 min；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加到96空板中，50 μL一孔，混勻；將細(xì)胞放在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換新的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h。提取細(xì)胞cDNA,進(jìn)行PCR檢測(cè)。si-RNA小分子干擾RNA濃度的篩選：將實(shí)驗(yàn)分成4組(濃度梯度為100 nm，50 nm，30 nm，10 nm)，每組3個(gè)復(fù)孔，步驟同上。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 用直尺均勻的在6孔板后劃線(xiàn)，每隔0.5～1 cm一道,每孔劃5條線(xiàn)，將HBx- EGFP-14-19細(xì)胞分成3組(HBx組、NC組、si-RNA1-SNHG12組)，每孔約5×105個(gè)細(xì)胞，次日，用槍頭垂直于橫線(xiàn)劃痕；PBS洗3次，洗去劃下的細(xì)胞后加無(wú)血清的培養(yǎng)基，拍照；放入5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)；24小時(shí)后取出，拍照。

1.2.8 CCK- 8實(shí)驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)分成4組[空白組、HBx組、空白對(duì)照(negative control,NC)組、si-RNA1-SNHG12組]，每組5個(gè)復(fù)孔，加入無(wú)雙抗培養(yǎng)基，每孔細(xì)胞數(shù)在2 000～5 000個(gè)，周?chē)蝗尤隤BS，放于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染后6 h更換新的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，48 h，72 h。測(cè)OD值：每孔加10 μL CCK- 8溶液然后在培養(yǎng)箱中放置1～4 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度(在450 nm處)。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù) 取6孔板長(zhǎng)滿(mǎn)后的細(xì)胞，先將飄起來(lái)的細(xì)胞收集到離心管中，再用0.25%的不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，時(shí)間不宜太長(zhǎng)。加入PBS緩沖液后離心(900 r/min，5 min)，棄上清，重復(fù)操作2次。最終將大約106個(gè)細(xì)胞重懸于500 μL PBS緩沖液中，裝在1.5 mL的EP管中即可用于凋亡檢測(cè)。

1.2.10 transwell實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移：將培養(yǎng)試劑和transwell chamber放于37 ℃；取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化后，用PBS、培養(yǎng)基(不含血清)依次洗一次，使細(xì)胞浮在培養(yǎng)基(無(wú)血清)上計(jì)數(shù)，讓細(xì)胞濃度大約為2×105/mL；在下室中加入700 μL含培養(yǎng)基(10%血清)，上室加150 μL的細(xì)胞；然后放入培養(yǎng)箱中24 h；第二天用鑷子拿出chamber，吸掉上室的液體，轉(zhuǎn)到提前裝有800 μL的甲醇孔里，室溫放置30 min；拿出chamber，吸掉上室的液體，轉(zhuǎn)到提前裝有800 μL的Giemsa染液孔里，室溫放置15～30 min；拿鑷子用清水輕輕地沖洗幾次，拿出chamber，吸掉上室的液體，然后用棉棒擦去上室的底部表面上的細(xì)胞；最后用鑷子取下膜，使它底面向上，晾干，拍照[11]。細(xì)胞侵襲：Matrigel在4 °C過(guò)夜;將放在4 °C預(yù)冷的培養(yǎng)基(無(wú)血清)稀釋至1 mg/mL，在冰上操作;然后在chamber上室加入100 μL稀釋后的Matrigel,放在37 °C使其干成膠狀;后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.11 HE染色 石蠟切片脫蠟至水化，經(jīng)過(guò)蘇木素(染細(xì)胞核)和伊紅(染細(xì)胞質(zhì))，然后脫水封片，最后顯微鏡觀察，分析切片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 小鼠肝前體細(xì)胞中HBx 的表達(dá)及鑒定

通過(guò)復(fù)蘇培養(yǎng)前期構(gòu)建的14-19，EGFP-14-19，HBx-EGFP-14-19細(xì)胞后，用RT-qPCR以及Western blot檢測(cè)均表明了HBx在HBx-EGFP-14-19細(xì)胞中成功表達(dá)，而14-19和EGFP-14-19細(xì)胞中則不表達(dá)(t=12.615，P<0.0001，圖1)，說(shuō)明了HBx 在肝前體細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)。

圖1 細(xì)胞中HBx 的鑒定注：1: 14-19細(xì)胞;2: EGFP-14-19細(xì)胞;3:HBx-EGFP-14-19細(xì)胞;a:P<0.000 1,與14-19細(xì)胞、EGFP-14-19細(xì)胞比較；A，細(xì)胞中HBx mRNA的表達(dá)量;B，細(xì)胞中HBx蛋白的表達(dá)。

2.2 小鼠肝臟組織中HBx 的表達(dá)及鑒定

RT-qPCR結(jié)果顯示與14-19、EGFP-14-19細(xì)胞比較，HBx在HBx-EGFP-14-19組中30 d、90 d、180 d、360 d均高表達(dá)，在14-19、EGFP-14-19中無(wú)差別( F=123.466，P<0.0001，圖2A) ；Western blot顯示與14-19及EGFP-14-19組相比，HBx在HBx-EGFP-14-19組中30 d、90 d、180 d、360 d均高表達(dá)，在14-19、EGFP-14-19 組不表達(dá)(圖2B) 。RT-qPCR和Western blot均證明構(gòu)建的HBx小鼠動(dòng)物模型成功。免疫組化法結(jié)果顯示，HBx-EGFP-14-19組小鼠30 d、90 d、180 d、360 d各組肝臟組織均見(jiàn)HBx的陽(yáng)性染色(圖2C)，RT-qPCR和Western blot以及免疫組化法均表明證明HBx在小鼠肝組織可長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，動(dòng)物模型構(gòu)建成功。

2.3 小鼠肝腫瘤鑒定

HBx-EGFP-14-19組小鼠術(shù)后360 d處死時(shí)發(fā)現(xiàn)，肝臟組織有腫瘤生成(圖3A)。HE染色結(jié)果見(jiàn)(圖3B)，圖中標(biāo)注1處細(xì)胞增大，且核仁偏大，核漿分布異常，核仁明顯；標(biāo)注2處細(xì)胞呈多核，肝組織結(jié)構(gòu)消失；標(biāo)注3處肝細(xì)胞排列異常，呈多行排列。結(jié)果表明小鼠肝臟組織整體呈現(xiàn)壞死狀態(tài)，癌病灶處呈纖維化。小鼠肝臟發(fā)生惡性腫瘤病變。

圖3 小鼠肝臟組織腫瘤(A)和H-E染色(B)鑒定

2.4 SNHG12在GSE93789芯片中高表達(dá)

通過(guò)芯片中5組肝癌組織(HC)和癌旁組織(HN)比較，均顯示在肝癌組織中SNHG12表達(dá)上調(diào)(圖4)。

圖4 SNHG12在肝癌組織中的表達(dá)

2.5 HBx致癌過(guò)程中SNHG12及其下游因子的動(dòng)態(tài)變化

RT-qPCR結(jié)果顯示與14-19、EGFP-14-19組比較，HBx-EGFP-14-19組中30 d、90 d、180 d、360 d，SNHG12及其下游靶基因Notch1、hes1在本小鼠模型中均上調(diào)(F=48.808，P< 0.000 1；F=13.322，P<0.000 1；圖5A，5B，5C)，Western blot結(jié)果也說(shuō)明了Notch1、hes1在本小鼠模型中上調(diào)(圖5D)，以及與之相關(guān)的促凋亡因子Bax下調(diào)，抗凋亡因子Bcl- 2上調(diào)，細(xì)胞周期因子CDK2和Cyclin E上調(diào)(圖5E)；Western blot結(jié)果也表明和14-19、EGFP-14-19組比較，在HBx-EGFP-14-19中，SNHG12下游靶基因Notch1、hes1均上調(diào)(圖5F)，以及與之相關(guān)的促凋亡因子Bax下調(diào)，抗凋亡因子Bcl- 2上調(diào)，細(xì)胞周期因子CDK2和Cyclin E上調(diào)(圖5G)。這表明HBx在致癌的過(guò)程中可以通過(guò)上調(diào)SNHG12及其靶基因Notch1的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期和凋亡異常，而這個(gè)過(guò)程可能是HBx在HCC過(guò)程中的重要原因之一。

2.6 SNHG12的si-RNA

通過(guò)qRT-PCR結(jié)果顯示，最終確定si-RNA-1濃度為50 nm用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究(F=418.448，P<0.000 1，圖6A，6B)，Western blot結(jié)果顯示加入濃度為50 nm的si-RNA-1后SNHG12及其下游Notch1，Hes1等的表達(dá)被逆轉(zhuǎn)(圖6C，6D)。

圖6 加入SNHG12的si-RNA后SNHG12及其下游因子變化情況注：A:1:HBx組;2:NC組;3～5:分別為SNHG12-si-RNA-1、SNHG12-si-RNA- 2、SNHG12-si-RNA- 3組;a:P<0.000 1,與HBx組、NC組比較；B:1～4分別為:100 nm，50 nm，30 nm，10 nm；Ⅰ:1HBx-EGFP-14-19細(xì)胞組;Ⅱ: HBx-EGFP-14-19-NC細(xì)胞組;Ⅲ:HBx-EGFP-14-19-SNHG12-si-RNA細(xì)胞組；A、B:RT-qPCR檢測(cè)最佳SNHG12的si-RNA;C、D:Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Notch1、Hes1、CyclinE、CDK2、Bcl- 2、Bax的蛋白表達(dá)。

2.7 SNHG12的si-RNA對(duì)HBx-EGFP-14-19細(xì)胞表型的影響

通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與HBx-EGFP-14-19和NC組相比，si-RNA組遷移能力和侵襲能力明顯降低(7A，7B，7C)表明SNHG12的小分子干擾RNA可以抑制HBx-EGFP-14-19細(xì)胞的遷移侵襲能力；CCK- 8實(shí)驗(yàn)表明，與HBx-EGFP-14-19和NC組相比，si-RNA組的增殖能力明顯降低(7D),表明SNHG12的小分子干擾RNA可以抑制HBx-EGFP-14-19細(xì)胞的增殖能力; 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)表明，與HBx-EGFP-14-19和NC組相比，si-RNA組凋亡能力提高(7E)，表明SNHG12的小分子干擾RNA可以促進(jìn)HBx-EGFP-14-19細(xì)胞的凋亡。

圖7 SNHG12的si-RNA對(duì)HBx-EGFP-14-19細(xì)胞表型的影響注：A，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各細(xì)胞的遷移；B、C，transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各細(xì)胞的遷移侵襲；D，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各細(xì)胞的增殖；E，流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各細(xì)胞的凋亡

3 討 論

長(zhǎng)期以來(lái)，HBV的慢性感染一直被認(rèn)為是HCC發(fā)生和發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，導(dǎo)致全球超過(guò)一半的HCC病例[12-13]。HBx作為HBV病毒的核心蛋白HBx蛋白，它在HBV誘發(fā)成HCC過(guò)程中的作用主要包括：激活原癌基因、抑制抑癌基因、異常活化蛋白激酶、調(diào)控非編碼RNA(如：影響DNA甲基化、細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化以及遷移等)、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、發(fā)揮免疫抑制作用等[14-15]。目前傳統(tǒng)的診斷程序的局限性需要確定新的方法來(lái)改善對(duì)癌癥患者的診斷方法。

因?yàn)榘┘?xì)胞和干細(xì)胞都可以進(jìn)行自我更新和分化等特征，因此本研究選擇了課題組前期構(gòu)建好的肝前體細(xì)胞，在構(gòu)建動(dòng)物模型中，與裸鼠或轉(zhuǎn)基因小鼠等模型相比，構(gòu)建的昆明小鼠模型在自然條件下模擬了HBx感染的一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，能夠更好地研究HBx在體內(nèi)的作用[16]。而lncRNAs已成為穩(wěn)定的生物標(biāo)記物，在肝癌中大量表達(dá)。重要的是，這些標(biāo)記可以在腫瘤發(fā)育的所有階段都被檢測(cè)到，因此可能提供潛在的生物標(biāo)記和治療靶點(diǎn)。

在GSE93789芯片中我們發(fā)現(xiàn)LncRNA SNHG12在肝癌組織比癌旁組織顯著上調(diào)，而SNHG12與許多癌癥有關(guān)，如乳腺癌、胃癌、骨肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肝癌等。SNHG12表達(dá)的改變與腫瘤細(xì)胞的生存能力、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲性相關(guān)，影響癌癥患者的預(yù)后和生存率[5]。有研究表明，抑制SNHG12可以下調(diào)Notch1從而對(duì)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響[10]。課題組前期結(jié)果說(shuō)明，Notch信號(hào)通路在小鼠體內(nèi)被HBx持續(xù)激活，導(dǎo)致細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡異常，從而引起HCC的發(fā)生發(fā)展[17]。而在我們前期構(gòu)建好的HBx小鼠模型中與正常組和EGFP-14-19組相比SNHG12在30 d、90 d、180 d、360 d均高表達(dá)，說(shuō)明SNHG12在HBx成瘤過(guò)程中可能有著密切的聯(lián)系。

為了進(jìn)一步研究SNHG12在HBx成癌過(guò)程中的作用機(jī)制，我們用課題組前期構(gòu)建成功的HBx-EGFP-14-19細(xì)胞，加入SNHG12的小分子干擾RNA，通過(guò)檢測(cè)其表型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入SNHG12的si-RNA后，細(xì)胞遷移、侵襲、細(xì)胞的增殖明顯被抑制，且促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入小分子干擾RNA后Notch1、hes1等明顯被抑制。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明在HBx致癌過(guò)程中，抑制SNHG12的表達(dá)，可以抑制Notch1信號(hào)通路，抑制細(xì)胞遷移、侵襲和細(xì)胞增殖，以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

總之，在本實(shí)驗(yàn)的昆明小鼠模型中，以最自然的狀態(tài)模擬了HBx感染的動(dòng)態(tài)過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中HBx可以通過(guò)上調(diào)SNHG12，從而促使Notch1上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期和凋亡異常，使其表型異常，因此在HBx誘導(dǎo)肝癌發(fā)生過(guò)程中SNHG12起著重要的作用。此外，長(zhǎng)鏈非編碼不僅可以通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路，還可以通過(guò)作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA在肝癌中起作用[18]。據(jù)報(bào)道，SNHG12也可以通過(guò)作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA在肝癌起作用。例如，SNHG12通過(guò)靶向miR-199a/b- 5p調(diào)節(jié)MLK3的表達(dá)并影響NF-κB通路，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[19]；SNHG12也可通過(guò)miR- 516a- 5p靶向HEG1促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[20]。然而SNHG12在HCC過(guò)程中具體的作用機(jī)制本實(shí)驗(yàn)只在體外細(xì)胞進(jìn)行了機(jī)制研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)機(jī)制還有待后續(xù)進(jìn)一步研究，但課題組前期在該動(dòng)物模型給與Notch的抑制劑時(shí)，其細(xì)胞周期、凋亡的相關(guān)因子表達(dá)均能夠逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明它在HCC過(guò)程中扮演者不可或缺的角色，可能成為一個(gè)有價(jià)值的生物標(biāo)志物以及潛在的治療靶點(diǎn)。為了確定新的lncRNAs作為HCC的生物標(biāo)志物，并闡明lncRNAs在HCC中如何工作的分子機(jī)制，未來(lái)的研究可能需要關(guān)注實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，例如新的測(cè)序技術(shù)，以及l(fā)ncRNA生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的發(fā)展[21]。