HLA-E基因表達(dá)沉默對人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

吳振村，周 艷

(1.張家口市婦幼保健院，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

乳腺癌(breast cancer，BC)是女性最常見的惡性腫瘤之一，盡管早期診斷和治療方法的進(jìn)步使乳腺癌死亡率下降了38%[1]，但腫瘤的異質(zhì)性、治療中的耐藥性、腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，對乳腺癌的治療提出了新的挑戰(zhàn)[2]，為此臨床和科研工作者也在不斷嘗試新的治療方法。對乳腺癌分子基礎(chǔ)的研究發(fā)現(xiàn)，癌基因和抑癌基因等多種基因參與了乳腺癌發(fā)生發(fā)展，基因治療成為乳腺癌治療的一個策略[3]。目前采用RNA 干擾技術(shù)靶向沉默特定基因在乳腺癌治療研究中取得了較好的效果。郭智慧[4]和管海濤[5]等采用小分子RNA 干擾(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)分別沉默乳腺癌細(xì)胞DEK和survivin基因，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)人類白細(xì)胞抗原-E(human leukocyte antigen-E，HLA-E)基因多態(tài)性可能與乳腺癌遺傳易患性相關(guān)[6-7]；Szekely等[8]分析了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌樣本中免疫相關(guān)基因水平，發(fā)現(xiàn)HLA-E基因在乳腺癌轉(zhuǎn)移灶表達(dá)水平較高，是潛在的治療靶點(diǎn)。本研究擬采用小分子RNA技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞HLA-E基因表達(dá)，探討其對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，為乳腺癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑Vigofect 轉(zhuǎn)染試劑購自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司；DMEM 干粉購自Gibco 公司；SuperRT cDNA Synthesis Kit 和UltraSYBR Mixture(Low ROX)均購自北京康為世紀(jì)生物有限公司；鼠抗人HLA-E 單克隆抗體(ab11821)購自Abcam 公司；CCK-8 試劑盒和ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天公司；Transwell侵襲小室購自美國Corning公司；

1.1.2 儀器化學(xué)發(fā)光成像儀購自北京原平皓生物公司；生物安全柜購自美國Thermo公司；熒光定量PCR儀購自美國伯樂公司；瓊脂糖水平電泳儀購自北京六一公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Napco公司。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 由本室保存，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和傳代。

1.2 方 法

1.2.1 siRNA 的設(shè)計(jì)從NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲取人HLA-E mRNA 序列(GenBank 登錄號：X56841.1)，利用siRNA在線設(shè)計(jì)軟件DSIR(http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html)及RNA 二級結(jié)構(gòu)分析軟件RNAdraw 設(shè)計(jì)并篩選出與HLA-E mRNA 容易結(jié)合的siRNA序列，作為HLA-E siRNA，采用隨機(jī)打亂的方法設(shè)計(jì)陰性對照siRNA序列。

1.2.2 轉(zhuǎn)染siRNA至乳腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白對照組(不加任何試劑)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)、 脂 質(zhì) 體 組 (只 加 2 μL 轉(zhuǎn)染 試 劑 Vigofect)、HLA-E siRNA組(轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA)。取對數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個/mL，接種于6孔板，培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度為70%~80%。取HLA-E siRNA序列及陰性對照siRNA分別經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑Vigofect 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，方法如下：5 μg siRNA 序 列 加 入 100 μL 生 理 鹽 水 混 勻 ， 2 μL Vigofect 轉(zhuǎn)染試劑加入100 μL 生理鹽水混勻，將siRNA 溶液逐滴加入轉(zhuǎn)染試劑溶液，輕輕混勻，室溫孵育15 min后逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR 檢測HLA-E mRNA 表達(dá)水平收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，TRIzol裂解法提取細(xì)胞總RNA，Eppendorf 核酸定量儀檢測RNA 濃度和純度，并行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 的完整性。取1 μg 總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR， qPCR)檢 測 HLA-E mRNA 表達(dá)。HLA-E上游引物 5′-CACGTGCCATGTG CAGCA-3′，下游引物 5′-CACAGCTCCAGAGACCA-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物 5′-TCAACGACCACTTTGT CAAGCTCA-3′ ， 下 游 引 物 5′- GCTGGTGGTCCAG GGGTCTTACT-3′。反應(yīng)過程為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 、15 s，60 ℃、1 min 進(jìn)行 40 個循環(huán)，收集熒光數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCT法分析HLA-E mRNA 的相對表達(dá)水平。

1.2.4 Western blot 法檢測HLA-E 蛋白表達(dá)水平收集轉(zhuǎn)染48 h 的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，按每孔80 μg上樣量進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，將電泳分離后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，HLA-E單抗(1∶2 000 稀釋) 4 ℃孵育過夜，PBS-T 洗滌后，加入HRP-羊抗鼠二抗(1∶5 000 稀釋)室溫孵育2 h，PBS-T洗滌后，加入ECL底物顯色。

1.2.5 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖抑制率轉(zhuǎn)染48 h 的各組細(xì)胞中加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值D(450)，按下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，細(xì)胞懸液加入Annexin V-FITC/PI(碘化丙啶)染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力收集轉(zhuǎn)染48 h 的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，取150 μL 加入預(yù)先用Matrigel 包被基底膜的Transwell小室的上室中，24孔板下室內(nèi)加入含血清的完全培養(yǎng)基500 μL，培養(yǎng)24 h后，取出小室，PBS洗滌兩次，用棉簽小心擦去微孔膜內(nèi)層細(xì)胞，95%乙醇固定5 min，4 g/L 結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個視野，觀察各組細(xì)胞侵襲能力。細(xì)胞遷移能力檢測步驟與上述相同，只是小室的上室中不需要Matrigel包被基底膜。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組之間比較采用LSD法。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 HLA-E siRNA的設(shè)計(jì)

利用siRNA 在線設(shè)計(jì)軟件DSIR 及RNA 二級結(jié)構(gòu)分析軟件RNAdraw，篩選出3 條HLA-E siRNA 序列(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)，如表 1 所示。將這些序列與陰性對照siRNA序列送上海生工生物合成。

表1 靶向HLA-E基因的siRNA序列

2.2 轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA 可抑制細(xì)胞中HLA-E mRNA表達(dá)

提取的細(xì)胞總RNA 行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1 所示，電泳圖每條泳道有3 條清晰條帶，分別是28 S、18 S 和5 S，說明提取的總RNA 完整性好。qPCR 檢測各組乳腺癌細(xì)胞HLA-E mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2 所示，轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3組細(xì)胞HLA-E mRNA水平顯著低于空白對照組、陰性對照組及脂質(zhì)體組(均為P<0.01)其中siRNA-2 組HLA-E mRNA 水平最低，空白對照組、陰性對照組及脂質(zhì)體組HLA-E mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明，課題組設(shè)計(jì)的HLA-E siRNA 轉(zhuǎn)染可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞HLA-E mRNA 表達(dá)。本研究選取siRNA-2 為有效的siRNA 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，記為HLA-E siRNA。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的細(xì)胞總RNA完整性

圖2 qPCR檢測乳腺癌細(xì)胞HLA-E mRNA表達(dá)水平

2.3 轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA 可抑制細(xì)胞中HLA-E 蛋白表達(dá)

Western blot 檢測結(jié)果見圖3，可見轉(zhuǎn)染48 h 后，HLA-E siRNA 組細(xì)胞未檢測到HLA-E 蛋白表達(dá)，空白對照組、陰性對照組及脂質(zhì)體組均有HLA-E蛋白表達(dá)。這表明，轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA 可抑制乳腺癌細(xì)胞HLA-E蛋白表達(dá)。

圖3 Western blot檢測乳腺癌細(xì)胞HLA-E蛋白的表達(dá)

2.4 轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞生長

CCK-8 法檢測各組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果見圖4，陰性對照組和脂質(zhì)體組細(xì)胞增殖抑制率分別為(5.89±0.62)%和(8.18±0.83)%，HLA-E siRNA 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖抑制率為(49.83±6.65)%，顯著高于陰性對照組和脂質(zhì)體組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此可見，轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。

圖4 CCK-8法檢測乳腺癌細(xì)胞生長的抑制作用

2.5 轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組乳腺癌細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖5 所示，空白對照組細(xì)胞凋亡率為(2.14±0.98)%，陰性對照組細(xì)胞凋亡率為(2.76±0.68)%，脂質(zhì)體組細(xì)胞凋亡率為(3.21±1.05)%，HLA-E siRNA 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為(12.63±1.50)%，顯著高于空白對照組和脂質(zhì)體組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此可見，轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA可顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞的凋亡率

2.6 轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA可抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移能力

HLA-E siRNA 轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231 細(xì)胞 48 h 后，Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果如圖6 所示，HLA-E siRNA 轉(zhuǎn)染組穿過Matrigel 包被的微孔膜的細(xì)胞數(shù)目是(31.1±2.2)個，顯著少于空白對照組(52.3±2.0)個、陰性對照組(49.2±1.5)個和脂質(zhì)體組(48.4±3.1)個，且后面3組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲能力。

圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測HLA-E siRNA轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力

Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力結(jié)果如圖7 所示，HLA-E siRNA 轉(zhuǎn)染組穿過Matrigel 未包被的微孔膜的細(xì)胞數(shù)目是(29.2±3.1)個，顯著少于空白對照組(48.3±2.1)個、陰性對照組(46.3±1.4)個和脂質(zhì)體組(47.2±2.3)個，且后面3組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA 可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移能力。

圖7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測HLA-E siRNA轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力

3 討論

HLA-E由主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)編碼，屬于非經(jīng)典的HLA-I類基因(HLA-Ib)[9]。其具有多態(tài)性有限[10]、組織分布廣泛、正常細(xì)胞表面低表達(dá)等特點(diǎn)，但在腫瘤、骨髓移植、自身免疫性疾病等病理?xiàng)l件下，常檢測到HLA-E 的異常表達(dá)[7]。HLA-E 在乳腺癌組織表達(dá)的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[11]，約27%乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織高表達(dá)HLA-E，且約21%高異型性核病變中高表達(dá)HLA-E。De Kruijf等[12]也發(fā)現(xiàn)，瘤組織HLA-E高表達(dá)會導(dǎo)致乳腺癌無復(fù)發(fā)期惡化，乳腺癌可通過上調(diào)或下調(diào)經(jīng)典HLA-Ia 類基因和非經(jīng)典HLA-Ib 類基因逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用。提示HLA-E可能是預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的重要因素。相似的是，我們前期研究分析HLA-E基因多態(tài)性及血漿可溶性HLA-E水平與乳腺癌相關(guān)性，也發(fā)現(xiàn)HLA-E可能是乳腺癌的易感基因[6-7]。Yazdi等[13]分析了197例非小細(xì)胞肺癌組織CD8+T細(xì)胞浸潤與HLA-E 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HLA-E 可能是非小細(xì)胞肺癌患者總生存率的獨(dú)立負(fù)性預(yù)后因素，研究認(rèn)為HLA-E高表達(dá)阻礙了CD8+T細(xì)胞的作用，可作為預(yù)測免疫治療反應(yīng)的標(biāo)志物。Hiraoka 等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，HLA-E高表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌患者生存期較短呈顯著相關(guān)。Huang[15]和Ozgul[16]等也發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌(瘤)組織HLA-E高表達(dá)可能是腫瘤免疫逃逸的一種機(jī)制，是結(jié)直腸癌(瘤)免疫治療的靶點(diǎn)。

因此，我們采用siRNA 技術(shù)，靶向乳腺癌細(xì)胞HLA-E基因。首次探討抑制HLA-E基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響，以期為乳腺癌免疫治療提供新靶點(diǎn)。siRNA 是由外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞而引起的與dsRNA 同源的mRNA 降解，進(jìn)而高效、特異地阻斷體內(nèi)相應(yīng)的基因表達(dá)[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，利用siRNA 技術(shù)分別沉默人乳腺癌細(xì)胞SKBR3 的HER2基因和乳腺癌細(xì)胞ZR75-l 的uPAR基因均可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡；siRNA 技術(shù)靶向沉默趨化因子受體CXCR4基因可明顯降低乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的侵襲性[19-20]；利用siRNA 技術(shù)沉默多藥耐藥基因，還可明顯提高人乳腺癌細(xì)胞MCF-7耐藥株對化療藥物長春新堿、阿霉素及紫杉醇的敏感性[21]。我們研究也發(fā)現(xiàn)，HLA-E siRNA 轉(zhuǎn)染至人乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-231 后可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞HLA-E 表達(dá)，且可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。因此，采用siRNA技術(shù)靶向抑制HLA-E表達(dá)可能是潛在的乳腺癌基因治療的又一新方法。

我們研究的不足之處是未能分析siRNA 技術(shù)抑制HLA-E 表達(dá)及抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移的機(jī)制。Li 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，siRNA 技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞HER2和uPAR表達(dá)引起了MAPK信號通路的抑制，導(dǎo)致ERK活性降低及p38/ERK活性比值升高從而抑制了癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。因此我們后續(xù)研究需將抑制HLA-E表達(dá)進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的機(jī)制是否影響信號通路分子MAPK等作為重點(diǎn)。