一起牦牛腹瀉病的PCR病原學診斷

白瑪澤仁，秦瀘康，羅思富，肖晨冬

(四川省甘孜藏族自治州得榮縣農牧局，四川 得榮 627950)

0 引言

近年來，犢牛腹瀉的發(fā)病率呈上升趨勢，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[1]。犢牛腹瀉是犢牛常發(fā)的一種胃腸疾病，其臨床特征為：病犢牛常出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振甚至廢絕、體溫上升、呼吸短促、脫水及腹瀉等癥狀。臨床上引發(fā)犢牛腹瀉的病因復雜多樣，包括非感染性和感染性的因素。非感染性主要有飼喂不當、護理不當或飼養(yǎng)環(huán)境惡劣等飼養(yǎng)管理方面的因素；感染性主要有寄生蟲、細菌和病毒等的感染因素。病毒性感染是造成犢牛腹瀉最主要的病因之一，牛輪狀病毒(BRV)、牛冠狀病毒(BCoV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是臨床上最常見的導致犢牛腹瀉的病毒[2]；產腸毒素大腸桿菌(ETEC)、沙門氏菌(Salmonella)和安氏隱孢子蟲(C.andersoni)是常見的導致犢牛腹瀉的細菌病和寄生蟲病[3]，它們的流行病學、臨床癥狀和病理變化均很相似，僅憑臨床診斷無法鑒別，而且這幾種病毒混合感染的情況也很常見[4]，需要進行實驗室檢測才能確診[5]。

2021年11月甘孜藏族自治州理塘縣某牧民家發(fā)生了犢牦牛腹瀉病情，采用PCR方法對采集的11份犢牦牛腹瀉樣本進行了BRV、BCoV、BVDV、ETEC、Salmonella和C.andersoni檢測，來查明引起該病的病因，結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

腹瀉糞便棉拭子11份，2021年11月份采自理塘縣某牧民家1～3月齡的犢牦牛，低溫運輸至實驗室于-80℃冰箱保存。該牧民家共有犢牦牛28頭，患病犢牦牛11頭，主要出現(xiàn)精神萎靡、呼吸急促、體溫升高、食欲廢絕和腹瀉等癥狀，糞便呈灰綠色水樣。

1.2 主要試劑及儀器

TrizolTMReagent、Premix taq、PrimescriptTM反轉錄試劑盒、核酸染料-GelView等均購于寶生物工程(大連)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(VersaDov2000)、電泳儀(JY300C/ERS300)、恒溫水浴鍋(DZKW-D-2)購于上?？粕齼x器有限公司(中國上海)；高速冷凍離心機(TGL-16)購于蜀科儀器有限公司(中國四川)；PCR儀(TC-96/G/H〔b〕c)購于博日科技有限公司(中國杭州)。

1.3 參考毒株

牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、安氏隱孢子蟲、沙門氏菌、產腸毒素大腸桿菌的陽性樣本均為西南民族大學動物醫(yī)學實驗室保存。

1.4 引物的設計與合成

參照相關文獻中有關BRV、BCoV、BVDV、ETEC、Salmonella和C.andersoni的檢測方法合成引物，表1中為引物信息，所有引物的合成均由生工生物工程有限公司完成。

1.5 樣本處理及核酸提取

將 11 份腹瀉糞便棉拭子與適量的PBS渦旋混勻，反復凍融 3 次，置于 4℃離心機中10 000 r/min離心10 min，取上清，按照 Trizol 試劑盒(RNAiso Plus)說明書進行 RNA提取，將其保存于-80℃?zhèn)溆?。采?0 μl體系：5×buffer 4μL，Random primer 2μL，Prime Script RNase 1μl，ddH2O 9μl，RNA 4μl；反轉錄條件為：37 ℃，15 min；85℃，15 s；16℃，1 min，合成cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR檢測BRV

采用1.5合成的3對引物對11份犢牦牛腹瀉樣本的cDNA模板進行PCR擴增，均采用25μL的反應體系如下：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA 2.0μL，ddH2O 7.5 μL。PCR擴增條件為:94℃，5 min；94℃，30 s；53℃，30 s；72℃，30 s；72℃，5 min。取擴增產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠核酸電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)成像。將陽性PCR產物送至生物工程(上海)股份有限公司測序。

2 結果

2.1 被檢樣本的RT-PCR檢測結果

電泳結果顯示：通過實驗對11份犢牦牛腹瀉糞便棉拭子樣本中BRV、BCoV、BVDV、ETEC、Salmonella和C.andersoni的PCR檢測，結果見圖 1。圖1中有8份樣本擴增得到BRV 特異性條帶，片段大小約為 231 bp，其他引物均未檢出。

注：M—DL2000 Marker;N—陰性對照；P—陽性對照；1～11—被檢樣本BRV擴增產物。

2.2 陽性檢出率及感染情況

通過RT-PCR方法檢測，發(fā)病犢牦牛11份腹瀉樣本里，牛輪狀病毒的陽性檢出率是72.7%(8/11)，BCoV、BVDV、ETEC、Salmonella和C.andersoni均未檢出。結合臨床癥狀及流行情況，確診該牧民家犢牦牛腹瀉主要由牛輪狀病毒(BRV)感染引起的。

3 討論

試驗檢測結果中的犢牦牛腹瀉樣本只檢出了BRV，檢出率高達72.7%，BCoV、BVDV、ETEC、Salmonella和C.andersoni均未檢出，再與臨床癥狀進行結合分析后，可確診該牧民家犢牦牛出現(xiàn)腹瀉主要是由BRV導致的，為該牧民家牦牛腹瀉的防治提供了科學依據(jù)。

研究顯示，牛輪狀病毒在我國十分流行，何美琳等[6]為調查川西北牦牛腹瀉病的流行情況，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對來源于川西北阿壩藏族羌族自治州8個縣的1 070份牦牛血清中進行了BVDV、BCoV、BRV的抗體檢測，其中BRV抗體陽性率達到94.4%；周芳等[7]對四川阿壩藏族羌族自治州14個牧場的88份犢牦牛腹瀉樣本用特異的PCR方法進行了BRV的檢測，結果顯示BRV核酸陽性檢出率為98.86%；李凡等[8]用PCR方法對30份牛腹瀉樣本和30份牦牛腹瀉樣本進行BRV的檢測，其中對牛的BRV檢出率為33.33%，對牦牛的BRV檢出率為73.33%；何宗偉等[9]對稻城縣牦牛主要養(yǎng)殖區(qū)域的5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集了46份牦牛糞便樣本，用RT-PCR方法進行病原檢測。結果顯示46份糞便樣本中BRV檢出的陽性樣本數(shù)為16份，BRV的陽性檢出率為34.78%，表明稻城縣牦牛BRV感染情況較為普遍。

4 結語

BRV是引起犢牛腹瀉的最重要的病原，可感染各個年齡段的牛，且多發(fā)于1月齡以內的犢牛，在全世界尤其是發(fā)展中國家犢牛中存在嚴重的發(fā)病率及死亡率，給牧民養(yǎng)牛業(yè)和畜牧業(yè)發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟損失。此外，BRV常常成為誘發(fā)、并發(fā)或繼發(fā)其他一些腹瀉性疾病的病因，在臨床上出現(xiàn)混合感染情況很嚴重[10]，對人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展都有較大危害，具有重要的公共衛(wèi)生學意義[11]。因此，加強牛輪狀病毒病的防治至關重要。