褐煤與水稻秸稈共降解增產(chǎn)甲烷機理研究*

程佳琪 郭紅光 張子中

(1.太原理工大學(xué)安全與應(yīng)急管理工程學(xué)院，030024 太原；2.太原理工大學(xué)原位改性采礦教育部重點實驗室，030024 太原)

0 引 言

煤層氣的開采不僅可以增加能源供應(yīng)量，還可以減少溫室氣體排放量[1]。我國煤層氣儲量大，但是大多數(shù)煤層氣井單井產(chǎn)量低且不產(chǎn)氣時間長，導(dǎo)致煤層氣產(chǎn)率低下[2]，限制煤層氣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。煤層氣生物工程能夠利用厭氧微生物降解煤產(chǎn)甲烷的特性來實現(xiàn)生物甲烷產(chǎn)量的增加[3]，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。然而，直接以煤為底物進(jìn)行厭氧生物降解的甲烷產(chǎn)量較低[4]。為此，國內(nèi)外學(xué)者提出了一系列方法以增強煤的厭氧生物降解效率，提高甲烷產(chǎn)量。其中，煤與秸稈共降解增產(chǎn)甲烷效果顯著。YOON et al[5]發(fā)現(xiàn)，添加水稻秸稈可以促進(jìn)褐煤產(chǎn)甲烷。李亞平等[6]研究證實，與煤和水稻秸稈單獨降解相比，水稻秸稈與不同煤階煤共降解甲烷產(chǎn)量均有提高，且共降解甲烷產(chǎn)量遠(yuǎn)高于煤和秸稈單獨降解甲烷產(chǎn)量之和。GUO et al[7-9]的研究結(jié)果顯示，添加玉米秸稈可以促進(jìn)共降解體系中優(yōu)勢微生物群落互補和代謝相關(guān)酶的表達(dá)，從而顯著提高生物甲烷產(chǎn)量。此外，水稻秸稈的部位和粒徑都影響其對無煙煤生物甲烷的增產(chǎn)效果[10]。煤與秸稈共降解不僅顯著提高生物甲烷產(chǎn)量、增產(chǎn)煤層氣，而且能夠?qū)崿F(xiàn)秸稈的資源化利用。我國農(nóng)作物秸稈可收集利用量巨大[11]，廉價且易獲得，有助于共降解增產(chǎn)煤層氣的實施。同時，我國褐煤資源儲量豐富，利用厭氧微生物幫助其生產(chǎn)生物甲烷也有利于褐煤資源的高效清潔利用[12]。

為進(jìn)一步明晰煤與秸稈共降解增產(chǎn)甲烷機制，選取生物更易利用的褐煤和水稻秸稈為研究對象，研究了共降解作用后微生物群落結(jié)構(gòu)、有機物組成、煤與秸稈結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，并將共降解與單獨降解進(jìn)行對比，明確共降解增產(chǎn)甲烷的獨特作用，為進(jìn)一步提高甲烷產(chǎn)量、促進(jìn)煤層氣生物工程應(yīng)用提供參考，助力煤層氣產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

實驗用褐煤取自內(nèi)蒙古呼倫貝爾，使用前用粉碎機將其粉碎，篩分后選取粒徑范圍為0.125 mm～0.150 mm的樣品，并在干燥箱中105 ℃下干燥6 h，然后裝入自封袋中保存。煤樣的工業(yè)分析和元素分析分別按照GB/T 212-2008和GB/T 31391-2015中的方法進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示。實驗用水稻秸稈來自江蘇省沭陽縣，手工挑選出莖桿部分，將其剪切為5 mm，在55 ℃下干燥6 h，裝入自封袋密封保存。實驗用菌群富集自沁水盆地南部煤層氣井采出水，以褐煤為唯一碳源進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定產(chǎn)甲烷微生物菌群。

表1 褐煤的工業(yè)分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analyses of lignite

1.2 褐煤與水稻秸稈共降解產(chǎn)甲烷實驗

實驗所用培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、半胱氨酸-硫化鈉溶液、維生素溶液和微量元素溶液[6]。1 g煤和0.3 g的水稻秸稈以及菌群接種物、培養(yǎng)基、滅菌水共同構(gòu)成30 mL的反應(yīng)體系，將其放于140 mL的厭氧瓶反應(yīng)器中進(jìn)行共降解，然后將厭氧瓶放置于35 ℃恒溫箱中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。分別以1 g煤和0.3 g秸稈單獨降解作為對照組。每組實驗均設(shè)置三組平行實驗。利用上海海欣公司生產(chǎn)的氣相色譜儀(GC-950)每隔7 d定期檢測各組厭氧瓶中甲烷生成情況，最后取三組平行實驗的均值作為實驗甲烷產(chǎn)量，并使用標(biāo)準(zhǔn)差繪制誤差線。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基、半胱氨酸-硫化鈉溶液、維生素溶液和微量元素溶液中各物質(zhì)的密度如下。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：11.00 g/L NaCl，3.450 g/L MgSO4·7H2O，2.750 g/L MgCl2·2H2O，0.335 g/L KCl，0.250 g/L NH4Cl，0.140 g/L CaCl2·2H2O，0.140 g/L K2HPO4，1.00 g/L酵母提取物。半胱氨酸-硫化鈉溶液：25.00 g/L半胱氨酸，25.00 g/L Na2S。維生素溶液：0.50 mg/L維生素B1，0.50 mg/L維生素B2，0.50 mg/L維生素B3，1.00 mg/L維生素B6，0.20 mg/L維生素B7，0.01 mg/L維生素B12，0.50 mg/L硫辛酸，0.20 mg/L喋酰谷氨酸，0.50 mg/L4-氨基苯甲酸。微量元素溶液：19.00 mg/L CoCl2·6H2O，10.00 mg/L MnCl2·4H2O，7.00 mg/L ZnCl2，3.60 mg/L硼酸，2.40 mg/L NiCl2·6H2O，1.00 mg/L KAl(SO4)2，0.60 mg/L鉬酸鈉，0.20 mg/L CuCl2，0.15 mg/L FeCl2·4H2O，體積分?jǐn)?shù)為25% HCl溶液10.00 mL。

1.3 高通量測序

產(chǎn)甲烷結(jié)束后，培養(yǎng)液用0.22 μm濾膜(美國Millipore公司生產(chǎn))過濾。采用UltraClean○RSoil DNA Isolation Kit(美國Mobio公司生產(chǎn))提取濾膜上的微生物DNA。采用細(xì)菌特異性引物515F-907R[13]和古菌特異性引物519F-915R[14]對提取DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(美國Axygen公司生產(chǎn))純化PCR產(chǎn)物。將提取的DNA在高通量測序儀Illumina Miseq(美國Illumina公司生產(chǎn))平臺進(jìn)行測序。測序完成后，過濾掉低質(zhì)量序列，然后在97%的相似性水平下，對剩余序列進(jìn)行操作分類單元(OTUs)聚類。最后從每一個OTU中選擇一條代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到該OTU 的分類信息。

1.4 GC-MS檢測

實驗結(jié)束后，取20 mL培養(yǎng)液過濾，得到的濾液分別在中性、酸性、堿性的環(huán)境下用CH2Cl2萃取三次，所有萃取液混合后加入過量無水硫酸鈉密封于4 ℃條件下靜置12 h。靜置后的液體經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、氮吹，濃縮至2 mL，通過氣Agilent 7890B/5977B相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司生產(chǎn))對液體中有機物成分進(jìn)行測定。載氣為體積分?jǐn)?shù)為99.999%的氦氣，流速為30 mL/min。升溫程序為：初始溫度60 ℃條件下保持3 min，溫度先以20 ℃/min的升溫速率升至150 ℃，然后再以5 ℃/min的升溫速率升高至230 ℃，保持5 min。根據(jù)美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院數(shù)據(jù)庫(NIST 14L)對檢測到的化合物進(jìn)行鑒定比對。

1.5 XRD測定

采用SmartLab型X射線衍射儀(日本理學(xué)公司生產(chǎn))對原秸稈、單獨降解后秸稈和共降解后秸稈的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定。在工作電壓為45 kV和工作電流為100 mA下，采集銅和鉀輻射的秸稈樣品的XRD數(shù)據(jù)，掃描范圍為5°～90°，掃描步距為0.05°，掃描速率為6 °/min。通過XRD譜分析秸稈降解產(chǎn)生物甲烷前后其纖維素結(jié)晶度的變化。秸稈樣品的結(jié)晶度指數(shù)(CrI)計算如公式(1)所示[15]。

CrI=[(I002-Iamorphous)/I002]×100%

(1)

式中：CrI為結(jié)晶度指數(shù)，%；I002為002晶格面的最大衍射強度；Iamorphous為2θ=18°時背景峰的強度。

1.6 13C-NMR測定

采用AVANCE Ⅲ HD 400 MHz型核磁共振波譜儀(德國Bruker公司生產(chǎn))對原煤、單獨降解后煤和共降解后煤進(jìn)行檢測。配備H/X雙共振固體探頭，4 mm ZrO2轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速為10 kHz。共振頻率為100.625 MHz，采樣時間為6.25 μs，譜寬為30 kHz，循環(huán)延遲時間為15 μs，掃描次數(shù)為1 024次。采用MestReNova軟件對煤的13C-NMR譜中各官能團(tuán)的化學(xué)位移區(qū)間進(jìn)行積分。

2 結(jié)果與討論

2.1 褐煤與水稻秸稈共降解產(chǎn)甲烷效果分析

褐煤與水稻秸稈共降解、褐煤單獨降解、水稻秸稈單獨降解的甲烷產(chǎn)量如圖1所示。由圖1可知，水稻秸稈單獨降解的甲烷產(chǎn)量最少，最大產(chǎn)量僅為17.3 μmol。褐煤單獨降解前7天甲烷產(chǎn)量快速增長，在第14天甲烷產(chǎn)量達(dá)到最大，為162.11 μmol。煤與水稻秸桿共降解的甲烷產(chǎn)量在第21天達(dá)到最大，為388.47 μmol，比褐煤單獨降解的甲烷產(chǎn)量增長了139.63%，比褐煤單獨降解的甲烷產(chǎn)量和秸稈單獨降解的甲烷產(chǎn)量之和增長了116.53%。由于纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，在其周圍充填著半纖維素和木質(zhì)素，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不利于其降解產(chǎn)生甲烷[16]。因此，秸稈單獨降解的甲烷產(chǎn)量極低。褐煤與水稻秸桿共降解的甲烷產(chǎn)量比褐煤和秸稈單獨降解的甲烷產(chǎn)量之和還要多，說明褐煤與水稻秸稈共降解促進(jìn)了二者的降解，導(dǎo)致了甲烷的增產(chǎn)[6]。

圖1 褐煤與水稻秸稈共降解和單獨降解的甲烷產(chǎn)量Fig.1 Methane production from co-degradation and separate degradation of lignite and rice straw

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

褐煤與水稻秸桿共降解、褐煤單獨降解、水稻秸桿單獨降解后降解液中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖2所示。由圖2可知，降解液中細(xì)菌群落隨底物不同而差異顯著，說明底物對降解液中微生物群落結(jié)構(gòu)起著決定作用。在共降解液中相對豐度最大的細(xì)菌群落為梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)和長桿菌科(Prolixibacteraceae)，相對豐度分別為45.76%和22.07%。褐煤單獨降解的降解液中相對豐度最大的細(xì)菌為Prolixibacteraceae，其相對豐度為27.91%，其次為沉積桿菌屬(Sedimentibacter)，其相對豐度為19.96%，Clostridium的相對豐度為3.89%。秸稈單獨降解的降解液中優(yōu)勢細(xì)菌群落分別為Prolixibacteraceae和Clostridium，相對豐度分別為21.92%和18.51%。Prolixibacteraceae在三種降解液中相對豐度差別不大，它是厭氧消化產(chǎn)甲烷過程中常見發(fā)酵微生物，可將多糖等物質(zhì)降解成乙酸[17]。而Clostridium的相對豐度變化顯著，在共降解液中其相對豐度明顯增大。Clostridium能夠分泌纖維素酶降解纖維素[18]，也可以直接參與纖維素降解[19]。此外，共降解液中還檢測到多種纖維素降解菌，如副梭菌屬(Paraclostridium)[20]。Paraclostridium在共降解液中的相對豐度比在褐煤單獨降解的降解液和水稻秸稈單獨降解的降解液中的相對豐度均增加了兩倍多。因此，褐煤與水稻秸稈共降解使細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，尤其是提高了Clostridium和Paraclostridium等纖維素降解菌的相對豐度，從而促進(jìn)秸稈中纖維素和煤中纖維素衍生物的降解，增大甲烷產(chǎn)量。

圖2 褐煤與水稻秸稈共降解和單獨降解后降解液中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure of degradation solution after co-degradation and separate degradation of lignite and rice straw

2.2.2 古菌群落結(jié)構(gòu)分析

褐煤與水稻秸桿共降解、褐煤單獨降解、水稻秸桿單獨降解后降解液中古菌的群落組成如圖3所示。由圖3可知，甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)為主要的產(chǎn)甲烷菌，在褐煤和水稻秸稈單獨降解的降解液和共降解的降解液中都為相對豐度最大的古菌。這是由于Methanosarcina能夠利用多種底物來生成甲烷，而且對厭氧環(huán)境具有很好的耐受性[21]。此外，共降解液中還檢測到氨氧化古菌。氨氧化古菌在氮循環(huán)過程中起著重要的作用[22]，而良好的氮循環(huán)有利于微生物生長[23]。因此，褐煤與水稻秸稈共降解可以維持厭氧產(chǎn)甲烷環(huán)境，保證其中的微生物活性，有利于其作用產(chǎn)甲烷。

圖3 褐煤與水稻秸稈共降解和單獨降解后降解液中古菌的群落組成Fig.3 Archaeal community structure of degradation solution after co-degradation and separate degradation of lignite and rice straw

2.3 有機物分析結(jié)果

褐煤與水稻秸桿共降解、褐煤單獨降解、水稻秸桿單獨降解后降解液中有機物組成情況如圖4所示。由圖4可知，降解液中有機物主要分為酸類、醇類、酯類、酚類、酮類、烴類及其他，酸類、醇類和酯類的相對豐度在73.57%以上。在褐煤和水稻秸桿共降解液中，酸類是最為豐富的有機物，相對豐度為44.86%。而在褐煤單獨降解和秸稈單獨降解的降解液中酸類的相對豐度分別為8.02%和31.12%?？梢钥闯?，共降解液中有機酸含量最多。這與共降解中Clostridium和Paraclostridium等纖維素降解菌相對豐度的增大有關(guān)。秸稈中更多纖維素被降解產(chǎn)生有機酸。已有研究表明，有機酸是厭氧降解產(chǎn)甲烷的底物，可以被產(chǎn)甲烷菌降解生成甲烷[24-25]。此外，有機酸會對煤結(jié)構(gòu)造成一定影響。乙酸會影響煤中官能團(tuán)且乙酸相對豐度不同對煤中官能團(tuán)的影響不同[26-27]。經(jīng)過有機酸預(yù)處理后的煤孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[28-30]。因此，褐煤與水稻秸稈共降解中，更多的有機酸不僅增加了產(chǎn)甲烷底物，而且有機酸作用于煤結(jié)構(gòu)，使煤更易于微生物利用，促進(jìn)了甲烷增產(chǎn)。

圖4 褐煤與水稻秸稈共降解和單獨降解后降解液中有機物組成Fig.4 Composition of organic matter of degradation solution after co-degradation and separate degradation of lignite and rice straw

2.4 XRD分析結(jié)果

褐煤與水稻秸桿共降解和水稻秸桿單獨降解前后水稻秸稈的XRD譜如圖5所示。由圖5可知，降解后水稻秸稈與原秸稈的XRD譜均在2θ為16°和22°出現(xiàn)了典型的纖維素Ⅰ型的特征峰[31]，說明其晶型結(jié)構(gòu)相同，降解沒有影響秸稈的纖維素類型。

圖5 褐煤與水稻秸桿共降解和水稻秸桿單獨降解前后水稻秸稈的XRD譜Fig.5 XRD spectra of rice straw before and after co-degradation of lignite and rice straw and separate degradation of rice straw

纖維素具有結(jié)晶區(qū)(定形區(qū))和非結(jié)晶區(qū)(無定形區(qū))兩種，纖維素結(jié)晶度是指結(jié)晶區(qū)占纖維素整體的百分率，是纖維素材料被水解的關(guān)鍵影響因素[32]。通過公式(1)計算的CrI值揭示了水稻秸稈中纖維素結(jié)晶度的變化。原秸稈的CrI值為37.63%，單獨降解后和共降解后秸稈的CrI值分別為36.03%和35.50%。秸稈單獨降解和共降解產(chǎn)甲烷后，其CrI值較原秸稈的CrI值分別下降1.6%和2.13%，纖維素結(jié)晶區(qū)均受到影響。共降解結(jié)束后水稻秸桿的CrI值下降更多，說明共降解過程中水稻秸稈中結(jié)晶區(qū)纖維素受作用程度加深，這與共降解液中纖維素降解菌相對豐度增大有關(guān)。因此，褐煤與水稻秸稈共降解影響秸稈結(jié)構(gòu)，共降解使秸稈中纖維素結(jié)晶度下降更多，秸稈更容易被水解用于產(chǎn)生甲烷。

2.5 13C-NMR分析結(jié)果

褐煤與水稻秸桿共降解和褐煤單獨降解前后褐煤的碳骨架結(jié)構(gòu)參數(shù)如表2所示。由表2可知，芳碳在褐煤中占據(jù)絕對優(yōu)勢，原褐煤的芳碳率為62.85%，單獨降解后褐煤的芳碳率為62.25%，共降解后褐煤的芳碳率為61.37%。

相關(guān)研究表明，煤中大分子聚合物結(jié)構(gòu)是芳香碳結(jié)構(gòu)單元之間通過脂肪族和醚鍵連接形成[33]。芳香類化合物是煤分子的主要組成成分。與原褐煤相比，單獨降解后褐煤與共降解后褐煤的芳碳率分別下降0.6%和1.48%，共降解后褐煤的芳碳率下降更多。在產(chǎn)甲烷的過程中，微生物能利用煤中的芳香族化合物產(chǎn)生甲烷。共降解中有機酸的積累會影響褐煤結(jié)構(gòu)，易于微生物與煤接觸，促進(jìn)煤的降解[34]。因此，褐煤與水稻秸稈共降解促進(jìn)了煤中的芳碳降解，提高了煤的降解程度，增大了甲烷產(chǎn)量。

表2 褐煤的碳骨架結(jié)構(gòu)參數(shù)(%)Table 2 Carbon framework parameters of lignite(%)

3 結(jié) 論

1) 褐煤與水稻秸稈共降解可以提高生物甲烷產(chǎn)量，最大甲烷產(chǎn)量可達(dá)到388.47 μmol，比褐煤單獨降解和秸稈單獨降解的甲烷產(chǎn)量之和增長了116.53%。

2) 褐煤與水稻秸稈共降解使降解液中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，Clostridium和Paraclostridium等纖維素降解菌的相對豐度明顯變大，同時，共降解促進(jìn)秸稈中纖維素和煤中纖維素類衍生物的降解，增大甲烷產(chǎn)量。

3) 褐煤與水稻秸稈共降解體系中有機酸含量大幅提高，一方面可以提供充足的產(chǎn)甲烷底物，另一方面對煤中官能團(tuán)和孔隙結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，有利于甲烷產(chǎn)生。

4) 相較于兩者單獨降解，褐煤與水稻秸稈共降解體系中菌群結(jié)構(gòu)得到改善，提高了降解過程中有機酸含量，影響煤與秸稈的結(jié)構(gòu)，共降解體系中水稻秸稈的CrI值和褐煤的芳碳率下降更多，使二者更容易被微生物利用，促進(jìn)秸稈中纖維素和煤中芳香化合物降解，達(dá)到生物甲烷增產(chǎn)的效果。